Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53877

⸱

12 marca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Streszczenie

Danio rerio (Danio rerio) jest potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju kręgowców. Chociaż wiele aspektów rozwoju embrionalnego danio pręgowanego zostało opisanych na poziomie morfologicznym, niewiele wiadomo na temat molekularnych podstaw zmian komórkowych, które zachodzą wraz z rozwojem organizmu. Dzięki niedawnym postępom w dziedzinie mikrofluidyki i technologii multipleksowania, możliwe jest obecnie scharakteryzowanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Pozwala to na badanie niejednorodności między poszczególnymi komórkami określonych populacji komórek w celu identyfikacji i klasyfikacji podtypów komórek, scharakteryzowania stanów pośrednich zachodzących podczas różnicowania komórek oraz zbadania zróżnicowanych odpowiedzi komórkowych na bodźce. W badaniu tym opisano protokół izolacji żywotnych, pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego do wysokoprzepustowych testów multipleksowych. Metodę tę można szybko zastosować do dowolnego typu komórek embrionalnych danio pręgowanego z markerami fluorescencyjnymi. Rozszerzenie tej metody może być również stosowane w połączeniu z technologiami sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, aby w pełni scharakteryzować transkryptom pojedynczych komórek. Jako dowód zasady, oceniono względną obfitość markerów różnicowania serca w izolowanych, pojedynczych komórkach pochodzących z komórek progenitorowych serca nkx2,5 dodatnich. Oceniając ekspresję genów na poziomie pojedynczej komórki i w jednym punkcie czasowym, dane wspierają model, w którym komórki progenitorowe serca współistnieją z różnicującym się potomstwem. Opisana tutaj metoda i przepływ pracy mają szerokie zastosowanie w społeczności badawczej danio pręgowanego, wymagając jedynie oznakowanej linii do transgenicznych ryb i dostępu do technologii mikrofluidycznych.

Wprowadzenie

Większość obecnych badań nad biologią komórkową i molekularną opiera się na średnich populacjach. Jednak te tradycyjne analizy populacyjne mogą być maskowane przez ważne zdarzenia biologiczne, ponieważ mniejsze populacje mogą odgrywać główną rolę w procesach biologicznych i wynikach choroby. Zrozumienie ekspresji genów w heterogenicznych populacjach na poziomie pojedynczej komórki może prowadzić (i prowadziło) do odpowiednich spostrzeżeń biologicznych i klinicznych1,2. Niepokojące dla badań nad rozwojem embrionalnym jest to, że w większej populacji komórek komórki progenitorowe są często niedostatecznie reprezentowane, co utrudnia wykrycie subtelnych zmian w ekspresji genów, które ostatecznie inicjują decyzje dotyczące losu komórki3. Podobnie, pojedynczy typ komórki może mieć różne profile ekspresji w odpowiedzi na mikrośrodowisko4. Na przykład komórki śródbłonka rezydentne w tym samym narządzie lub w różnych narządach (np. aorcie lub nerce) wykazują znaczną niejednorodność, mimo że mają wspólne cechy morfologiczne i funkcjonalne5. Ponadto komórki rakowe zasiedlające ten sam guz mogą mieć różne profile molekularne lub mutacje na poziomie pojedynczej komórki6.

W systemach modelowych, transkryptomika w pojedynczych komórkach z powodzeniem zidentyfikowała nowe populacje komórek, scharakteryzowała stany pośrednie, które występują podczas różnicowania komórek, i ujawniła zróżnicowane reakcje komórkowe na bodźce7,8,9. Takie spostrzeżenia zostałyby zamaskowane w konwencjonalnych badaniach populacyjnych. Zarodki danio pręgowanego są niezwykle niewykorzystanym źródłem komórek macierzystych, progenitorowych i różnicujących się do badania kwestii heterogeniczności pojedynczych komórek i molekularnej regulacji tożsamości komórkowych podczas rozwoju. Ich wysoce stereotypowy rozwój ex vivo i łatwość manipulacji genetycznej sprawiają, że są one doskonałym systemem modelowym dla tego podejścia10,11. W szczególności głównym ograniczeniem w interpretacji danych dotyczących ekspresji genów w pojedynczej komórce jest to, że wiarygodna identyfikacja nowych pośrednich stanów komórkowych podczas rozwoju wymaga bardzo starannego czasu pobierania tkanek9. Jest to konieczne, aby zapewnić, że heterogeniczność między wychwyconymi komórkami reprezentuje heterogeniczność w tkance w jednym punkcie czasowym, a nie heterogeniczność ekspresji genów wynikającą z różnicowania komórek zależnego od wieku. W porównaniu z myszami, rozwój zarodka danio pręgowanego może być precyzyjnie zsynchronizowany w dużej liczbie zarodków12. Dodatkowo, dzięki dużym rozmiarom lęgu, zarodki danio pręgowanego mogą być wykorzystywane jako obfite źródło komórek macierzystych i progenitorowych.

Ten protokół opisuje metodę izolowania komórek z zarodków ryb danio pręgowanych i przechwytywania pojedynczych komórek za pomocą dostępnego na rynku zintegrowanego układu mikroprzepływowego (IFC) i systemu autoprep do analizy ekspresji genów qRT-PCR. Protokół ten można szybko przenieść do dowolnych testów multipleksowania o wysokiej przepustowości, w tym sekwencjonowania całego transkryptomu, które umożliwia bardziej kompleksową analizę heterogeniczności komórkowej13. Oferuje również kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami ekspresji genów. Protokół izolacji pojedynczych komórek zapewnia wysoką żywotność po FACS, co zmniejsza odsetek uszkodzonych komórek, które są włączane do dalszych zastosowań. Korzystając z IFC, przechwycone komórki mogą być bezpośrednio obserwowane w celu oceny wskaźników wychwytywania i morfologicznej oceny zdrowia komórek. Ponadto protokół ten ma szerokie zastosowanie w społeczności badawczej danio pręgowanego, wymagając jedynie oznakowanej transgenicznej linii do ryb i dostępu do technologii wychwytywania komórek mikroprzepływowych.

Jako dowód zasady, pojedyncze komórki pochodzące z komórek progenitorowych serca zostały wyizolowane i przechwycone na chipie IFC, a następnie względna obfitość markerów różnicowania serca została zmierzona za pomocą qRT-PCR. Analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki pokazuje, że komórki progenitorowe serca współistnieją ze swoim różnicującym się potomstwem. Wgląd uzyskany dzięki profilowaniu pojedynczych komórek progenitorów serca może rzucić światło na niejednorodność wzorców ekspresji genów wśród komórek progenitorowych serca podczas rozwoju kręgowców, która mogła zostać zamaskowana w tradycyjnych analizach populacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół wymaga użycia żywych, dorosłych ryb danio pręgowanych do produkcji embrionów. Zarodki są pobierane w celu pobrania tkanek. Konieczne jest uzyskanie zgody odpowiednich komisji etycznych do przeprowadzenia tego eksperymentu.

1. Uzyskanie zarodków w inscenizacji

  1. Dzień przed eksperymentem przygotuj zdrowego, dorosłego danio pręgowanego do hodowli. Umieść jednego samca i jedną samicę po przeciwnych stronach przezroczystej przegrody w zbiorniku hodowlanym.
  2. Powtórzyć czynności ppkt 1.1 dla tylu zbiorników hodowlanych, ile jest konieczne do produkcji zarodków w ilości wystarczającej do dalszego zastosowania. Uzyskaj zarodki zarówno od ryb typu dzikiego, jak i transgenicznych, które wyrażają białka fluorescencyjne w interesującym typie komórki.
    UWAGA: Liczba zarodków potrzebnych do dalszych zastosowań w krokach 2-8 zależy od względnej obfitości komórek będących przedmiotem zainteresowania w momencie zainteresowania. Chociaż może się to różnić w zależności od typu komórki, 200 zarodków wytwarza 2000-5000 posortowanych komórek, podczas gdy komórki będące przedmiotem zainteresowania stanowią <1,0% wszystkich komórek w temperaturze 24 hpf (godziny po zapłodnieniu).
  3. Następnego ranka zmień wodę w zbiorniku do panierowania, przenosząc ryby do świeżego zbiornika hodowlanego i wyjmij przegrodę. Przechyl zbiornik pod kątem, aby zachęcić do rozmnażania.
  4. Zbieraj zarodki w stadium.
    1. Co 15 minut zbieraj zarodki, przenosząc dorosłe osobniki do świeżego zbiornika hodowlanego i przepuszczając pozostawione jaja przez sitko do herbaty.
      UWAGA: Zarodki danio pręgowanego rozwijają się synchronicznie, gdy są utrzymywane w porównywalnych gęstościach i temperaturach.
    2. Opłucz jajka wodą jajeczną (0,21 g/l rozpuszczalnych soli oceanicznych w 1 l podwójnie destylowanej wody) i przenieś na szalkę Petriego. Przenieść szalkę Petriego do wilgotnego inkubatora o temperaturze 28,5 °C z cyrkulacją powietrza.
  5. Dwie godziny po ostatnim pobraniu posortuj zapłodnione, wielokomórkowe zarodki na 10-centymetrowe szalki Petriego i zmniejsz gęstość do 50 zarodków na szalkę. Wybierz zarodki z pojedynczego, 15-minutowego okna czasowego pobierania do dalszej aplikacji. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5°C.
    UWAGA: Na przykład zbierz zarodki o 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 i 10:15. Porównując różne punkty czasowe, jeśli największa liczba zapłodnionych zarodków pochodzi ze lęgów pobranych o godzinie 9:00, należy używać tylko tych zarodków do dalszych zastosowań.

2. Konfiguracja dysocjacji pojedynczej komórki

  1. Około 30 minut przed punktem zainteresowania (18 hpf) należy ręcznie usunąć zarodki z kosmówki za pomocą cienkich kleszczy.
  2. Zebrać i oznaczyć następujące elementy dla każdego stanu: dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, jedno sitko do komórek 40 μm, jedno naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i dwie probówki FACS zwieńczone sitkiem do komórek o średnicy 35 μm.
  3. Schłodź następujące odczynniki na lodzie: Woda jajeczna zawierająca 0,21 g/l rozpuszczalnych soli oceanicznych w 1 l podwójnie destylowanej wody; Bufor do usuwania żółtka zawierający 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl i 1,25 mM NaHCO3; oraz bufor FACS zawierający pożywkę L-15 firmy Leibovitz uzupełnioną 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą.
  4. Doprowadzić 1 ml na próbkę odczynnika do dysocjacji komórek 1 do RT. Rozmrozić 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek 2 na próbkę na lodzie. Doprowadzić do RT bezpośrednio przed użyciem.

3. Dysocjacja pojedynczej komórki

  1. Za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze przenieś 100-300 zarodków do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml w minimalnej objętości wody jajecznej.
  2. Eutanazja zarodków polega na zastąpieniu wody 1 ml lodowatej wody jajecznej i zanurzeniu probówki w lodzie na 20 minut
    ostrożność! Bardzo ważne jest uzyskanie zgody odpowiedniego instytucjonalnego komitetu nadzoru nad opieką nad zwierzętami dla tej metody eutanazji (schładzanie na lodzie, a następnie dysocjacja komórek jako eutanazja wtórna). Standardowa eutanazja zazwyczaj wymaga, aby zarodki <3 dni po zapłodnieniu zostały wybielone po schłodzeniu, co nie jest odpowiednie do uzyskania żywych komórek.
  3. Umyj zarodki dwa razy 1 ml lodowatej wody jajecznej. Do mycia użyj szklanej pipety o szerokim otworze, aby usunąć wodę z jaj i P1000, aby dodać wodę jajeczną
    4. .
  4. Usuń żółtko, zastępując wodę z zarodka 1 ml buforu do żółtkowania i rozcierając 8-12 razy końcówką P1000 lub do momentu, gdy żółtko się rozpuści i widoczne będą tylko ciała zarodków.
  5. Zebrać tkankę przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 1 minutę. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant bez naruszania osadu tkankowego. Zawiesić ponownie w 1 ml wody jajecznej.
  6. Powtórz krok 3.5, w sumie trzy prania, ale w ostatnim praniu ponownie zawiesić w 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek RT 1.
  7. Inkubować w odczynniku do dysocjacji komórek 1 przez 10 minut w temperaturze pokojowej z probówkami umieszczonymi poziomo. Co 2-3 minuty delikatnie rozcierać pipetą P1000, aby zapobiec zbrylaniu.
    UWAGA: Z próbkami należy obchodzić się delikatnie podczas etapów rozcierania. Czasami w probówce utworzy się pojedyncza, duża grudka z plątaniny ciał zarodków. To rozproszy się z dodatkowym trawieniem wspomaganym przez delikatne rozcieranie. NIE WIROWAĆ.
  8. Zebrać tkankę przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek 2.
  9. Inkubować przez 5-15 minut w temperaturze pokojowej. Ułóż probówki poziomo. Co 2-3 minuty delikatnie rozcierać, aby zapobiec zbrylaniu. Co 5 minut oceniaj postępy trawienia.
    1. Aby ocenić postęp trawienia, należy rozcieńczyć 2 μl supernatantu w 18 μl buforu FACS i pipetować jako kroplę na szalkę do hodowli komórkowych.
    2. Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce i obserwować pod mikroskopem kultur tkankowych przy 10- i 20-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: Preparat powinien wyglądać jak mieszanina pojedynczych komórek, małych skupisk, dużych skupisk i sporadycznie w większości nienaruszonych ciał zarodka.
    3. Oceń wizualnie proporcję preparatu, który składa się z pojedynczych komórek i małych klastrów.
      UWAGA: Nadmierne trawienie zmniejszy żywotność; Niedostateczne trawienie zmniejszy wydajność pojedynczych komórek.
  10. Zebrać preparat komórkowy przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml zimnego buforu FACS.
  11. Zwilż sitko komórkowe o wielkości 40 μm buforem FACS. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 40 μm na naczynie do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm. Umyj sitko komórkowe jednorazowo 1 ml buforu sortującego FACS.
  12. Przenieść przepływ do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 100 μl buforze FACS.
  13. Policz wydajność komórek za pomocą hemocytometru. Następnie rozcieńczyć próbki do 5x106 komórek na ml lub optymalnego stężenia zalecanego dla wybranej maszyny FACS. Opcjonalnie - Podczas liczenia wydajności komórek na hemocytometrze, martwe komórki należy wybarwić przeciw niebieskiemu trypanowi, aby potwierdzić żywotność przygotowania komórek przed sortowaniem FACS.
    UWAGA: Sortowanie preparatów, które są zbyt rozcieńczone, zajmie zbyt dużo czasu. Preparaty, które są zbyt skoncentrowane, mają tendencję do zbijania się w multimery i są nieoptymalne do sortowania czystej populacji.
  14. Zarezerwuj 10-20% każdej próbki do wykorzystania jako niebarwione kontrole. W przypadku pozostałych próbek należy wybarwić martwe komórki, dodając do każdej próbki fluorescencyjny barwnik dyskryminujący żywe/martwe (L/D). NIE prać.
    UWAGA: Każdy barwnik fluorescencyjny, który wnika do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi i barwi kwasy nukleinowe, może być stosowany jako barwnik L / D, pod warunkiem, że widma fluorescencji są kompatybilne z wybraną maszyną FACS i interesującymi komórkami znakującymi fluorofory.
    1. Nie należy myć preparatu po dodaniu barwnika, ponieważ niektóre komórki umrą w drodze do oczyszczania FACS i powinny zostać wykluczone z posortowanej populacji.
  15. Zwilżyć probówkę FACS z sitkiem o wielkości 35 μm buforem FACS o pojemności 20 μl. Dodaj komórki do sitka i zbierz grawitacyjnie. Przechowywać na lodzie.

4. Wzbogacenie FACS

  1. Użyj FACS, aby wzbogacić pojedyncze, żywe komórki wyrażające marker fluorescencyjny.
    1. Ustaw bramkę, aby odróżnić komórki od szczątków na wykresie punktowym amplitudy rozproszenia do przodu (FSC-A) i amplitudy rozproszenia bocznego (SSC-A), przy użyciu skalowania liniowego.
      ostrożność! Komórki danio pręgowanego są zazwyczaj mniejsze niż komórki myszy lub człowieka. Znajduje to odzwierciedlenie w mniejszej podstawowej separacji między komórkami a szczątkami.
    2. Z bramki ustawionej w 4.1.1 ustaw bramkę do wzbogacania dla pojedynczych komórek i wykluczania multimerów przy użyciu wykresu punktowego wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H) i niskiej wysokości rozproszenia bocznego (SSC-H), oba ze skalowaniem liniowym.
      UWAGA: Ogniwa o nieproporcjonalnie wysokim FSC-H i niskim SSC-H są prawdopodobnie multimerami i są wyłączone z sortowania.
    3. Z bramki ustawionej w 4.1.2, używając jednokolorowych kontrolek, ustaw bramkę tak, aby zawierała tylko żywe komórki, używając wykresu punktowego FSA-A ze skalowaniem liniowym i amplitudą kanału używanego do wykrywania plam L/D ze skalowaniem logarytmicznym. Uwzględnij ogniwa ujemne L / D.
    4. Z bramki ustawionej w 4.1.3, używając jednokolorowych kontrolek, ustaw bramkę tak, aby zawierała tylko żywe komórki z dodatnią fluorescencją, używając wykresu punktowego FSA-A ze skalowaniem liniowym i amplitudą kanału używanego do wykrywania fluorescencyjnego markera komórki białkowej ze skalowaniem logarytmicznym. Uwzględnij komórki dodatnie.
    5. W razie potrzeby należy ustawić wszelkie kontrolki kompensacji, aby uwzględnić interferencję między barwieniem L/D a widmami białek fluorescencyjnych.
  2. Ustaw logikę sortowania na komórki, które należą do wszystkich bramek ustawionych w kroku 4.1.
    1. Używając podwójnie oznaczonych komórek, sprawdź bramkowanie pod kątem sortowania komórek.
      UWAGA: Komórki do sortowania będą komórkami, a nie szczątkami, pojedynczymi komórkami, a nie multimerami, komórkami ujemnymi L / D i fluorescencyjnie dodatnimi.
  3. Sortuj 2 000-4 000 komórek z populacji będącej przedmiotem zainteresowania na 5 μl zimnego buforu FACS w probówce mikrowirówkowej na lodzie. Aby zminimalizować ścinanie i naprężanie komórek podczas sortowania, należy stosować najniższe możliwe ciśnienie w sortowniku komórek.
    UWAGA: Kropla 5 μl buforu FACS służy jako poduszka dla komórek opuszczających maszynę FACS. Zebranie 2 000-4 000 komórek bezpośrednio do bufora FACS eliminuje potrzebę wirowania przed załadowaniem na chipy IFC. Ta strategia jest zalecana, ponieważ wirowanie może prowadzić do tworzenia się multimerów, jeśli komórki przylegają do siebie w osadzie.
  4. Oceń analizę wykonalności po sortowaniu.
    1. Przenieś 1 μl posortowanych komórek do świeżej probówki FACS ze 100 μl buforem sortującym FACS i rozcieńczeniem 1:1,000 barwienia L/D. Przepuść komórki przez sorter FACS ze strategią bramkowania w kroku 4.1. Użyj proporcji L/D ujemnej do dodatniej, aby oszacować żywotność posortowanych komórek.

5. Załaduj komórki do układu mikroprzepływowego

  1. Za pomocą hemocytometru zmierz zarówno stężenie, jak i wielkość posortowanych komórek.
    1. Rozcieńczyć posortowane komórki do co najmniej 10 μl. Rozcieńczyć podwielokrotność 5 μl komórek 5 μl błękitu trypanowego. Załadować na hemocytometr i nałożyć szkiełko nakrywkowe.
    2. Zbierz obrazy w jasnym polu wszystkich komórek w siatkach 4 x 4 hemocytometru. Policz liczbę żywych komórek i oblicz żywe komórki/ml. Żywe komórki nie pobierają błękitu trypanowego.
      UWAGA: Użyj dowolnego standardowego oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć średnicę wszystkich żywych komórek. Oblicz średnią i odchylenie standardowe rozmiaru komórki, a następnie wybierz płytę IFC odpowiednią dla interesującego Cię zakresu wielkości komórki. Jeśli zakres rozmiarów komórek obejmuje zakres rozmiarów komórek płyty IFC, użyj wielu płyt, aby uchwycić pełny zakres interesujących komórek.
  2. Załaduj ogniwa na płytę IFC zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Materiały).
    1. Rozcieńczyć ogniwa do 1x106 komórek/ml i przeprowadzić optymalizację wyporu zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Optymalizacja wyporności zapewnia, że ogniwa nie opadają na dno ani nie unoszą się na górze studni załadowczej, co zapewnia optymalne obciążenie na chipie IFC. Stosunek bufora do komórek może się różnić w zależności od typu komórki, ale zwykle wynosi 6:4-7:3 komórek:bufor.
    2. Dodaj komórki do zagruntowanej płyty IFC. Załaduj płytkę do kompatybilnej maszyny fluidyki i uruchom skrypt ładowania komórki, aby przepchnąć komórki przez obwód mikrofluidyki do linii przechwytywania.
  3. Upewnij się, że komórki są umieszczone w miejscach przechwytywania na płycie IFC.
    1. Usuń płytę IFC z maszyny Fluidics. Zamontuj płytkę IFC na mikroskopie wyposażonym w adapter płytki.
    2. Zbieraj zdjęcia jasnego pola i fluorescencji dla każdego miejsca przechwytywania przy 10-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: Czas przechwytywania jasnego pola może wynosić od 10 do 50 ms, w zależności od intensywności lampy. Czas wychwytywania fluorescencji może wynosić od 250-750 ms, w zależności od jasności fluoroforu. Unikaj prześwietlania komórek, aby zapobiec fotouszkodzeniom.

6. Synteza cDNA

  1. Przeprowadzić lizę komórek in situ zgodnie z instrukcjami producenta płyty IFC.
    1. Dodaj do lizy do studzienek na płycie IFC. Załaduj płytkę do kompatybilnej maszyny fluidycznej i uruchom skrypt lizy komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wykonaj odwrotną transkrypcję zgodnie z instrukcjami producenta płyty IFC.
    1. Dodaj odczynniki do odwrotnej transkrypcji na płytkę IFC. Załaduj płytkę na kompatybilną maszynę do płynów. Uruchom skrypt odwrotnej transkrypcji. Warunki cyklu próbki: 1 cykl w temperaturze 25°C przez 10 minut, 1 cykl w temperaturze 42°C przez 1 godzinę, następnie 1 cykl w temperaturze 85°C przez 5 minut.
  3. Wykonaj wstępną amplifikację za pomocą sond specyficznych dla genu zgodnie z instrukcjami producenta płytki IFC.
    UWAGA: Ze względu na ich większą specyficzność przy niskiej liczbie kopii, należy używać sond znakowanych fluorogenem zamiast sond zoptymalizowanych do stosowania z barwnikami interkalatorowymi.
    1. Basen podkłady i rozcieńczyć do końcowego 180 nM każdy. Dodaj pule podkładów do płyty IFC. Załaduj płytkę na kompatybilną maszynę do płynów. Uruchom skrypt preamplifikacji.
  4. Wykonaj wstępne amplifikację w następujących warunkach cyklu: 1 cykl w temperaturze 95°C przez 10 minut, następnie 18 cykli z denaturacją w temperaturze 95°C przez 15 sekund, a następnie wyżarzanie i przedłużanie w temperaturze 60°C przez 4 minuty. Przechowuj wstępnie amplifikowane cDNA w temperaturze 4°C do czasu zbioru. Pobrać cDNA z płytki mikroprzepływowej zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia.

7. Wybierz cDNA z pojedynczych komórek do pojedynczego celu qRT-PCR

  1. Rozcieńczyć cDNA w odczynniku do rozcieńczania 25 μl zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Przybliżona ostateczna wydajność to 28 μl wstępnie amplifikowanego cDNA na komórkę. Zarezerwować podwielokrotność rozcieńczalnika do użycia jako kontrola bez matrycy w qRT-PCR.
    1. Odnosząc się do obrazów jasnego pola i obrazów fluorescencyjnych zarejestrowanych w kroku 5.3.2, oceń każde miejsce przechwytywania. Ręcznie policz i zapisz liczbę komórek. Oceń i zapisz, czy każda komórka jest fluorescencyjna.
      UWAGA: Każde pojedyncze miejsce może zawierać komórkę 0, 1 lub >1, gdzie komórka >1 obejmuje miejsca przechwytywania, które zawierają wiele komórek i/lub niemożliwe do zidentyfikowania szczątki. Jeśli obrazy są wystarczającej jakości, można również przypisać wartość piksela w celu ilościowego określenia intensywności sygnału fluorescencji.
  2. Wybierz próbki do analizy qRT-PCR.
    1. Wybierz próbki cDNA z miejsc wychwytywania zidentyfikowanych w kroku 7.2, które zawierają dokładnie 1 komórkę o dodatniej fluorescencji. Pula 1 μl podwielokrotności cDNA z każdej próbki.
      UWAGA: Jest to kontrola pozytywna "Pool" używana do określenia, czy geny będące przedmiotem zainteresowania ulegają ekspresji w którejkolwiek z wybranych komórek.
    2. Wybierz cDNA z co najmniej jednego miejsca przechwytywania, które zawiera dokładnie 0 komórek jako kontrolę negatywną. Użyj rozcieńczalnika z kroku 7.1.2 jako kontrolki bez szablonu.
  3. Uruchom test qRT-PCR.
    1. Używaj tylko sond używanych do wstępnego amplifikacja w kroku 6.4.1. Załadować wszystkie próbki w trzech egzemplarzach. Warunki cykliczne dla reakcji 10 μl na płytce 384-dołkowej: 1 cykl 50°C 2 min, 1 cykl 95°C przez 10 min, 40 cykli z denaturacją w temperaturze 95°C 15 sek, następnie wyżarzanie i przedłużanie w 60°C przez 1 min.

8. Analiza danych

  1. Walidacja produktów qRT-PCR za pomocą standardowej elektroforezy żelowej. Upewnij się, że produkt jest pojedynczym pasmem o oczekiwanej masie cząsteczkowej (różni się dla każdej sondy).
    UWAGA: Jeśli sonda wytwarza wiele prążków lub pojedyncze prążki o nieodpowiednim rozmiarze, to swoistość jest wątpliwa, a to wyklucza gen z analizy.
  2. Zbadaj wszystkie krzywe wzmocnienia i uwzględnij wszelkie nieprawidłowości14. Obliczyć średnią wartość CT dla każdej kombinacji próbka/gen15.
    UWAGA: Wartości CT dla kontroli pozytywnych zwykle wahają się od 10 do 30. Wartości CT dla kontroli ujemnych zwykle mieszczą się w zakresie 35-40 (bez amplifikacji). Wartości CT 30-35 są uważane za bardzo niską ekspresję i powinny być interpretowane z ostrożnością14.
  3. Dane raportu
    1. Jeśli próbki mieszczą się w CT=10-30, dane mogą być również zgłaszane jako krotna zmiana obfitości transkryptów w stosunku do próbki kontrolnej.
      UWAGA: Zmiana krotności równa się 2^(-ΔΔCT), gdzie ΔCT jest względny w stosunku do genu porządkowego poprzez odjęcie średniej CT próbki od genu porządkowania, a ΔΔCT to różnice w ΔCT między próbką a kontrolą pozytywną15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu przeprowadzenia dowodu koncepcji oceniono ekspresję genów, aby zbadać dynamikę różnicowania podczas rozwoju serca. U danio pręgowanego progenitory serca wywodzą się z mezodermalnej populacji komórek, które migrują do przedniej części mezodermy płyty bocznej, gdzie łączą się, tworząc liniową rurkę serca. Przed fuzją progenitory serca zaczynają eksponować czynnik transkrypcyjny nkx2.5 (NK2 homeobox 5), który uważa się za najwcześniejszy specyficzny marker progenitorów serca<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda wykorzystuje ekspresję białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki w celu wzbogacenia populacji komórek progenitorowych serca z zarodków danio pręgowanego do zastosowania w mikroprzepływowym systemie wychwytywania pojedynczych komórek w celu oceny ekspresji podzbioru genów sercowych w pojedynczych komórkach. Pod warunkiem, że możliwości wzbudzenia i emisji laserowej FACS są zgodne z wybranym fluoroforem (fluoroforami), metoda ta może być stosowana do dowolnej fluore...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. C. Geoffreyowi Burnsowi za rybołówstwo. Autorzy są wdzięczni UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core za zasoby umożliwiające ten projekt oraz ośrodkowi ZAC zajmującemu się opieką nad zwierzętami. L.S. jest wspierany przez grant NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. jest wspierany przez stypendium badawcze dla absolwentów NSF NSF-DGE-1144081. Badanie to było wspierane przez grant NIH P30DK034987 (dla UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 i Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (dla dr Qian) oraz grant HL109079 NIH R00 (dla dr Liu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Supplies
Dumont #5 kleszczeFine Science Tools11254-20Do usuwania kosmówki z zarodków
Probówka do mikrowirówek 2 mlGeneMateC-3261-1
Sitko do komórek 40 umBiobasicSP104151
35 mm Naczynie hodowlaneFalcon351008
Probówki FACS zwieńczone sitkiem 35 μmFalcon352235
P1000 i końcówkamiRainin17005089
P20 oraz końcówkami
Fluidigm100-6117Wersja 100-6117 E1 został użyty w reprezentatywnym eksperymencie
Pipeta szklana pastuer o szerokim otworzeVWR14673-010Do przenoszenie zarodków
Dorosły danio pręgowany typu dzikiegoUżyliśmy linii AB
Dorosły transgeniczny danio pręgowanyNieUżyliśmy Tg(nkx2.5:ZsYellow)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Odczynniki do dysocjacji komórek
Podwójnie destylowana wodaNie dotyczy
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
NaClFisherScientificS271-3zrobić zapas w wodzie i użyć do odtłuszczania żółtka
bufor KClSigmaAldrich P5405zrobić zapas w wodzie i użyć do buforu do usuwania żółtek
NaHCO3Sigma AldrichS6014zrobić zapas w wodzie i użyć do buforu do usuwania żółtka
Leibovitz's L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511Inaktywacja termiczna; każda marka FBS powinna być w porządku
Odczynnik do dysocjacji komórek 1 -TrypLELife Technologies12605-010Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Odczynnik do dysocjacji komórek 2 - FACSmaxGenlantisT200100Store -20; rozmrozić na lodzie; przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej
Pronase (opcjonalnie)SigmaP5147
L/D Dye - Sytox BlueLife TechnologiesS34857Każda żywa/martwa plama nadająca się do cytometrii przepływowej będzie działać
Trypan BlueGibco15250-061
Nazwa Company>Numer katalogowyKomentarze
Odczynniki do stosowania na płytkach IFC i sondy
Sondy będą się różnić w zależności od eksperymentu
Sonda TaqMan gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
Sonda TaqMan nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
Sonda TaqMan myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
Sonda TaqMan vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
Sonda TaqMan isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
Odczynniki TaqMan Gene Expression Master MixLife Technologies4369016
wymienione w protokole
Zestaw odczynników C1Fluidigm100-5319Odczynniki do ładowania komórek na płytkę IFC
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237Odczynniki do etapów odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji
Biologia molekularna Jakość wodyCorning46-000CM
C1 IFC dla PreAmp (5-10 um)Fluidigm100-5757Płyta IFC do małych komórek
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Maszyna C1 AutoPrepFluidigm100-5477Do płyty IFC użyj
hemocytometru Sigma AldrichZ359629Do liczenia komórek i oceny wielkości komórek
MikroskopDo usuwania zarodków z kosmówki
Mikroskophodowli tkankowych Do oceny trawienia pojedynczych komórek
MaszynaDo izolowania komórek będących przedmiotem zainteresowania
Protokół producenta chipów IFC Rainin 17005091 Nie dotyczy dotyczy specyficzne dla qRT-PCRGene'a TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1 producenta IFC preparacyjny do FACS

Bibliografia

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

izolacja pojedynczych kom rekchip mikrofluidycznysortowanie FACSdysocjacja kom rekanaliza ekspresji gen wmarkery fluorescencyjnewykluczanie b kitu trypanuzintegrowany obw d fluidycznyqRT PCR
Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.