Artykuł metodologiczny

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

DOI:

10.3791/53880

⸱

18 marca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentowana jest nowa metoda, która pozwala na przekształcenie dorosłych fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę. Technika ta opiera się na konwersji epigenetycznej, nie wiąże się z użyciem wektorów retrowirusowych ani nabyciem stabilnego stanu pluripotencjalnego. Jest zatem bardzo obiecujący w zastosowaniach medycyny translacyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medycyna regeneracyjna wymaga nowych, w pełni funkcjonalnych komórek, które są dostarczane pacjentom w celu naprawy zdegenerowanych lub uszkodzonych tkanek. Gdy takie komórki nie są łatwo dostępne, można je uzyskać przy użyciu różnych podejść, które obejmują między innymi przeprogramowanie i transdyferencjację, z zaletami i ograniczeniami specyficznymi dla różnych technik. W tym artykule opisano nową strategię przekształcania dorosłego dojrzałego fibroblastu w komórkę wydzielającą insulinę, arbitralnie określaną jako komórki przekształcone epigenetycznie (EpiCC). Metoda została opracowana w oparciu o coraz lepsze zrozumienie mechanizmów kontrolujących epigenetyczną regulację losu i różnicowania komórek. W szczególności pierwszy etap wykorzystuje modyfikator epigenetyczny, a mianowicie 5-aza-cytydynę, aby wprowadzić dorosłe komórki w stan "wysoce permisywny". Następnie wykorzystuje to krótkie i odwracalne okno plastyczności epigenetycznej, aby ponownie skierować komórki w stronę innej linii. Podejście to określa się mianem "epigenetycznej konwersji komórek". Jest to prosty i solidny sposób na uzyskanie wydajnego, kontrolowanego i stabilnego komórkowego przełącznika międzyliniowego. Ponieważ protokół nie obejmuje stosowania żadnej transfekcji genów, jest wolny od wektorów wirusowych i nie obejmuje stabilnego stanu pluripotencjalnego, jest bardzo obiecujący dla zastosowań w medycynie translacyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowym celem medycyny regeneracyjnej jest generowanie nowych, funkcjonalnych komórek, które mogą być używane do naprawy lub wymiany uszkodzonych, zdegenerowanych tkanek. Przekształcanie łatwo dostępnych dorosłych komórek w nowe, poprzez przekształcanie ich z jednego typu komórek w inny, jest szczególnie atrakcyjnym podejściem, zwłaszcza gdy wymagana populacja komórek nie jest obfita lub trudno dostępna. Jednak dorosłe komórki są niezwykle stabilne. Swój zróżnicowany stan osiągają poprzez stopniowe ograniczanie swoich możliwości, a gdy osiągną dojrzałą specjalizację terminalną, stabilnie ją utrzymują 1.

W ostatnich latach opracowano szereg protokołów, które umożliwiają przeprogramowanie komórki somatycznej (iPS) na pluripotencję osiągniętą poprzez wymuszoną ekspresję zestawu czynników transkrypcyjnych 2,3. Alternatywnie, konwersję komórek można uzyskać przez bezpośrednią transdyferencjację linii, wprowadzając pojedynczy 4 lub kombinację czynników transkrypcyjnych 5-7. Strategia ta nie obejmuje przejścia przez stan niezróżnicowany, ale wymaga wysokiej ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych 8.

Niedawno opracowaliśmy protokół konwersji oparty na krótkiej ekspozycji dorosłych komórek na demetylujące właściwości analogu cytydyny 5-azacytydyny (5-aza-CR), dobrze scharakteryzowanego inhibitora metylotransferazy DNA. Bezpośrednio po etapie demetylacji następuje specyficzny protokół różnicowania 9-11, który pozwala uzyskać wymagany fenotyp końcowy. Metoda ta jest w stanie przekształcić dojrzałe, zróżnicowane komórki w komórki o innej linii i ma istotną zaletę, ponieważ pozwala uniknąć zarówno stosowania wektorów wirusowych, jak i transfekcji jakichkolwiek egzogennych czynników transkrypcyjnych. Unika się również nabycia stabilnego stanu pluripotencjalnego i związanej z tym zwiększonej podatności na niestabilność komórki.

Szczegółowy protokół, który pozwala na konwersję fibroblastów skóry dorosłego człowieka w pełni funkcjonalne komórki wydzielające insulinę, jest przedstawiony tutaj. Warto jednak zauważyć, że technika ta została zastosowana do różnych typów komórek i przyniosła pozytywne wyniki, jeśli chodzi o kierowanie komórek w kierunku różnych szlaków różnicowania. Co więcej, konwersja epigenetyczna została z powodzeniem zastosowana u ludzi i świń z gatunku 9-13, a także u psów (przedłożony manuskrypt), co sugeruje szeroką skuteczność i solidność tego podejścia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Wszystkie opisane poniżej procedury muszą być wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. Upewnij się, że wszystkie procedury hodowli są przeprowadzane na etapach kontrolowanych termostatycznie, a komórki są utrzymywane w temperaturze 37 °C przez cały czas ich obsługi.

1. Izolacja fibroblastów skóry

  1. Przygotuj roztwór do powlekania naczyń kulturowych
    1. Rozpuścić 0,1 g żelatyny wieprzowej w 100 ml wody (stężenie końcowe 0,1%). Sterylizuj roztwór w autoklawie.
    2. Dodać 1,5 ml sterylnej 0,1% żelatyny wieprzowej na szalki Petriego o średnicy 35 mm. Poczekaj 2 godziny na pokrycie, utrzymując je w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Biopsje ludzkiej skóry są pobierane przez wycięcie w znieczuleniu miejscowym z jałowego obszaru przedniej części przedramienia i przechowywane w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) firmy Dulbecco uzupełnionej 2% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym w temperaturze +4 °C przed użyciem.
  2. Umyj biopsje nowym PBS uzupełnionym 2% roztworem antybiotykowym przeciwgrzybiczym.
  3. Umieścić biopsje na szalce Petriego o średnicy 100 mm i pokroić na około 2 mm3 fragmenty za pomocą sterylnych skalpeli.
  4. Nadmiar roztworu powlekającego należy usunąć bezpośrednio przed fragmentami poszycia.
  5. Umieść 5-6 fragmentów skóry na wstępnie pokrytej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  6. Przygotuj pożywkę do hodowli fibroblastów: 77% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% roztwór L-glutaminy i 2% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy
    7. .
  7. Dodać kroplę pożywki z fibroblastów na każdy fragment (zwykle 100 μl na fragment) i hodować je w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  8. Po 24 godzinach dodać 500 μl pożywki do hodowli fibroblastów na fragmenty, aby utrzymać je mokre w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  9. Zmieniaj pożywkę za pomocą pipety co najmniej raz na 48 godzin.
  10. Po 6 dniach inkubacji należy ostrożnie usunąć fragmenty tkanek i wyrzucić je.
    Uwaga: Po 6 dniach fibroblasty zaczynają wyrastać z fragmentów tkanki i zaczynają tworzyć monowarstwę komórkową.
  11. Odświeżyć pożywkę, dodać 2 ml pożywki do hodowli fibroblastów i kontynuować hodowlę komórek jednowarstwowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .

2. Kultura fibroblastów

  1. Hodowla fibroblastów w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do 80% konfluencji
  2. Do pasażowania odessać pożywkę do hodowli fibroblastów z naczyń do hodowli tkankowych. Umyj komórki trzykrotnie 4 ml PBS uzupełnionego 1% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym.
  3. Dodać cienką warstwę (10% objętości pożywki hodowlanej) roztworu trypsyna-EDTA (0,5 g/l trypsyny wieprzowej i 0,2 g/l EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż monowarstwa komórek zacznie odrywać się od dna naczynia do hodowli tkankowej, a komórki ulegną dysocjacji.
  4. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową 9 częściami pożywki hodowlanej fibroblastów, aby zneutralizować działanie trypsyny. Wirowanie nie jest konieczne.
  5. Płytki komórkowe w nowych szalkach hodowlanych (bez żelatyny) i hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 . Utrzymuj współczynnik przejścia od 1:2 do 1:4, w zależności od tempa wzrostu.
  6. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, przechodź przez nie (zwykle dwa razy w tygodniu).

3. Posiewanie fibroblastów w celu konwersji epigenetycznej

  1. Dodać 0,26 ml/cm2 0,1% żelatyny wieprzowej (przygotować zgodnie z opisem w ppkt 1.1) do szalek do hodowli komórkowych. Poczekaj 2 godziny na pokrycie.
  2. Nadmiar roztworu powlekającego należy usunąć na 10-30 minut przed posiewem fibroblastów.
  3. Usuń pożywkę hodowlaną fibroblastów z naczyń hodowlanych. Umyj komórki trzykrotnie PBS uzupełnionym 1% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym.
  4. Dodać cienką warstwę (10% objętości pożywki hodowlanej) roztworu trypsyna-EDTA (0,5 g/l trypsyny wieprzowej i 0,2 g/l EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż monowarstwa komórek zacznie odrywać się od dna naczynia do hodowli tkankowej, a komórki ulegną dysocjacji.
  5. Rozcieńczyć zawiesinę komórek 9 częściami pożywki hodowlanej fibroblastów, aby zneutralizować działanie trypsyny.
  6. Policz komórki za pomocą komory liczącej pod mikroskopem w temperaturze pokojowej. Obliczyć wymaganą objętość pożywki hodowlanej fibroblastów do ponownego zawieszenia komórek, aby uzyskać stężenie komórek 7,8 x 104 fibroblasty/cm2. Będzie to zależało od konkretnego rodzaju używanej komory.
    Komórki/μl = Średnia liczba komórek w małej siatce x 90 (współczynnik mnożenia) x rozcieńczenie
  7. Odwirować zawiesinę komórek w ilości 150 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą wcześniej obliczonej objętości pożywki hodowlanej fibroblastów.
  8. Umieść komórki na 0,1% galatycznych naczyniach pokrytych żelatyną i hoduj je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

4. Zwiększ plastyczność komórek za pomocą środka demetylującego 5-aza-CR

  1. Dzień 0
    1. Przygotować roztwór podstawowy 5-aza-CR, rozpuszczając 2,44 mg 5-aza-CR w 10 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Sterylizować przez filtrację. Przygotuj bulion 5-aza-CR bezpośrednio przed użyciem.
    2. Rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego 5-aza-CR w 1 ml pożywki do hodowli fibroblastów (stężenie końcowe 1 μM).
    3. Aby zwiększyć plastyczność komórek, 24 godziny po posiewie komórek (podpozycja 3.8) należy usunąć pożywkę hodowlaną z wysiewanych fibroblastów i dodać 1 μM roztwór podstawowy 5-aza-CR i hodować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Dzień 1
    1. Przygotować świeżą pożywkę dla ludzi z pluripotencjalnym potencjałem (HP) zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    2. Po inkubacji z 1 μM 5-aza-CR usunąć pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS, aby upewnić się, że 5-aza-CR został wypłukany.
    3. Inkubować fibroblasty poddane działaniu 5-aza-CR z pożywką HP przez 3 godziny (okres rekonwalescencji) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    4. Po okresie rekonwalescencji usuń pożywkę, przemyj trzykrotnie PBS.
    5. Aby monitorować skuteczność leczenia 5-aza-CR, sprawdź na tym etapie obecność zmian morfologicznych (szczegółowo w sekcji Wyniki). Komórki tracą typową wydłużoną morfologię fibroblastów i uzyskują okrągły lub owalny kształt, stając się mniejszymi, z powiększonymi jądrami.
    6. Kontynuuj różnicowanie trzustki.

5. Protokół różnicowania trzustki

  1. Dni 1-6
    1. Przygotować podłoże podstawne trzustki zgodnie z opisem w Tabeli 2.
    2. Przygotować roztwór podstawowy aktywiny A: rozpuścić 5 μg rekombinowanego białka ludzkiego aktywiny A w 166,6 μl sterylnej wody.
    3. Hodowla fibroblastów traktowanych 5-aza-CR w 0,26 ml/cm2 podłoża podstawowego trzustki, uzupełniona 1 μl/ml roztworu podstawowego aktywiny A (patrz 5.1.2) przez 6 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.
  2. Dni 7-8
    1. Przygotować roztwór podstawowy kwasu retinowego, dodając 16,6 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 50 mg kwasu retinowego.
    2. Hodowla komórek w 0,26 ml/cm2 podłoża podstawowego trzustki uzupełniona 1 μl/ml roztworu podstawowego aktywiny A (patrz 5.1.2) i 1 μl/ml roztworu podstawowego kwasu retinowego (patrz 5.2.1) przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.
  3. Dni 9-36
    1. Hodowla komórek w 0,26 ml/cm2 podłoża podstawowego trzustki uzupełniona 1% (v/v) insulina-transferyna-selen (ITS), 2% (v/v) B27 i 0,1% (v/v) rekombinowany ludzki roztwór podstawowy zasady FGF (bFGF) (patrz tabela 1) w temperaturze 37 °C w 5% inkubatorze CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie przez pierwsze 15 dni.
    2. Począwszy od 16 dnia, należy odświeżać pożywkę co drugi dzień pod mikroskopem, ponieważ tworzące się komórki zbiorcze mogą oderwać się od dna szalki hodowlanej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Założenie podstawowej hodowli na podstawie biopsji skóry
Biopsje skóry pocięto na małe fragmenty i umieszczono w naczyniach pokrytych żelatyną. Po 6 dniach fibroblasty zaczęły wyrastać z fragmentów tkanki i utworzyły monowarstwę komórkową (ryc. 1A). Komórki wykazywały typowy wydłużony kształt i, zgodnie z oczekiwaniami, wykazywały jednolitą dodatnią odporność na marker specyficzny dla fibroblastów, wimentynę (Vim, Figura 1B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, która umożliwia przekształcenie ludzkich fibroblastów skóry w komórki produkujące insulinę, poprzez przejściową i krótką ekspozycję na 5-aza-CR, po której następuje protokół indukcji specyficznej dla tkanki. Takie podejście pozwala na przejście od komórek związanych z mezodermą do komórek związanych z endodermą, bez wymuszonej ekspresji czynników transkrypcyjnych lub mikroRNA ani uzyskania stabilnego stanu pluripotencjalnego, który sprawia, że komórki są bardziej niestabilne i podatne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Carraresi i Europejską Fundację Badań nad Cukrzycą (EFSD). Lekarz rodzinny jest wspierany przez stypendium podoktorskie Uniwersytetu w Mediolanie. Autorzy są członkami COST Action FA1201 Epiconcept: Epigenetics and Periconception environment oraz COST Action BM1308 Sharing advances on large animal models (SALAAM). TALB jest członkiem COST Action CM1406 Epigenetic Chemical Biology (EPICHEM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoSigmaD5652PBS; do przemywania komórek i przygotowywania roztworu
Antybiotyk Przeciwgrzybiczy roztwórSigmaA5955Składnik fibroblastów, pożywki HP i trzustkowej
100 mm szalka PetriegoSarstedt83.3902Do izolacji fibroblastów
Żelatyna wieprzowaSigmaG1890Do powlekania naczyń
WodaSigmaW3500Do przygotowania roztworu
35 mm szalki PetriegoSarstedt83.39Do izolacji fibroblastów
DMEM, wysoka glukoza, pirogronianTechnologie życia41966052Do pożywki do hodowli fibroblastów
Płodowa surowica bydlęcaTechnologies10500064FBS; Składnik pożywki Fibroblast i HP
Roztwór L-glutaminySigmaG7513Składnik fibroblastów, pożywek HP i trzustki
Roztwór trypsyny-EDTASigmaT3924do dysocjacji fibroblastów
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 Z SIATKAMIHycor Biomedical87144Zliczanie komórek
5-azacytydynaSigmaA23855-aza-CR, do komórki przyrostowej plastyczność w fibroblastach
Szynka F-10 Nutrient MixLife Technologies31550031Dla HP medium
DMEM, o niskiej glukozie, pirogronianieTechnologie życia31885023Dla HP medium
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828028Składnik pożywki HP
MEM Non-Essential Amino Technologie SolutionLife 11140035Składnik pożywki HP i trzustkowej
2-merkaptoetanolSigmaM7522Składnik pożywki HP i trzustkowej Pożywki podstawowej
GuanozynaSigmaG6264Mieszanka nukleozydów składnik podstawowy pożywki HP
AdenozynaSigma A4036Mieszanka nukleozydów składnik podstawowy podłoża HP
CytydynaSigmaC4654Mieszanka nukleozydów składnik podłoża HP
UridineSigmaU3003Mieszanka nukleozydowa składnik podstawowy HP medium
ThymidineSigmaT1895Mieszanka nukleozydów składnik podstawowy HP medium
Millex-GS 0,22 µ mMiliporySLGS033SBDo sterylizacji roztworu
FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinowane Białka LudzkieTechnologie Życia PHG0261bFGF; Składnik HP i trzustki
Podłoże Surowicy bydlęcej AlbuminaSigmaA3311BSA; Składnik podłoża podstawowego trzustki
DMEM / F-12Life Technologies11320074Dla podłoża podstawowego trzustki
B-27 Suplement Minus Witamina ALife Technologies12587010Składnik podłoża trzustkowego
N-2 SuplementLife Technologies17502048Składnik podłoża podstawowego trzustki
Rekombinowane technologie życia białka ludzkiego Activina APHG9014Dla podłoża trzustkowego
Kwas retinowySigmaR2625Dla podłoża trzustkowego
DimetylosulfotlenekSigmaD2650DMSO; do przygotowania bulionu kwasu retinowego
Insulina-Transferyna-SelenLife Technologies41400045ITS; dla trzustki Końcowe podłoże
Przeciwciało anty-wimentynowe Abcamab8069Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:100
4&,6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindoluSigma32670DAPI. Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze  1 &mikro; g / ml
5-metylocytydynaEurogentecMMS-900P-BDo analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:500
Przeciwciało peptydowe anty-C Abcamab14181Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:100
Przeciwciało anty-PDX1 Abcamab47267Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:500
Mercodia Insulina ELISAMercodia10-1113-10Do wykrywania uwalniania insuliny
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

leczenie 5 aza cytydynr nicowanie trzustkoweindukcja kwasem retinowymsuplementacja aktywin Apo ywka ITS B27 BFGSkolokalizacja PDX1 i CPEPinsulinowy wyrzut stymulowany glukoz

Powiązane artykuły