Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Podsumowanie

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Streszczenie

Opisano nowatorską technikę preparacji i rejestracji do monitorowania odpalania aferentnego wywołanego mechanicznym przemieszczeniem włosów w małżowinie usznej myszy. Technika ta jest bardzo opłacalna i łatwa do wykonania przy użyciu materiałów powszechnie spotykanych w większości laboratoriów elektrofizjologicznych lub łatwych do zakupu. Preparacja jest prosta i szybka, a przemieszczenie mechaniczne zapewnia ogólna płytka elektroceramiczna kontrolowana przez zastrzeżone oprogramowanie. To samo oprogramowanie rejestruje i analizuje również wyniki elektroneurogramu. Rejestracja wywołanej aktywności nerwów odbywa się za pomocą komercyjnego wzmacniacza różnicowego podłączonego do polerowanych ogniowo standardowych mikroelektrod szklanych. Podano pomocne wskazówki dotyczące poprawy jakości preparatu, stymulacji i warunków nagrywania, aby zoptymalizować jakość nagrywania. System nadaje się do oznaczania właściwości elektrofizjologicznych i optycznych lancetowatych końcówek palisadowych zakończeń mieszków włosowych, a także wyników ich farmakologicznej i/lub genetycznej manipulacji. Podano przykład połączenia zapisu elektrycznego ze stymulacją mechaniczną i znakowaniem barwnikiem styrylowo-pirydynowym witalnym.

Wprowadzenie

Lancetowate zakończenia aksonów czuciowych unerwiające mieszki włosowe u ssaków tworzą palisady wokół nabłonka łodygi włosa. Ich celem jest wykrycie mechanicznego przemieszczenia otaczających je włosów. Są mieszanką szybko i wolno adaptujących się końcówek, które głównie wytwarzają krótkie impulsy aktywności w odpowiedzi na ruch włosów. Aktywność ustaje bardzo szybko, gdy ruch ustaje, nawet w przypadku ciągłego przemieszczenia. W tym miejscu opisano rozwój tego mysiego modelu małżowiny usznej do badań korelacyjnych struktury i funkcji w końcówkach lancetowatych. Małżowina uszna ma wiele korzystnych cech do badania tych zakończeń. Po pierwsze, małżowina uszna to zasadniczo dwie warstwy skóry ułożone tyłem do siebie, z niewielką ilością innej tkanki pomiędzy nimi, która zakłóca dostęp do mieszków włosowych i końcówek. Skóra jest bardzo cienka i łatwa do wypreparowania dzięki minimalnej ilości twardej tkanki łącznej. Unerwienie jest łatwo dostępne i możliwe do zidentyfikowania. Chociaż mieszki włosowe są obecne, są one stosunkowo słabo rozmieszczone, co ułatwia mechaniczną stymulację pojedynczych lub małych grup mieszków włosowych. Cienka warstwa skóry właściwej zapewnia dobry dostęp do zakończeń nerwowych za pomocą leków farmakologicznych i barwników. To sprawia, że są one szczególnie idealne do badań obrazowych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazowanie może odbywać się w żywych terminalach lub po fiksacji i dalszym przetwarzaniu histologicznym.

Reakcje neuronów mechanosensorycznych unerwiających mieszki włosowe były tradycyjnie badane u wibrysów gryzoni^1,2 oraz, w mniejszym stopniu, w izolowanych preparatach skórnych^3,4. Nauczyły nas one wiele o ogólnych zasadach fizjologii mechanosensorycznej w zakończeniach nerwowych otaczających łodygę włosa. Preparat wibrysalny pozwala na znakomitą kontrolę nad ruchem pojedynczego mieszka włosowego. Jednak rozszyfrowanie danych wyjściowych może być trudne ze względu na ich złożoność, ponieważ pęcherzyki wibrysalne zawierają co najmniej 8 różnych typów anatomicznie odrębnych zakończeń mechanosensorycznych⁵, a dopasowanie tych typów morfologicznych do określonych reakcji elektrofizjologicznych jest nadal kwestią sporną. Preparat na skórę myszy / nerw odpiszczelowy jest najczęściej stosowany w stanie depilacji do badania reakcji na dotyk i ból. Unerwienie mieszków włosowych w takim preparacie jest mniej złożone, ale gęstość mieszków włosowych oraz obecność trzech różnych typów mieszków włosowych (włosy ochronne, szydło/auchene i zygzakowate) w tak bliskiej odległości⁶, oznacza, że badanie specyficznych reakcji pojedynczego mieszka włosowego lub pojedynczego rodzaju zakończenia jest ponownie wyzwaniem. Co więcej, przygotowanie to obejmuje złożoną sekcję. Wreszcie, zarówno w przypadku preparatów wibrysalnych, jak i innych preparatów skórnych, trudno jest uwidocznić zaangażowane zakończenia, gdy preparaty ex vivo są jeszcze żywe. W związku z tym cięcie tkanek jest wymagane nawet w liniach myszy wykazujących ekspresję GFP. Alternatywnie wymaga dalszego przetwarzania histologicznego/immunologicznego, takiego jak utrwalenie i/lub inkubacja przeciwciał w celu immunofluorescencji.

Dlatego opracowaliśmy preparat małżowiny usznej i użyliśmy go do wykonania zapisów elektrycznych z ograniczonej populacji aferentów mieszków włosowych i wykazaliśmy, że w tych lancetowatych końcach zachodzi cykl błonowy, o czym świadczy pobieranie barwników styrylowo-pirydynowych. Na koniec wykazaliśmy, że barwnik nie zakłóca wrażliwości mechanicznej, co wskazuje, że nie blokuje kanałów mechanotransdukcji. Przedstawiono wyniki prostych protokołów stymulacji i analizy.

Protokół

Pobieranie tkanek pośmiertnych na myszach musi odbywać się przy użyciu zatwierdzonych metod etycznych. W Wielkiej Brytanii zwichnięcie szyjki macicy jest zatwierdzoną przez rząd metodą dla dorosłych myszy (metoda wymieniona w Wykazie 1 w brytyjskiej ustawie o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. i dyrektywie europejskiej 2010/63/UE). Przepisy te są egzekwowane lokalnie na Uniwersytecie w Aberdeen przez Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki, która dokonała przeglądu i zatwierdziła wszystkie procedury stosowane w poniższym protokole.

Uwaga: Te metody zostały użyte w badaniach opisanych w Banks et al.⁷

1. Przygotowanie uszu do elektrofizjologii

1. Przed sekcją przygotuj standardową sól fizjologiczną, taką jak sól fizjologiczna Lileya (1956) i nasyc ją 90% O₂/5% CO_{2 .} Sól fizjologiczna Lileya (mM) składa się z: NaHCO₃ (12), KCl (4), KH₂PO₄ (1), NaCl (138,8), MgCl₂ (1), CaCl₂ (2) i glukozy (11).
2. Humanitarna eutanazja dorosłej myszy bez uszkadzania czaszki w pobliżu uszu. Tutaj używamy myszy C57 / Bl6J i MF1, ale można użyć dowolnego standardowego szczepu myszy laboratoryjnej. Najlepiej użyć myszy o wadze <25 g, jeśli zapis elektryczny ma być połączony z etykietowaniem barwnikiem styrylowym, ponieważ etykietowanie u większych myszy jest mniej wiarygodne, często można je znaleźć tylko w ograniczonych obszarach.
3. Usuń głowę dużymi nożyczkami lub nożycami do kości.
4. Umieść głowę grzbietem do góry w zagazowanym Liley's w naczyniu preparacyjnym z szerokim dnem (zwykle wygodne jest 50 cm) na stoliku stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego. Regularnie (~10 min) śluzować lub zanurzać głowicę w zagazowanym roztworze soli.
5. Ostrożnie naciąć i oddzielić skórę u podstawy ucha zewnętrznego (małżowiny usznej) za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy #3, odsłaniając chrząstkę zewnętrznego przewodu słuchowego (EAM). Zidentyfikuj gałęzie nerwu trójdzielnego (podział żuchwy, MDV) i wielkich nerwów usznych, gdy wyłaniają się one z czaszki w szczelinie stawu żuchwowego i wystają przez podstawę chrząstki, aby unerwić odpowiednio wklęsłą (przednią) i wypukłą (tylną) stronę skóry małżowiny usznej.
6. W pobliżu czaszki zidentyfikuj, gdzie dwie gałęzie nerwowe wychodzą w rowku między szczęką a wyrostkiem sutkowatym. Zmaksymalizuj ich długość, delikatnie odciągając małżowinę uszną od czaszki i przeciąć nerwy jak najbliżej czaszki.
7. Usuń małżowinę uszną z głowy za pomocą nożyczek sprężynowych, uważając, aby uniknąć dystalnych kikutów podzielonych nerwów i minimalizując ilość gęstej sierści u podstawy ucha, która jest usuwana.
8. Przenieś małżowinę uszną do elastycznego naczynia wyłożonego gumą silikonową (PDMS) wypełnionego zagazowanym płynem Lileya. Otwórz EAM, dzieląc go w najwęższym (najbardziej przednim) punkcie. Spłaszcz małżowinę uszną, przednią stronę skóry (wklęsłą) do dołu i ostrożnie przypnij do PDMS na krawędziach za pomocą ~6-8 regularnie rozmieszczonych bardzo drobnych (~0,2 mm średnicy) szpilek przeciw owadom.
9. Całkowicie usuń skórę tylnej części małżowiny usznej i częściowo usuń chrząstkę małżowiny usznej przez rozwarstwienie kleszczami #3, upewniając się, że przednia skóra pozostaje nienaruszona.
10. Trzymając czubek cienkiej szpilki do owadów za pomocą kleszczy #3, delikatnie rozciągnij gałęzie (zwykle 2) MDV, które wyłaniają się z tyłu między skórą a chrząstkami EAM. Przypnij je do PDMS za pomocą najdelikatniejszych możliwych szpilek do owadów, przebijając tkankę łączną przylegającą do ich odciętych końców, a nie same pnie nerwowe.
11. Usuń większość otaczającej je tkanki łącznej, ostrożnie unikając uszkodzeń spowodowanych nadmiernym ciągnięciem lub cięciem.

2. Konfiguracja zapisu elektrofizjologicznego

1. Przypnij skórę małżowiny usznej do wyłożonej PDMS podstawy komory nagraniowej za pomocą drobnych szpilek owadów wokół krawędzi (~6-8 na ucho), umieszczając oczyszczone nerwy u podstawy ucha w pobliżu dwóch elektrod ssących – jednej do nagrywania (w celu pobrania nerwu), a drugiej elektrody obojętnej (w celu dostarczenia neutralnego sygnału do wzmacniacza różnicowego, patrz⁷).
2. W przypadku elektrody rejestrującej ostrożnie dopasuj aperturę i wewnętrzną średnicę otworu do łącznej grubości dwóch nerwów, tak aby pasowały jak najściślej i na jak największą długość.
3. Wciągnąć nerwy do elektrody poprzez delikatne odsysanie ze strzykawki o pojemności 2 ml przymocowanej do drugiego końca rurką z gumy silikonowej. Upewnij się, że nerwy są proste, nie są złożone ani podwojone.
4. Rozwijaj dopasowanie o wysokiej rezystancji elektrycznej/impedancji, używając silniejszego ssania do wciągania tkanki łącznej lub tkanki tłuszczowej, aby utworzyć zatyczkę, która szczelnie uszczelnia otwór wokół nerwu.
5. W razie potrzeby napełnij drugą (obojętną) elektrodę solą fizjologiczną przez odsysanie (może ona napełnić się przez działanie kapilarne).
6. Umieść identyczne przewody nagrywające (srebrne lub platynowe) w wewnętrznym otworze elektrod nagrywających, aby stykały się z solą fizjologiczną a nerwem (nagrywającym) lub zwężonym, wypolerowanym ogniowo końcem (obojętnym) elektrody. Każda elektroda jest lutowana indywidualnie do różnych rdzeni dwużyłowego ekranowanego. Umieścić elektrodę do kąpieli (uziemiającą) (osad Ag/AgCl) w kąpieli i uziemić ją do ekranu dwużyłowego podłączonego do elektrod rejestrujących.
7. Wprowadź aktywność elektryczną z dwóch elektrod do oddzielnych kanałów wzmacniacza różnicowego, filtruj (pasmo przepuszczane 0,2-2 kHz) i view na ekranie oscyloskopu. Sprawdź, czy poziomy szumów elektrycznych kanału A (nagrywanie) i kanału B (obojętny) wyglądają podobnie. Na tym etapie może nie być możliwe zobaczenie normalnych spontanicznych potencjałów czynnościowych w kanale A, zanim obie elektrody zostaną zrównoważone.
8. Wyrównaj wszelkie różnice w szumie tła między elektrodami poprzez zwiększenie impedancji elektrod nagrywających (kanał A) lub obojętnych (kanał B). W tym celu należy zassać otoczkę (tkankę łączną) otoczki (tłuszczu) głębiej do elektrody i/lub przyłożyć większą siłę ssącą do strzykawki o pojemności 50 ml.
   1. Po "zbalansowaniu" w ten sposób przełącz się z powrotem na zapis różnicowy (A-B) i poszukaj spontanicznych potencjałów czynnościowych (AP) w śladzie lub podczas głaskania włosów na brzegu małżowiny usznej. Jeśli nie obserwuje się żadnej aktywności (skoków), należy ponownie sprawdzić ścisłe dopasowanie nerwu w elektrodzie rejestrującej i otoczki łącznej w elektrodzie obojętnej – zwykle im ściślejsza (wyższa rezystancja) uszczelka i im bardziej równa impedancja w dwóch elektrodach, tym lepiej. Przy odrobinie wprawy pozwoli to osiągnąć dobrej jakości (>2:1) stosunek sygnału do szumu.
9. Rejestruj elektroneurogram za pomocą interfejsu laboratoryjnego i oprogramowania do elektrofizjologii działającego na komputerze. Wyjście audio impulsowe jest bardzo przydatne i można je osiągnąć, przepuszczając neurogram przez wzmacniacz audio i powiązany głośnik audio. Dostosuj próg tak, aby znajdował się tuż powyżej szumu linii bazowej (identyfikowanego przez brak "syczenia" białego szumu).
10. Aby zwiększyć dostęp leku lub fluorescencyjnego barwnika styrylowego do lancetowatych zakończeń, ostrożnie oderwij podskórną warstwę tłuszczową w pobliżu brzegu małżowiny usznej, otwierając okienko o wymiarach ~5 mm x 5 mm, odsłaniając skórę właściwą i podstawę mieszków włosowych (ryc. 1A, B).
11. Przypnij z powrotem fałd ~1 mm oczyszczonej z tkanki tłuszczowej skóry ucha na wiodącym brzegu (na poziomie właśnie wytworzonego okienka, jeśli ma to zastosowanie), pozostawiając wyraźną szczelinę wypełnioną solą fizjologiczną między przynależnymi warstwami skóry. Delikatnie pogłaszcz włoski wystające wzdłuż zagiętej krawędzi szpilką lub uziemionymi cienkimi kleszkami, nie dotykając skóry, aby zlokalizować obszar maksymalnego wyjścia AP na oscyloskopie oraz charakterystyczne "kliknięcia" i "trzaski" w wyjściu audio.

3. Rejestrowanie potencjałów czynnościowych wywołanych bodźcem

1. Sondę do stymulacji mechanicznej – polerowane ogniowo szkło z mikroelektrody borokrzemianowej o średnicy 10 cm przymocowane do ceramicznego siłownika piezoelektrycznego – należy ustawić tak, aby ruch był równoległy do fałdu skórnego. Umieść końcówkę około 0,5-1 mm od fałdu skórnego, tak aby dotykała włosów, ale nie skóry. Sprawdź skuteczność stymulacji, powoli przesuwając ręcznie końcówkę sondy, aby odchylić włoski i obserwować/słuchać wybijania.
2. Za pomocą oprogramowania można sterować mechaniczną stymulacją 1-3 włosów (np. 3 sekundy przy sinusoidach 5 Hz, co 10 sekund. Przemieszczenie sondy 200-500 μm) i rejestrować reakcje wywołane stymulacją w nerwach.
3. Podawaj kilka identycznych ciągów stymulacji mechanicznej w odstępach 10 sekund. Zoptymalizuj pozycję sondy pod kątem powtarzalności, a następnie zmniejsz częstotliwość stymulacji zgodnie z protokołem eksperymentalnym (np. częstotliwość powtarzania kropli z 10 sekund do 30 sekund).
4. Użyj oprogramowania do rozróżniania aktywności podobnej do AP, np. za pomocą prostego progu ustawionego na ~2x amplitudę szumów o wysokiej częstotliwości i ~25% największych AP.
5. Należy zaliczyć AP przekraczające próg jako "zdarzenia", określając ilościowo częstotliwość i charakterystykę wytwarzanych AP.

4. Nagrywanie Wywoływane bodźcem Wypalanie w połączeniu z N-(3-trietyloamoniopropylo)-4-(4-(dibutyloamino)styrylem) Etykietowanie dibromku pirydyny

1. Aby zbadać wpływ barwników styrylowych na wywołane bodźcem wypalanie aferentne i etykietowanie końcowe, dodaj odpowiednie stężenie wybranego barwnika styrylowego do roztworu do kąpieli i kontynuuj zapis elektryczny.
2. Po wymaganym czasie ekspozycji (zwykle co najmniej 30 minut) należy przygotować preparat do oglądania mieszków włosowych. Rozłóż płat skóry, usuwając kołki mocujące, i odsłoń oczyszczony obszar skóry, aby odsłonić etykietę końcową.
3. Zmyj zewnętrzny barwnik solą fizjologiczną bez barwnika, dokonując 3 całkowitych podmian soli fizjologicznej.
4. Inkubować w końcowej zmianie zagazowanej, bezbarwnej soli fizjologicznej przez 10-15 minut, aby umożliwić wypłukanie najbardziej uporczywych zanieczyszczeń barwnikiem z odsłoniętych/zewnętrznych membran.
5. Usunąć niezinternalizowany barwnik pozostający na błonach za pomocą środka sekwestrującego (sulfobutylowana beta-cyklodekstryna, 1 mM, 5 min) w soli fizjologicznej.
6. Przenieść komorę zapisu na stolik pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego i sprzęgnąć komorę z mechanizmem ruchu stolika/suwaka.
7. Oświetlić preparat światłem wzbudzającym odpowiednim dla barwnika styrylowego. Użyj obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego 10X lub 25X, aby obserwować znakowanie mieszków włosowych (ryc. 1).

Wyniki

Układ do rejestracji elektrofizjologicznej, z usuniętą podskórną tkanką tłuszczową w celu odsłonięcia mieszków włosowych, przedstawiono na Rycina 1AFragment tego odsłoniętego obszaru przedstawiono w większym powiększeniu w oświetleniu w polu jasnym w Rycina 1BZagięcie brzegu małżowiny usznej do góry i do tyłu w tym obszarze odsłania powierzchnię naskórka. Dzięki temu włosy znajdujące się na krawędzi zagięcia wystają poziomo, co stwarza idealne warunki do stymulacji mechanicznej za pomocą tępej sondy (nie pokazano). Rysunek 1C wykazuje, że po ekspozycji na barwnik i ponownym przywróceniu brzegu do pozycji rozłożonej, stymulowane mieszki w tym miejscu zostały oznakowane barwnikiem styrylo-pirydyniowym. Elektroneurogramy z preparatów zazwyczaj wykazują ciągłą aktywność potencjałów czynnościowych (AP) nawet w przypadku braku wymuszonego ruchu sondy z włókna szklanego, w tym potencjały czynnościowe o największej amplitudzie (Rysunek 2Ai-iii). Aktywność występuje z częstotliwością około 10–20 impulsów/s (ślad „spikes”), nie wykazując struktury ani oznak toniczności, ponieważ autokorelacja odstępów między okresami stymulacji jest niemal płaska. Podczas stymulacji 5 Hz, 100 µm mechaniczna stymulacja łodyg włosa sprawia, że całkowita liczba impulsów zazwyczaj wzrasta do 20–50 impulsów/s lub 4–10 na cykl sinusoidalny. Konstrukcja histogramów cykli wykazuje następnie silne dostrojenie (tzw. „blokadę fazową”) odpowiedzi (Rysunek 2Bi-iii)). Jest to proces wysoce powtarzalny, choć faza przebiegu fali, z którą zsynchronizowane są odpowiedzi, zależy od ich położenia, t. j. w którym punkcie ruchu wibrująca sonda styka się z włosem. Prosta detekcja progu (linia pozioma przecinająca ślady neurogramu w A(i-iiiDo niniejszej analizy wykorzystano )). Funkcjonalność oprogramowania rejestrującego można jednak często wykorzystać w bardziej zaawansowany sposób, aby rozróżnić cechy wielkości i kształtu potencjałów czynnościowych (spike'ów). Pozwala to na wyizolowanie odpowiedzi konkretnych włókien doprowadzających na podstawie tych charakterystyk, co umożliwia przeprowadzenie analizy pseudo-pojedynczych jednostek (pseudo-single-unit recording).

Rycina 1: Układ rejestracji elektrofizjologicznej i znakowanie lancetowatych zakończeń aferentnych mieszków włosowych za pomocą dibromku N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pirydynium. (A) Przygotowanie małżowiny usznej do eksperymentu elektrofizjologicznego, przedstawiające orientację małżowiny, położenie nerwów, elektrody rejestrujące oraz odsłonięty obszar unerwienia mieszków po usunięciu tkanki tłuszczowej. (B) W oświetleniu w polu jasnym widocznych jest kilka mieszków włosowych w obszarze oczyszczonym z nadkładającej tkanki tłuszczowej aż do skóry właściwej. Ciemne, zazwyczaj dwuklatkowe kształty to gruczoły łojowe. (C) Powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w B), pokazujący dwa zakończenia lancetowate znakowane barwnikiem styrylowym dibromkiem N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pirydynium, obrazowane za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej po stymulacji mechanicznej. Z⁷, za zgodą autora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 2: (A) Aktywność wywołana bodźcem zarejestrowana z małżowiny usznej myszy. (Ai-iii) Przykłady aktywności z ciągłych neurogramów z małżowin usznych w standardowym roztworze soli Lileya, pochodzące z 3 różnych eksperymentów. Każdy zapis przedstawia 5 s odcinek około 5 min po rozpoczęciu rejestracji, obejmujący 3 s okres sinusoidalnego przemieszczania niewielkiej liczby trzonów włosów. Stymulacja mechaniczna była powtarzana co 30 s przez cały czas ciągłego zapisu, który zazwyczaj trwał 1-2 h. Specjalne pliki skryptów oznaczały poszczególne zdarzenia przekraczające próg ustawiony przez kursor poziomy (impulsy), a także początek każdego cyklu sinusoidalnego (okres). (Aiv) Sygnał sterujący sinusoidalnym przemieszczeniem. (B) Analiza aktywności impulsowej wywołanej bodźcem. (Bi-iii) Histogramy cykli w przedziałach 3°, sporządzone odpowiednio z próbek neurogramów (Ai-iii), pokazujące odpowiedzi domniemanego zakończenia lancetowatego na stymulację mechaniczną poprzez sinusoidalne przemieszczenie trzonów włosów przez szklaną sondę z częstotliwością 5 Hz. Należy zwrócić uwagę na wyraźne blokowanie fazowe w różnych fazach cyklu, w zależności od ich położenia względem pozycji początkowej sondy mechanicznej. (Biv) Znormalizowana sinusoida przemieszczenia sondy; rzeczywista amplituda wynosiła około 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Tutaj opracowaliśmy stosunkowo prosty preparat, który można szybko wypreparować, ma niską gęstość mieszków włosowych i pozwala na stosunkowo selektywną stymulację mechaniczną niewielkiej liczby mieszków włosowych. Jest łatwo dostępny do zapisu elektrofizjologicznego i obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek, w tym reakcji na aplikację barwnika w celu wizualizacji mechanicznie stymulowanych mieszków włosowych, tj. obrazowania mieszków włosowych z określonymi odpowiedziami elektrofizjologicznymi. Chociaż tego nie zrobiliśmy, system ten wydaje się również łatwo podatny na podział nerwu czuciowego na rejestrację pojedynczej jednostki (pojedynczego aksonu czuciowego) i użycie ukierunkowanej ekspresji GFP do wizualizacji morfologii zakończenia czuciowego.

Wykorzystaliśmy preparat do skóry ucha do zbadania charakterystyki internalizacji i uwalniania barwników styrylowo-pridyniowych z membrany fluorescencyjnej⁷, techniki pierwotnie opracowanej do badania miejscowego recyklingu błony pęcherzykowej w zakończeniach synaptycznych⁸. W synapsach obrazowanie jest również łatwo łączone z jednoczesnym elektrofizjologicznym zapisem odpowiedzi w zidentyfikowanych końcach^8,9. To właśnie w tych wczesnych badaniach po raz pierwszy zauważyliśmy, że barwniki były również internalizowane przez zakończenia mechanosensoryczne¹⁰. W przypadku neuronów czuciowych w hodowli i komórkach rzęsatych ślimaka znaczna część znakowania przez barwniki styrylowo-pirydyniowe wydaje się obejmować barwniki przechodzące przez kanały mechanosensoryczne, które następnie blokują^11,12. Barwniki następnie znakują błony wewnątrzkomórkowe, a to znakowanie jest nieodwracalne. Jednak w komórkach rzęsatych, które nie są stymulowane mechanicznie^13,14 oraz w pełni zróżnicowanych pierwotnych zakończeniach nerwów czuciowych in situ, takich jak zakończenia Ia w wrzecionach mięśniowych¹⁵ i w zakończeniach lancetowatych^{tutaj 7}, znakowanie barwnikiem styrylowym wydaje się odzwierciedlać endocytozę błony, ponieważ znakowanie jest odwracalne i nie blokuje odpowiedzi mechanosensorycznych^7,15,16. Chociaż nie można całkowicie wykluczyć pewnej internalizacji barwnika przez przenikanie kanału w tych zakończeniach, z ciągłego wypalania podczas inkubacji barwnika i odwracalności znakowania jasno wynika, że zdecydowana większość znakowania w zróżnicowanych końcach in situ odbywa się przez internalizację z recyklingiem błony pęcherzykowej. W związku z tym ta prosta technika jest chętnie stosowana do połączonego elektrycznego i optycznego monitorowania szeregu końcowych funkcji mechanosensorycznych w tkankach ex vivo .

Podobnie jak w przypadku większości technik praktycznych, powtarzalność będzie wymagała powtórzeń i praktyki. Omówione zostaną teraz niektóre z kluczowych punktów, na które warto zwrócić szczególną uwagę. Przez cały czas trwania sekcji i rejestracji należy zmaksymalizować żywotność i przeżycie tkanek, upewniając się, że preparat jest stale napełniony solą fizjologiczną, w pełni nasyconą 95%_O2/5%_CO2. Upewnij się, że mieszki włosowe nie są przemieszczane podczas tego procesu, co będzie stymulować czuciowe wypalanie końcowe. Albo należy użyć systemu perfuzji z przepływem laminarnym, albo ostrożnie przepuścić gaz przez kąpiel narządową za pomocą cienkich rurki w pewnej odległości od preparatu, albo ostrożnie odświeżać roztwory co 20-30 minut, utrzymując preparat przez cały czas poniżej powierzchni soli fizjologicznej. Elektrody rejestrujące ssanie są wytwarzane przez modyfikację ostrych pipet borokrzemianowych z ostrymi elektrodami, zwykle używanych do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Najpierw ostrożnie odłam ostre końcówki kleszczami #3, aby uzyskać odpowiednią średnicę wewnętrzną, aby pasowała do nerwów i wypoleruj ogniem przez bardzo krótkie (<1 sek.) wystawienie na działanie płomienia palnika Bunsena (patrz 2.4 i 2.5). Aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu podczas nagrywania, ważne jest, aby impedancja elektryczna (rezystancja) w tych dwóch elektrodach była zarówno zmaksymalizowana, jak i równa. Zrób to, zwracając uwagę na następujące elementy w dwóch elektrodach. W przypadku elektrody rejestrującej upewnij się, że średnica wewnętrzna jest ściśle dopasowana do nerwu, a maksymalna długość nerwu jest wciągana do elektrody rejestrującej. Spróbuj użyć tkanki łącznej otaczającej nerw, aby skutecznie uszczelnić końcówkę elektrody. Alternatywnie lub dodatkowo narysuj wąski koniec odpowiednio zwężającego się kawałka tkanki tłuszczowej wzdłuż nerwu. Następnie zatkaj końcówkę elektrody, stosując silne ssanie przez ~1 minutę za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml dołączonej do rurki. W przypadku dobrze uszczelnionej końcówki zastosowanie silnego ssania po prostu wzmocni skuteczność korka i nie wciągnie więcej płynu ani nerwów. Aby jednak uniknąć uszkodzenia nerwów, upewnij się, że tkanka łączna amortyzuje nerw przed uciskiem na otaczający materiał i chrząstkę EAM. Obojętna elektroda powinna jak najwierniej naśladować rezystancję/impedancję elektrody nagrywającej. Pomaga w tym staranne polerowanie końcówki do jak najmniejszego otworu bez faktycznego jej uszczelniania. Jeśli potrzebny jest dalszy opór, należy zatkać koniec obojętnej elektrody tłuszczową tkanką łączną, jak opisano powyżej dla elektrody rejestrującej.

Elektroceramika zapewnia znakomitą kontrolę nad przemieszczeniami mechanicznymi, zarówno przestrzennymi, jak i czasowymi. Należy jednak uważać na wykonanie połączeń elektrycznych – wysoka temperatura je niszczy, dlatego nie należy używać gorącego lutu. Użyj kleju epoksydowego z metalem lub użyj specjalistycznego gniazda wtykowego zalecanego przez dostawcę. To zarówno mocno go utrzyma, jak i ustanowi łączność elektryczną. Przymocuj sondę stymulującą szkło do elektroceramiki za pomocą standardowej żywicy epoksydowej. Wypoleruj ogniowo końcówkę standardowej rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego o średnicy 10 cm x 1,5 mm, używanej do wykonywania łatek lub ostrych elektrod do zapisu elektrofizjologicznego, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia tkanek. Jeśli wymagana jest stymulacja pojedynczych mieszków włosowych, wypoleruj końcówkę, aby pasowała do pojedynczego włosa, i umieść sondę z pojedynczym włoskiem w otwartym otworze. Daje to znakomitą kontrolę nad pojedynczym włosem. W przypadku znakowania barwnikiem styrylowym jest on na ogół bardziej jednorodny w tkankach pochodzących od młodszych zwierząt. Nie jest do końca jasne, dlaczego, ale prawdopodobnie odzwierciedla to mniejszy uraz mechaniczny i skuteczniejsze usuwanie głębokich tkanek z młodszych tkanek. Dokładnie usuń spienioną warstwę przypominającą spieniony polistyren pokrywającą podstawy mieszków włosowych. Unikaj jednak bycia zbyt energicznym, ponieważ grozi to usunięciem warstwy splotu nerwowego i związanych z nią lancetowatych zakończeń. Jeśli reakcja elektryczna na ruch mieszków włosowych jest niewielka lub nie ma jej wcale, a zastosowanie barwnika styrylowego prowadzi do dominującego znakowania gruczołów łojowych (żółto/białego), z wyraźną autofluorescencją podstawy łodygi włosa, a nie lancetowatych końcówek (pomarańczowo-żółtych), zbyt entuzjastyczny klirens uszkodził leżące poniżej tkanki. Wreszcie, użycie środka chelatującego barwnik przed obrazowaniem znacznie poprawia kontrast obrazu i jakość ostatecznych obrazów.

Technika ta może być przydatna w wielu dalszych badaniach. Mogą one obejmować, na przykład, badania przesiewowe w kierunku kanałów mechanosensorycznych odpowiedzialnych za reakcje wywołane rozciąganiem, poprzez inkubację preparatu z farmakologicznymi ligandami selektywnymi dla kanałów kandydujących lub badania przesiewowe linii myszy z takimi kanałami genetycznie usuniętymi. To ostatnie można połączyć z oceną fluorescencyjną wszelkich zmian w morfologii terminala spowodowanych manipulacją genetyczną w liniach myszy, np. z ekspresją GFP sprzężoną z Npy2r¹⁷. Ostatnim przykładem może być badanie roli pęcherzyków synaptycznych (SLV)⁷ w tych lancetowatych zakończeniach poprzez badanie wpływu modulatorów obrotu SLV (Ca, Mg, latrotoksyna, ligandy receptora glutaminianu) na reakcje wywołane rozciąganiem i wychwytywanie/uwalnianie barwnika styrylowego. W ten sposób ta nowa technika otwiera szereg potencjalnie interesujących kierunków badań w neuronauce mechansensorycznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		Elastyczny, obojętny, półprzezroczysty stały polimer silikonowy.
Nr 3 Kleszcze Dumont	Fine Science Tools	11231-20
Austerlitz Szpilki do owadów	Fine Science Tools	26002-10	Bardzo cienkie szpilki do bezpiecznego mocowania preparatu małżowiny usznej do PDMS przy minimalnym uszkodzeniu.
Przedwzmacniacz różnicowy AC	Digitimer	Neurolog NL104A	Wzmacnianie wielkości przychodzącego elektroneurogramu aferentnego. Zapis różnicowy minimalizuje zewnętrzny szum elektryczny i dryft linii bazowej.
Filtr górno/dolnoprzepustowy	Digitimer	Neurolog NL125	Kondycjonowanie sygnału, poprzez redukcję zewnętrznego szumu elektrycznego w celu zapewnienia najlepszego stosunku sygnału do szumu.
Spike Trigger	Digitimer	Neurolog NL201	Ustawia próg detektora zdarzeń i wyświetla go na oscyloskopie. Pokazuje to skuteczność wykrywania potencjału czynnościowego.
Wzmacniacz audio i głośniki	Digitimer	Neurolog NL120S	Przydatne monitorowanie dźwięku pod kątem obecności elektrycznego odpalania końcówek sensorycznych podczas regulacji przygotowania stymulacji mechanicznej w dół mikroskopu
Oscyloskop	Digitimer	PM3380A	Używamy tego starego modelu, ale wystarczy dowolny standardowy oscyloskop.
Piezo electroceramic  wafel	Morgan Electroceramics, Southampton UK	PZT507	Elektrofizjologia/interfejs komputerowy
Elektroceramika piezoelektryczna  zasilacz	Domowe		wyjście 0-200 V DC do napędzania przemieszczenia płytki ceramicznej, ze zmiennym elektronicznym sterowaniem wyjściem za pomocą oprogramowania do nagrywania/stymulacji i interfejsu komputerowego. Korzystamy z oprogramowania Spike2 oraz interfejsu komputerowego 1401micro.
Oprogramowanie do elektrofizjologii	Cambridge Electronic Design (CED)	Spike2 v7	Oprogramowanie do rejestracji, stymulacji i analizy danych w elektrofizjologii
Interfejs laboratoryjny	Cambridge Electronic Design (CED)	1401 micro	Electrophysiology interface, między wzmacniaczem/filtrami a komputerem. Wprowadza elektroneurogram, a także napędza ruch elektroceramiczny.
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	Sonda z membraną fluorescencyjną, która odwracalnie dzieli się na zewnętrzną płatek błon komórkowych. Stosowany głównie do monitorowania endo-/egzocytozy błony pęcherzykowej.
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	sulfonowana pochodna b-cyklodekstryny, która chelatuje FM1-43 (i inne barwniki styrylowo-pirydynowe) z odsłoniętych błon, pozostawiając zinternalizowany barwnik wyraźniej widoczny poprzez obniżenie znakowania tła/fluorescencji.
Retiga Exi Fast 1394	Qimaging		Monochromatyczna, chłodzona kamera CCD - model podstawowy
Oprogramowanie do analizy obrazu 3D Volocity	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Oprogramowanie do przechwytywania i analizy obrazu.