Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza komplementarności funkcjonalnej (FCA): ćwiczenie laboratoryjne zaprojektowane i wdrożone w celu uzupełnienia nauczania szlaków biochemicznych

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53850

⸱

24 czerwca 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Walidacja aktywności enzymatycznych związanych ze szlakami biochemicznymi może być wyjaśniona za pomocą analizy komplementacji funkcjonalnej (FCA). W tym manuskrypcie opisano test FCA wykazujący aktywność enzymatyczną enzymów biorących udział w metabolizmie aminokwasów, rygorystycznej odpowiedzi bakterii i biosyntezie peptydoglikanu bakteryjnego.

Streszczenie

Test funkcjonalnej komplementacji (FCA) to test in vivo, który jest szeroko stosowany do wyjaśnienia funkcji/roli genów/enzymów. Ta technika jest bardzo powszechna w biochemii, genetyce i wielu innych dyscyplinach. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono obszerny przegląd techniki uzupełniającej nauczanie szlaków biochemicznych odnoszących się do aminokwasów, peptydoglikanu i rygorystycznej odpowiedzi bakteryjnej. Zwrócono uwagę na dwa cDNA z modelowego organizmu roślinnego Arabidopsis thaliana, które biorą udział w metabolizmie lizyny (aminotransferazy L,L-diaminotransferazy L-diaminofilianu (dapL) i aminotransferazy tyrozynowej (tyrB) biorących udział w metabolizmie tyrozyny i fenyloalaniny. Ponadto szlak anaboliczny bakteryjnego peptydoglikanu został podkreślony poprzez analizę genu ligazy UDP-N-acetylmuramoilo-L-alanylo-D-glutaminianu-mezo-2,6-diaminopianu (murE) z bakterii Verrucomicrobium spinosum zaangażowanej w sieciowanie peptydoglikanu. Rygorystyczna odpowiedź bakteryjna jest również raportowana poprzez analizę dwufunkcyjnego genu rsh (relA/spoT homolog) odpowiedzialnego za fenotyp hiperśluzówkowy u bakterii Novosphingobium sp. Przedstawiono cztery przykłady FCA. Film skupi się na trzech z nich, a mianowicie lizynie, peptydoglikanie i rygorystycznej reakcji.

Wprowadzenie

Funkcjonalne uzupełnienie w kontekście wyjaśnienia funkcji/ról genu definiuje się jako zdolność określonego genu homologicznego lub ortologicznego do przywrócenia konkretnego mutanta o obserwowalnym fenotypie do stanu dzikiego, gdy gen homologiczny lub ortologiczny zostanie wprowadzony w cis lub trans w zmutowane tło. Technika ta jest szeroko stosowana do izolowania i identyfikowania funkcji / ról wielu genów. Jednym ze szczególnych przykładów jest izolacja i identyfikacja dekarboksylazy orotydyno-5-fosforanowej z Candida albicans przy użyciu mutanta ura3 S. cerevisiae i mutanta pyrF E. coli. 1 Autorzy wykorzystali tę technikę do wyjaśnienia funkcji genów, które są zaangażowane w metabolizm aminokwasów, peptydoglikanu i rygorystycznej odpowiedzi w swoich programach badawczych i włączyli tę technikę do swoich programów nauczania w programie Biotechnologii i Biologii Molekularnej (BMB) w Rochester Institute of Technology (RIT).

Autorzy uczą Podstaw Biochemii/Patologii Roślin (FPBP) (Hudson) i Bioseparacji: Zasad i Praktyk (BPP) (Hudson/Savka), dwóch wyższych klas fakultatywnych kursów laboratoryjnych w Programie BMB w RIT. Ponieważ niektóre z tematów omawianych na kursach są związane z ich zainteresowaniami badawczymi, autorzy włączyli wiele technik i narzędzi eksperymentalnych, które są używane w ich odpowiednich programach badawczych, do tych dwóch kursów laboratoryjnych. Jednym z takich przykładów jest uzupełnienie funkcjonalne jako ćwiczenie laboratoryjne mające na celu wzmocnienie materiałów wykładowych dotyczących metabolizmu aminokwasów z roślin, peptydoglikanu i rygorystycznego metabolizmu odpowiedzi bakterii.

Trzy ze szlaków aminokwasowych z roślin, które są omawiane w kursie FPBB, to lizyna (lys), tyrozyna (tyr) i fenyloalanina (phe). Szlak lys został podkreślony w kursie ze względu na znaczenie aminokwasu jako aminokwasu egzogennego dla wszystkich zwierząt, zwłaszcza ludzi, ponieważ zwierzęta nie mają genetycznej maszynerii do syntezy lys de novo. Ponadto niedawno odkryto, że rośliny wykorzystują szlak syntezy lizy, który znacznie różni się od szlaku bakterii. Odkrycie to było częściowo ułatwione dzięki funkcjonalnej komplementacji mutantów diaminopimelanu E. coli (dap) przy użyciu genu kodującego enzym aminotransferazę L,L-diaminofilianu (DapL) z modelowej rośliny Arabidopsis thaliana. 2 Wariantowe szlaki syntezy lys przez pośredni diaminopianat przedstawiono na rycinie 1. Ponadto synteza lizy jest ułatwiona dzięki rodzinie aminokwasów pochodzących z asparaginianu, która jest wysoce regulowana. 3 Oprócz ich znaczenia w syntezie białek, podkreślono szlaki Tyr i PHE, biorąc pod uwagę ich znaczenie w pełnieniu funkcji związków prekursorowych dla anabolizmu związków fenylopropanoidowych, które obejmują syntezę związków obronnych roślin, takich jak: alkaloidy, ligniny, flawonoidy, izoflawonoidy, kwas hydroksycynamonowy i inne. 4 Szlaki tyr i phe są również podkreślone, aby pokazać różnicę między roślinnymi i bakteryjnymi szlakami anabolicznymi. U bakterii enzym aminotransferaza tyrozynowa (TyrB) bierze udział w anabolizmie obu aminokwasów, podczas gdy u roślin enzym ten bierze przede wszystkim udział w katabolizmie Tyr i PHE i nie bierze udziału w anabolizmie tych aminokwasów. (Rysunek 2). 4

Różnice między bakteriami Gram-dodatnimi i Gram-ujemnymi dotyczące struktury peptydoglikanu (PG) są podkreślone w kursie FPBP. PG bakterii Gram-ujemnych jest interesujący w odniesieniu do patologii roślin ze względu na fakt, że większość patogenów roślinnych jest Gram-ujemna. Niedawny przegląd dotyczący 10 najlepszych fitopatogenów bakteryjnych wykazał, że wszystkie są Gram-ujemne. Bakterie należały do rodzajów: Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya i Pectobacterium. 5 Jedną z różnic chemicznych przy porównywaniu łodygi PG bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich jest różnica między sieciującymi aminokwasami obu typów. Początkowy etap tego odmiennego sieciowania PG zachodzi w cytoplazmatycznym etapie anabolizmu PG i jest ułatwiony przez enzym ligazy UDP-N-acetylmuramoilo-L-alanylo-D-glutaminiano-mezo-2,6-diaminopirolanu (MurE) (Figura 3A). MurE katalizuje dodanie określonego związku diaminy w trzeciej pozycji trzonu peptydu. 6 W większości bakterii Gram-ujemnych, przedostatnim prekursorem lizy, mezo-diaminopimelan (m-DAP) służy jako aminokwas sieciujący, a liza pełni tę samą rolę w PG większości bakterii Gram-dodatnich (figura 3B). 7 Wynika to z faktu, że zarówno m-DAP, jak i lys posiadają dwie grupy aminowe i są zdolne do tworzenia dwóch wiązań peptydowych w celu sieciowania łodyg peptydów.

W kursie Bioseparacje: Zasady i Praktyki (BPP) omawiane są różnice między otwartymi i zamkniętymi systemami do hodowli bakterii oraz jak znacząco zmienią się poziomy składników odżywczych w obu systemach z powodu zmian środowiskowych. Zdarzenia te są związane ze zmianami regulacyjnymi zwanymi "przesunięciem w dół" lub "przesunięciem w górę" wywołanymi głodem lub odpowiednim zaopatrzeniem w aminokwasy lub energię. Reakcja "przesunięcia w dół" może wystąpić, gdy kultura bakteryjna jest przenoszona z bogatej i złożonej pożywki do chemicznie zdefiniowanej pożywki z jednym źródłem węgla. Ta zmiana środowiska prowadzi do szybkiego zaprzestania syntezy tRNA i rRNA. To zaprzestanie powoduje brak rybosomów, syntezy białek i DNA, mimo że biosynteza aminokwasów jest regulowana w górę.

Po reakcji "przesunięcie w dół", istniejące rybosomy są wykorzystywane do produkcji nowych enzymów do syntezy aminokwasów, które nie są już dostępne w pożywce lub środowisku. Po pewnym czasie dochodzi do syntezy rRNA i nowych rybosomów, a populacja komórek bakteryjnych zaczyna rosnąć, choć w zmniejszonym tempie. Przebieg wydarzeń jest określany jako "rygorystyczna reakcja" lub "ścisła kontrola" i jest przykładem globalnej regulacji komórkowej i może być traktowany jako mechanizm dostosowywania biosyntetycznej maszynerii komórki w celu skompensowania dostępności wymaganych substratów i potrzeb energetycznych. 8 Rygorystyczna reakcja umożliwia zatem bakteriom szybkie reagowanie na przepływy składników odżywczych w środowisku oraz przyczynia się i zwiększa zdolność bakterii do konkurowania w środowiskach, które mogą się szybko zmieniać pod względem dostępności składników odżywczych i/lub substratów. 8-9

Rozdział

Rygorystyczna odpowiedź odgrywa integralną rolę w ekspresji genów, gdy dostępność aminokwasów, węgla, azotu, fosforanów i kwasów tłuszczowych jest ograniczona. 8,10-14 Ta rygorystyczna odpowiedź jest koordynowana przez dwa nukleotydy, tetrafosforan guanozyny (ppGpp) i pentafosforan guanozyny (pppGpp), powszechnie określane razem jako alarmon (p)ppGpp. Na przykład, gdy aminokwasy są ograniczone - co może prowadzić do wąskiego gardła w syntezie białek - alarmon, pirofosforan guanozyny 3,5-(bis) (ppGpp), pochodzący z anabolizmu guanozyno-3-difosforanu 5-trifosforanu (pppGpp) gromadzi się w komórce. Zmiana poziomu (p)ppGpp jest zaangażowana w ekspresję genów, które regulują odpowiedź na przezwyciężenie braku substratów w środowisku, które są bezpośrednio zaangażowane we wzrost i rozwój komórek. Dwa geny, które biorą udział w tym procesie, nazywane są relA i spoT. RelA to syntetaza związana z rybosomami (p)ppGpp, która bierze udział w odpowiedzi na nagromadzenie nienaładowanych tRNA, które jest wynikiem ograniczenia aminokwasów. SpoT funkcjonuje jako dwufunkcyjna syntetaza (p)ppGpp i hydrolaza. Aktywność syntetazy SpoT bierze udział w odpowiedzi na brak głodu węgla i kwasów tłuszczowych. 8 Homologi RelA/SpoT są szeroko rozpowszechnione w roślinach i bakteriach i są określane jako Rsh dla RelA/SpoT homologów. 8,10-12,16 Niedawny manuskrypt wykazał, że istnieje specyficzne białko Rsh zaangażowane w syntezę tych alarmonów z bakterii Novosphingobium sp Rr 2-17. 17

Tutaj prezentujemy cztery szlaki biochemiczne związane z testami funkcjonalnej komplementacji. Testy komplementarne przedstawione w tym manuskrypcie stanowią drogę do zbadania wykorzystania tego testu in vivo jako sposobu identyfikacji i/lub charakterystyki enzymów, co do których przewiduje się, że mają nieznane/domniemane funkcje, lub jako narzędzi dydaktycznych uzupełniających nauczanie szlaków biochemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Autorzy są skłonni dostarczyć szczepy bakteryjne i rekombinowane plazmidy, aby ułatwić włączenie analizy funkcjonalnej komplementacji do celów dydaktycznych dla osób zainteresowanych. Plazmidy, które zostały użyte w celu ułatwienia eksperymentów z dopełnieniem funkcjonalnym, są wymienione w Tabeli 1.

1. Budowa plazmidów dla funkcjonalnej komplementacji

  1. Klonowanie aminotransferazy diaminotransferowej diaminofilianu (dapL) w celu funkcjonalnej komplementacji.
    1. Amplifikować otwartą ramkę odczytu dapL (ORF) z V. spinosum i cDNA z A. thaliana i C. reinhardtii za pomocą PCR. Stosować 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty. Zawierać 12 pmoli każdego startera, 1 mM MgSO4, 0,5 mM każdy z 4 trifosforanów deoksynukleotydów oraz 0,5 ng matrycy DNA i 1 jednostkę polimerazy Pfx DNA.
      UWAGA: Pełny opis dotyczący rekombinowanego klonowania trzech ortologów dapL z rośliny A. thaliana (At-dapL), bakterii Verrucomicrobium spinosum (Vs-dapL) i algi Chlamydomonas reinhardtii (Cr-dapL) został wcześniej opublikowany. 2,18-20
      UWAGA: Startery używane do klonowania ortologów dapL są następujące:
      VsdapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3'
      VsdapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3'
      AtdapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3'
      AtdapL R-5'- GGGGGTCGACTTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3'
      CrdapL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGGGTCCACCGCCAGC-3'
      CrdapL R-5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3'
    2. Sklonuj fragmenty PCR do plazmidu pET30A, aby wytworzyć rekombinowane plazmidy, pET30A::VsdapL, pET30A::AtdapL i pET30A::CrdapL za pomocą starterów, enzymów restrykcyjnych i ligazy DNA T4.
      1. Krótko inkubować 50 ng insertu i 20 ng wektora w 1x buforze ligazy i 1 jednostce ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 17 °C. Przekształć ligację w komórki Dh5α E. coli i przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu kolonii na płytkach LB uzupełnionych 50 μg/ml-1 kanamycyną przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.18-20
    3. Aby stworzyć plazmid do funkcjonalnej komplementacji, trawić plazmidy pET30A::VsdapL i pET30A::AtdapL z enzymami restrykcyjnymi XbaI i SalI i XbaI oraz HindIII dla pET30A::CrdapL. Zliguj wstawki do plazmidu pBAD33 za pomocą ligazy DNA T4 do wytworzenia plazmidów pBAD33::VsdapL; pBAD33::AtdapL i pBAD33::CrdapL.
      1. Inkubować 50 ng insertu i 20 ng wektora w 1x buforze ligazy i 1 jednostce ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 17 °C. Przekształć ligację w komórki E. coli Dh5α i przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu kolonii na płytkach LB uzupełnionych kanamycyną 34 μg/ml−1 przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.20
  2. Klonowanie aminotransferazy tyrozynowej (tyrB) z A. thaliana w celu uzupełnienia funkcjonalnego.
    UWAGA: Pełne szczegóły dotyczące klonowania cDNA z A. thaliana oznaczone znacznikami locus At5g36160 zostały opisane wcześniej. 4
    1. Amplifikacja cDNA metodą PCR. Stosować 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty. Zawierać 12 pmoli każdego startera, 1 mM MgSO4, 0,5 mM każdy z czterech trifosforanów deoksynukleotydów oraz 0,5 ng matrycy DNA i 1 jednostkę polimerazy Pfx DNA.
      UWAGA: Startery używane do klonowania At5g36160 są następujące:
      AttyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGAAAACGGAGAAACGGAGCCAAGCGAT-3'
      AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3'
    2. Sklonować fragment do plazmidu pET30A w celu wytworzenia rekombinowanych plazmidów pET30A::At5g36160 poprzez trawienie fragmentu PCR z EcoR1 i Sal1; ligować fragment do pET30A przy użyciu ligazy DNA T4, jak opisano poniżej. 4
    3. Aby utworzyć plazmid funkcjonalnej komplementacji, należy strawić pET30A::At5g36160 z enzymami restrykcyjnymi XbaI i HindIII, a następnie podwiązać wstawkę do pBAD33 przy użyciu tych samych miejsc enzymów restrykcyjnych w celu wytworzenia rekombinowanego plazmidu pBAD33::At5g3160 przy użyciu ligazy DNA T4.
      1. Inkubować 50 ng insertu i 20 ng wektora w 1x buforze ligazy i 1 jednostce ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 17 °C. Przekształć ligację w komórki Dh5α E. coli i przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu kolonii na płytkach LB uzupełnionych 34 μg/ml-1 chloramfenikolem przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.4
  3. Klonowanie ligazy UDP-N-acetylmuramoilo-L-alanylo-D-glutaminiano-mezo-2,6-diaminopirolanu (murE) z V. spinosum w celu uzupełnienia funkcjonalnego.
    UWAGA: Klonowanie murE ORF z V. spinosum zostało opisane wcześniej. Rozdział 18
    1. Wzmocnij otwartą ramkę odczytu za pomocą PCR. Stosować 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty. Zawierać 12 pmoli każdego startera, 1 mM MgSO4, 0,5 mM każdy z czterech trifosforanów deoksynukleotydów, 0,5 ng matrycowego DNA i 1 jednostkę polimerazy Pfx DNA. Następnie sklonuj do plazmidu pET100D, aby wytworzyć plazmid pET100D::VsmurE.
      UWAGA: Startery używane do klonowania VsmurE są następujące:
      VsMurE F- 5'- CACCATGACCATTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3'
      VsMurE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3'
    2. Aby wytworzyć plazmid do funkcjonalnej komplementacji, trawić pET100D::VsmurE
      Z enzymami restrykcyjnymi XbaI i Sal1 i podwiązać wstawkę do pBAD33 w celu wytworzenia rekombinowanego plazmidu pBAD33::VsmurE przy użyciu ligazy DNA T4.
      1. Inkubować 50 ng insertu i 20 ng wektora w 1x buforze ligazy, wraz z 1 jednostką ligazy DNA T4, przez noc w temperaturze 17 °C. Przekształć ligację w komórki Dh5α E. coli i przeprowadzić badanie przesiewowe kolonii na płytkach LB uzupełnionych 34 μg/ml-1 chloramfenikolem przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.8
  4. Klonowanie relA/spoT (rsh) z Novosphingobium sp w celu uzupełnienia funkcjonalnego.
    UWAGA: Klonowanie rsh z Novosphingobium sp. został opisany wcześniej. 17
    1. Amplifikuj rsh ORF wraz z 599 nukleotydami przed miejscem rozpoczęcia inicjacji i 46 nukleotydami poniżej w miejscu zakończenia metodą PCR. Stosować 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 2 minuty. Zawierać 12 pmoli każdego startera, 1 mM MgSO4, 0,5 mM każdy z czterech trifosforanów deoksynukleotydów, 0,5 ng matrycowego DNA i 1 jednostkę polimerazy Taq DNA. Następnie sklonuj do plazmidu pCR2.1, aby wytworzyć pCR2.1::Nsprsh.
      1. Inkubować 1 μl amplifikowanego fragmentu PCR, 1 μl wektora pCR2.1, 1 μl roztworu soli i 1 μl wody. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut i 2 μl ligacji do komórek E. coli, a następnie przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu kolonii na płytkach LB uzupełnionych 50 μg/ml−1 kanamycyną przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 24 godziny
        UWAGA: Startery używane do klonowania rsh są następujące:
        rsh F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3'
        rsh R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3'
      2. W celu funkcjonalnej komplementacji należy przetrawić plazmid pCR2.1::Nsprsh za pomocą EcoR1 i podwiązać wstawkę do szerokiego zakresu gospodarza pRK290 w celu wytworzenia rekombinowanego plazmidu pRK290::Nsprsh przy użyciu ligazy DNA T4.
        1. Inkubować 50 ng insertu i 20 ng wektora w 1x buforze ligazy i 1 jednostce ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 17 °C. Przekształć ligację w komórki Dh5α E. coli i przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu kolonii na płytkach LB uzupełnionych 10 μg/ml−1 tetracykliną, inkubując w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.17

2. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek bakteryjnych w celu ułatwienia transformacji

UWAGA: Przygotowanie elektrokompetentnych komórek opiera się na protokole 26 dla 1,0 l hodowli, która może być zmniejszona do mniejszej objętości (tj. 250 ml). Należy pamiętać, że protokół ten może być wykorzystany do uczynienia wszystkich szczepów kompetentnych, które są opisane w tym manuskrypcie, aby ułatwić FCA. 22 Rozdział 22

  1. Zaszczepić 50 ml płynnej pożywki pojedynczą kolonią do kolby i hodować przez noc, upewniając się, że sprawdziłeś genotyp mutanta przed rozpoczęciem tego kroku (Tabela 2).
  2. W drugim dniu zaszczepić 1,0 l odpowiedniej pożywki (LB dla mutantów E. coli i PD dla Novosphingobium sp) za pomocą 50 ml kultury na noc i wyhodować do OD600 do 0,4-0,6 (faza logarytmiczna) w temperaturze 30 °C.
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 ml sterylnego, lodowatego czystegoH2O.
  4. Odwirować komórki przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 ml sterylnego, lodowatego 10% glicerolu.
  5. Odwirować komórki przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 2,0 ml 10% glicerolu.
  6. Podwielokrotnić komórki, przenosząc 50 μl do probówek do mikrowirówek i natychmiast zamrozić, umieszczając probówki w kąpieli z suchym lodem i etanolem. Przechowywać właściwe ogniwa w temperaturze -80 °C w celu elektroporacji.

3. Elektroporacja komórek bakteryjnych z plazmidami komplementacyjnymi

  1. Do elektroporacji dodać 1,0 μl (10-50 ng) rekombinowanego plazmidu do podwielokrotności (50 μl) kompetentnych komórek i umieścić na lodzie na 5 minut.
  2. Przenieś mieszaninę przez pipetowanie do kuwety elektroporacyjnej i ustaw aparat do elektroporacji na następujące ustawienie: pojemność 25 μF, rezystancja 2,5 kV i 200 omów i dostarcz impuls.
  3. Dodać 1,0 ml pożywki regeneracyjnej (LB) do kuwety do elektroporacji i przenieść za pomocą pipety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rekonwalescencja z delikatnym obracaniem przez 60 minut w inkubatorze z wytrząsaniem.
  4. Na płytki agarowe nanieść 100 μl kultury z etapu odzyskiwania w celu wybrania transformatorów poprzez pipetowanie i rozprowadzanie za pomocą sterylnego rozsiewacza.
    UWAGA: Upewnij się, że sprawdziłeś Tabelę 1 i Tabelę 2 przed rozpoczęciem tego kroku, aby sprawdzić antybiotyki i genotypy w celu wykonania odpowiednich płytek agarowych.

4. Transformacja AOH1 w celu ułatwienia funkcjonalnej komplementacji za pomocą aminotransferazy L,L-diaminopirolanu (dapL)

  1. W celu analizy komplementacji przekształć AOH1 z pustym wektorem (pBAD33) i wektorami ekspresji DapL w oddzielnych zdarzeniach transformacji przy użyciu protokołu elektroporacji opisanego w sekcji 3.0.
  2. Wybrać transformanty przez posiew na pożywce agarowej LB uzupełnionej 50 μg/ml−1 DAP i 34 μg/ml−1 chloramfenikolu i 50 μg/ml−1 kanamycyny.
  3. Przeprowadzić test na funkcjonalną komplementację przez posiewanie replik kolonii przez smugowanie na pożywce LB 0,2% (w/v) arabinozy z i bez 50 μg/ml−1 DAP i 34 μg/ml−1 kanamycyny.
  4. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 24 godziny i obserwować wyniki.
    UWAGA: Wynik powinien pokazać, że mutant jest w stanie rosnąć na pożywce wolnej od DAP tylko wtedy, gdy gen dapL ulega ekspresji w tle mutanta w porównaniu z kontrolą tylko wektora.

5. Transformacja TKL-11 w celu ułatwienia funkcjonalnej komplementacji za pomocą ligazy UDP-N-acetylomuramoylalanyl-D-glutamylo-2,6-mezo-diaminopirolanu (murE)

  1. Przekształć mutanta za pomocą pustego wektora (pBAD33) i wektora wyrażającego MurE (pBAD33::VsmurE) przy użyciu protokołu opisanego w sekcji 3.0.
  2. Płytkować i wybierać transformanty na podłożu agarowym LB uzupełnionym 50 μg/ml−1 tyminą i 34 μg/ml−1 chloramfenikolem i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.
  3. Przeprowadzić próbę komplementacji przez smugowanie lub posiewanie kolonii zarówno z przemian kontrolnych, jak i eksperymentalnych na dwóch pożywkach LB plus 0,2% (w/v) arabinozy i 50 μg/ml−1 tyminy.
  4. Inkubować jedną płytkę w temperaturze 30 °C, a drugą w temperaturze 42 °C przez 24 godziny, aby wizualnie ocenić fenotyp wzrostu.
    UWAGA: Wyniki powinny wykazać, że mutant jest w stanie rosnąć w temperaturze 42 °C tylko wtedy, gdy gen murE ulega ekspresji w zmutowanym tle, w porównaniu z kontrolą zawierającą tylko wektor.

6. Transformacja DL39 w celu ułatwienia funkcjonalnej komplementacji za pomocą aminotransferazy tyrozynowej (tyrB)

  1. Przekształć DL39 za pomocą pBAD33 lub pBAD33::At5g36160 i wybierz transformanty na płytkach agarowych LB uzupełnionych 50 μg/ml−1 tyrozyną, 50 μg/ml−1 fenyloalaniną i 34 μg/ml−1 chloramfenikolem, stosując protokół opisany w sekcji 3.0.
  2. Kolonie replik płytek na minimalnych (M9) podłożach z 50 μg/ml−1 fenyloalaniną i 50 μg/ml−1 tyrozyną, 50 μg/ml−1 asparaginianem, 50 μg/ml−1 leucyną, 50 μg/ml−1waliną, 50 μg/ml−1 izoleucyną, 10 μg/ml−1 Uracyl 0,5% (m/v) glicerol, 0,2% (w/v) arabinoza. Również repliki kolonii płytek na płytkach pozbawionych fenyloalaniny i tyrozyny poprzez smugowanie tej samej kolonii obu płytek.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godzin, aby obserwować fenotyp wzrostu.
    UWAGA: Wynik powinien pokazać, że mutant jest w stanie rosnąć tylko na pożywkach wolnych od fenyloalaniny i tyrozyny, tylko wtedy, gdy gen tyrB ulega ekspresji na tle mutanta w porównaniu z kontrolą zawierającą tylko wektor.

7. Transformacja Hx699 w celu ułatwienia funkcjonalnego uzupełnienia hipomukoidowego fenotypu Novosphingobium sp. Szczep Hx699

  1. Transform szczep typu dzikiego Novosphingobium sp. (Rr2-17) i zmutowany Hx699 z pRK290 i pRK290::rshNsp w 2 oddzielnych zdarzeniach transformacji przy użyciu protokołu transformacji opisanego w sekcji 3.0.
  2. Przemiany należy rozlać na agarze z dekstrozą ziemniaczaną (PD) uzupełnionym 10 μg/ml-1 tetracykliną i inkubować przez co najmniej 24 godziny lub do momentu pojawienia się transformantów.
  3. Smugować obie przemiany w kształcie litery "X" na świeżych płytkach agarowych PD i inkubować w temperaturze 30 °C przez co najmniej 4 dni. Obserwuj tylko fenotypy wektora i eksperymentuj, wizualnie badając fenotyp wzrostu obu płytek.
    UWAGA: Wynik powinien pokazać, że fenotyp hipośluzowaty jest uzupełniony, gdy rsh ulega ekspresji na tle mutanta w porównaniu z kontrolą tylko wektora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szczepy bakteryjne, które są wykorzystywane w różnych analizach komplementarności funkcjonalnej, są wymienione w Tabeli 2.

Analiza funkcjonalnej komplementacji: L,L-diaminotransferaza diaminopimelowa (dapL)

Podwójnie zmutowany AOH1 E. coli (ΔdapD::Kan2, dapE6) posiada mutację w genie dapE i całkowitą delecję genu dapD (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiele kursów, które są integralną częścią programu nauczania biotechnologii i biologii molekularnej w Rochester Institute of Technology, ma komponent laboratoryjny oprócz części wykładowej kursu. Program nauczania na rok akademicki 2014-2015 obejmuje łącznie 48 przedmiotów, z których 29 zawiera komponent laboratoryjny, co stanowi około 60%. Jednym z takich kursów są Podstawy Biochemii i Patologii Roślin (FPBP), mieszany kurs wykładowo-laboratoryjny oraz Bioseparacje: zasady i praktyki (BPP), kurs laboratoryjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

AOH i MAS dziękują College of Science i Thomas H. Gosnell School of Life Sciences w Rochester Institute of Technology za wsparcie. Praca ta została częściowo wsparta przez nagrodę Narodowej Fundacji Nauki Stanów Zjednoczonych (NSF) dla AOH MCB-1120541.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E. mutantyHudson/Savka lab lub CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Kuwety do elektroporacjiBiorad-USA1652082
Inkubator z kontrolowaną temperaturąOgólny Mikrowirówka
Ogólny
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BulionThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Dekstroza ziemniaczana MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycynaSigma-AldrichK1377
DiaminopimelanSigma-Aldrich92591
TyminaSigma-AldrichT0376
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
TyrozynaSigma-AldrichT3754
FenyloalaninaSigma-AldrichP2126
AsparaginianSigma-AldrichA9256
WalinaSigma-AldrichV0500
LeucynaSigma-AldrichL8000
IzoleucynaSigma-AldrichI2752
UracylSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinozaSigma-AldrichA3256
TetracylinaSigma-Aldrich87128
Polimeraza DNA TaqThermofisher Scientific10342-020
Platynowa polimeraza pfx DNAThermofisher Scientific11708-013
Ligaza DNA T4Thermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/wektor toposkopowyThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 Wektorwektorowy Thermofisher ScientificK2030-01

Bibliografia

  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
  3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
  4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572(2010).
  5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
  6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).
  7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
  8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
  9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
  10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
  11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
  12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
  13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
  14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
  15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
  16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
  17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
  18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183(2012).
  19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
  20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).
  21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
  24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
  25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
  26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
  27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
  28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
  29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
  30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
  31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
  32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
  33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza aktywności enzymuanaliza funkcji genutransformacja poprzez elektroporacjęselekcja mutantów bakteryjnychwarunki in vivometabolizm aminokwasówsynteza peptydoglikanuszlak odpowiedzi rygorystycznejArabidopsis Thaliana
Analiza komplementarności funkcjonalnej (FCA): ćwiczenie laboratoryjne zaprojektowane i wdrożone w celu uzupełnienia nauczania szlaków biochemicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.