Method Article

Analiza komplementarności funkcjonalnej (FCA): ćwiczenie laboratoryjne zaprojektowane i wdrożone w celu uzupełnienia nauczania szlaków biochemicznych

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja aktywności enzymatycznych związanych ze szlakami biochemicznymi może być wyjaśniona za pomocą analizy komplementacji funkcjonalnej (FCA). W tym manuskrypcie opisano test FCA wykazujący aktywność enzymatyczną enzymów biorących udział w metabolizmie aminokwasów, rygorystycznej odpowiedzi bakterii i biosyntezie peptydoglikanu bakteryjnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test funkcjonalnej komplementacji (FCA) to test in vivo, który jest szeroko stosowany do wyjaśnienia funkcji/roli genów/enzymów. Ta technika jest bardzo powszechna w biochemii, genetyce i wielu innych dyscyplinach. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono obszerny przegląd techniki uzupełniającej nauczanie szlaków biochemicznych odnoszących się do aminokwasów, peptydoglikanu i rygorystycznej odpowiedzi bakteryjnej. Zwrócono uwagę na dwa cDNA z modelowego organizmu roślinnego Arabidopsis thaliana, które biorą udział w metabolizmie lizyny (aminotransferazy L,L-diaminotransferazy L-diaminofilianu (dapL) i aminotransferazy tyrozynowej (tyrB) biorących udział w metabolizmie tyrozyny i fenyloalaniny. Ponadto szlak anaboliczny bakteryjnego peptydoglikanu został podkreślony poprzez analizę genu ligazy UDP-N-acetylmuramoilo-L-alanylo-D-glutaminianu-mezo-2,6-diaminopianu (murE) z bakterii Verrucomicrobium spinosum zaangażowanej w sieciowanie peptydoglikanu. Rygorystyczna odpowiedź bakteryjna jest również raportowana poprzez analizę dwufunkcyjnego genu rsh (relA/spoT homolog) odpowiedzialnego za fenotyp hiperśluzówkowy u bakterii Novosphingobium sp. Przedstawiono cztery przykłady FCA. Film skupi się na trzech z nich, a mianowicie lizynie, peptydoglikanie i rygorystycznej reakcji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalne uzupełnienie w kontekście wyjaśnienia funkcji/ról genu definiuje się jako zdolność określonego genu homologicznego lub ortologicznego do przywrócenia konkretnego mutanta o obserwowalnym fenotypie do stanu dzikiego, gdy gen homologiczny lub ortologiczny zostanie wprowadzony w cis lub trans w zmutowane tło. Technika ta jest szeroko stosowana do izolowania i identyfikowania funkcji / ról wielu genów. Jednym ze szczególnych przykładów jest izolacja i identyfikacja dekarboksylazy orotydyno-5-fosforanowej z Candida albicans przy użyciu mutanta ura3 S. cerevisiae i mutanta pyrF E. coli. 1 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Autorzy są skłonni dostarczyć szczepy bakteryjne i rekombinowane plazmidy, aby ułatwić włączenie analizy funkcjonalnej komplementacji do celów dydaktycznych dla osób zainteresowanych. Plazmidy, które zostały użyte w celu ułatwienia eksperymentów z dopełnieniem funkcjonalnym, są wymienione w Tabeli 1.

1. Budowa plazmidów dla funkcjonalnej komplementacji

  1. Klonowanie aminotransferazy diaminotransferowej diaminofilianu (dapL) w celu funkcjonalnej komplementacji.
    1. Amplifikować otwartą ramkę odczytu dapL (ORF) z V. spinosum i cDNA z A. thaliana i C. reinhardtii za p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepy bakteryjne, które są wykorzystywane w różnych analizach komplementarności funkcjonalnej, są wymienione w Tabeli 2.

Analiza funkcjonalnej komplementacji: L,L-diaminotransferaza diaminopimelowa (dapL)

Podwójnie zmutowany AOH1 E. coli (ΔdapD::Kan2, dapE6) posiada mutację w genie dapE i całkowitą delecję genu dapD (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele kursów, które są integralną częścią programu nauczania biotechnologii i biologii molekularnej w Rochester Institute of Technology, ma komponent laboratoryjny oprócz części wykładowej kursu. Program nauczania na rok akademicki 2014-2015 obejmuje łącznie 48 przedmiotów, z których 29 zawiera komponent laboratoryjny, co stanowi około 60%. Jednym z takich kursów są Podstawy Biochemii i Patologii Roślin (FPBP), mieszany kurs wykładowo-laboratoryjny oraz Bioseparacje: zasady i praktyki (BPP), kurs laboratoryjny.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOH i MAS dziękują College of Science i Thomas H. Gosnell School of Life Sciences w Rochester Institute of Technology za wsparcie. Praca ta została częściowo wsparta przez nagrodę Narodowej Fundacji Nauki Stanów Zjednoczonych (NSF) dla AOH MCB-1120541.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. mutantyHudson/Savka lab lub CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Kuwety do elektroporacjiBiorad-USA1652082
Inkubator z kontrolowaną temperaturąOgólny Mikrowirówka
Ogólny
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BulionThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Dekstroza ziemniaczana MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycynaSigma-AldrichK1377
DiaminopimelanSigma-Aldrich92591
TyminaSigma-AldrichT0376
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
TyrozynaSigma-AldrichT3754
FenyloalaninaSigma-AldrichP2126
AsparaginianSigma-AldrichA9256
WalinaSigma-AldrichV0500
LeucynaSigma-AldrichL8000
IzoleucynaSigma-AldrichI2752
UracylSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinozaSigma-AldrichA3256
TetracylinaSigma-Aldrich87128
Polimeraza DNA TaqThermofisher Scientific10342-020
Platynowa polimeraza pfx DNAThermofisher Scientific11708-013
Ligaza DNA T4Thermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/wektor toposkopowyThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 Wektorwektorowy Thermofisher ScientificK2030-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

Related Articles