Artykuł metodologiczny

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

19.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53884

⸱

14 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery and Translational Medicine (DCMT), University of Florence, 2Neurofarba Department, University of Florence, 3Department of Traumatology and General Orthopedics, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi

W tym artykule

Podsumowanie

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Streszczenie

Obecne postępy w terapii kostniakomięsaka (OS) przedłużyły życie pacjentów z rakiem, ale wskaźnik przeżycia wynoszący pięć lat pozostaje niski, gdy wystąpiły przerzuty. Teoria rakowych komórek macierzystych (CSC) utrzymuje, że w guzie znajduje się podzbiór komórek nowotworowych, które mają cechy podobne do łodygi, w tym zdolność do utrzymania guza i odporności na chemioterapię wielolekową. W związku z tym konieczne jest lepsze zrozumienie biologii i patogenezy OS, aby przyspieszyć rozwój terapii celowanych w celu wyeliminowania tej konkretnej podgrupy oraz zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności wśród pacjentów. Izolowanie CSC, tworzenie kultur komórkowych CSC i badanie ich biologii to ważne kroki w kierunku lepszego zrozumienia biologii i patogenezy OS. Ustalenie OS-CSC pochodzenia ludzkiego z biopsji OS było możliwe dzięki kilku metodom, w tym zdolności do tworzenia trójwymiarowych kultur komórek macierzystych w warunkach nieprzylegających. W tych warunkach CSC są w stanie tworzyć kuliste pływające kolonie utworzone przez potomne komórki macierzyste; Kolonie te nazywane są "sferami komórkowymi". W tym miejscu opisano metodę ustanawiania kultur CSC z pierwotnych kultur komórkowych konwencjonalnego OS uzyskanych z biopsji OS. Jasno opisujemy kilka fragmentów wymaganych do wyizolowania i scharakteryzowania CSC.

Wprowadzenie

mięsaki to niejednorodna grupa rzadkich złośliwych nowotworów tkanki łącznej pochodzących głównie z zarodkowej mezodermy1. Różne typy obejmują mięsaki kości i mięsaki tkanek miękkich. Mięsaki kostne, grupa stosunkowo rzadkich nowotworów pierwotnych, składają się z kilku podtypów, w tym kostniakomięsaka (OS). OS, jeden z najczęstszych pierwotnych nowotworów kości, jest mezenchymalnym nowotworem złośliwym, który wykazuje rozległe niejednorodności kliniczne, histologiczne i molekularne2, 3. Niestety, OS występuje głównie u dzieci i młodych dorosłych4, 5 i stanowi 60% powszechnych podtypów histologicznych mięsaka kości w dzieciństwie6, 7. OS zwykle dotyczy obszarów szkieletowych, które charakteryzują się szybkim wzrostem kości (np. przynasada kości długich). Wśród histologicznie różnych podtypów OS, konwencjonalny OS, zwany również rdzeniastym lub centralnym OS, ma wysoki stopień złośliwości i udział kwotowy wynoszący 80%8. Te 80% składa się w 60% z konwencjonalnego osteoblastycznego systemu operacyjnego, 10% chondroblastycznego systemu operacyjnego i 10% fibroblastycznego systemu operacyjnego6, 8-10. Inne podtypy OS obejmują system operacyjny anaplastyczny, teleangiektatyczny, bogaty w olbrzymie komórki i system operacyjny małych komórek. Pomimo postępów w chirurgii skojarzonej i chemioterapii w leczeniu OS, wyniki pozostają słabe, z długoterminowym wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 65-70% u pacjentów bez przerzutów11, 12. Nawroty odległe często występują jako przerzuty do płuc lub rzadziej jako przerzuty do odległych kości i nawroty miejscowe13. Przerzuty są często oporne na konwencjonalne leczenie. Ta oporność jest powodem, dla którego 10-letnie przeżycie wolne od choroby wynosi około 30% u pacjentów z chorobą przerzutową w momencie rozpoznania14, 15.

Podobnie jak w przypadku normalnej tkanki, tkanka nowotworowa składa się z niejednorodnego zbioru typów komórek. Komórki w guzie wydają się odpowiadać różnym etapom rozwoju. W każdej normalnej tkance znajduje się subpopulacja komórek ze zdolnością do samoodnawiania, zapewniając w ten sposób komórki progenitorowe i dojrzałe do homeostazy tkanek. Podobnie rak składa się z podobnej niejednorodnej populacji komórek na różnych etapach rozwoju, o różnym stopniu proliferacji i potencjale rakotwórczym. Podzbiór tych komórek rakowych, określany jako rakowe komórki macierzyste (CSC), stanowi rezerwuar samowystarczalnych komórek z wyłączną zdolnością do samoodnawiania i utrzymywania złośliwego potencjału nowotworów, generując w ten sposób różne linie komórkowe, które stanowią masę guza16. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku badania nad ostrą białaczką szpikową dostarczyły pierwszych przekonujących dowodów na istnienie subpopulacji CSC17, 18. Od tego czasu CSC zostały wyizolowane z dużej liczby guzów litych19, stając się tym samym jednym z najczęściej badanych tematów w badaniach nad rakiem. CSC mogą rzeczywiście powstawać z normalnych komórek macierzystych w wyniku mutacji w genach, które sprawiają, że normalne komórki macierzyste są rakowe20-23. Wielokrotne mutacje transformacyjne i interakcje z mikrośrodowiskiem mogą również przyczynić się do tego, że zdrowi przodkowie i dojrzałe komórki nabywają zdolność do samoodnawiania się i nieśmiertelność, które są typowe dla CSC. Istnieje kilka hipotez na temat tej transformacji. Zdrowi przodkowie, zdrowe dojrzałe komórki i komórki rakowe mogą odróżnić się do komórek macierzystych, uzyskując fenotyp podobny do macierzystego poprzez aktywację genów związanych z samoodnową24-28. Pomimo kilku ostatnich badań, pochodzenie CSC nie zostało jeszcze odkryte.

Szczególną cechą CSC jest ich zdolność do opierania się podejściu wieloterapeutycznemu, które składa się z połączonej chirurgii i chemioterapii różnymi lekami. Ostatnie badania wykazały, że CSC mogą również nabyć oporność na cytotoksyczne środki chemioterapeutyczne. Możliwe wyjaśnienia tej oporności obejmują nadekspresję wielolekowego transportera kasety wiążącej ATP (ABC) (tj. MDR1 i BCRP1), nadekspresję enzymów metabolizujących chemioterapię, takich jak dehydrogenaza aldehydowa 1 (ALDH1) i / lub zmiany w kinetyce cyklu komórkowego30-33. Bezpośrednią konsekwencją wszystkich tych koncepcji, które zostały opisane do tej pory, jest to, że terapia przeciwnowotworowa byłaby skuteczna tylko wtedy, gdyby subpopulacja CSC została całkowicie wyeliminowana, podczas gdy miejscowy nawrót lub odległe przerzuty mogłyby wystąpić, gdyby przeżył nawet jeden CSC.

Odkrycie CSC w ludzkich mięsakach34, szczególnie OS35, lub w jakimkolwiek innym nowotworze kości i tkanek miękkich, ma duże znaczenie kliniczne, ponieważ oferuje możliwe wyjaśnienie, dlaczego wiele metod leczenia wydaje się być początkowo skutecznych, ale później u pacjentów dochodzi do nawrotu. Dlatego nadzieją na przyszłą walkę z konwencjonalnym OS jest znalezienie nowych i specyficznych terapii celowanych opartych na rozwoju innowacyjnych leków skierowanych na OS-CSC dzięki charakterystyce molekularnej tej subpopulacji i badaniom biologii CSC.

W 1992 roku Reynolds i współpracownicy, którzy badali, czy w mózgu dorosłego ssaka występuje podzbiór komórek macierzystych, opracowali metodę izolowania komórek podejrzanych o bycie komórkami macierzystymi36, 37. Metoda ta opiera się na szczególnej zdolności tych komórek do tworzenia kulistych kolonii, gdy są hodowane w nieprzylegających warunkach. Podobne techniki zostały zastosowane przez Gibbsa i współpracowników w 2005 roku do zbadania subpopulacji komórek macierzystych w mięsakach kości38. Aby wyizolować i scharakteryzować OS-CSC z pierwotnych kultur komórkowych różnych typów konwencjonalnego OS, zdecydowaliśmy się dostosować tę technikę do linii komórkowych OS.

Tutaj opisujemy tę zaadaptowaną metodę badania formowania sfery, zwaną "testem sarkosfery", która może być użyta do izolacji OS-CSC od skończonych pierwotnych linii komórkowych pochodzących z ludzkich biopsji konwencjonalnego systemu operacyjnego. Opisujemy również wszystkie techniki stosowane do walidacji podobnego do łodygi fenotypu CSC linii komórkowych wyizolowanych za pomocą tego testu: 1) ocena ekspresji genów charakteryzujących pluripotencjalne embrionalne komórki macierzyste (ESC) i genu CD133, który jest markerem CSC; 2) test jednostki tworzącej kolonię (CFU); 3) ocena zdolności tych komórek do różnicowania się w osteoblasty i adipocyty w odpowiednich warunkach różnicowania; 4) badanie markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (tj. CD44, CD105 i Stro-1) metodą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy metodą cytometrii przepływowej; 5) ocena aktywności ALDH tych komórek.

Protokół

Wszystkie opisane tu eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (Rif. N. 141/12). Świadomą zgodę na pobranie próbek tkanek oraz na wykorzystanie i przechowywanie próbek uzyskano od dawców z AOUC.

1. Przygotowanie do kultury

  1. Przygotować pożywkę do hodowli wzrostu (GM), dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny do pożywki F12 zmodyfikowanej szynki Coon's. Przefiltruj i wysterylizuj GM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać GMO do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować pożywkę kolagenazy (CM) dodając 20% FBS, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 3 mg/ml kolagenazy typu II do pożywki F12 modyfikowanej szynki Coon's. Przefiltruj i wysterylizuj CM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać CM do 1 miesiąca w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotuj pożywkę do zamrażania komórek (FM), dodając 40% FBS, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 6,5% dimetylosulfotlenku (DMSO) do pożywki F12 modyfikowanej szynki Coon's. Filtruj i sterylizuj FM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać FM do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować pożywkę do testu CFU (CFUM), dodając 20% FBS, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny do zmodyfikowanej pożywki F12 szynki Coon's. Filtruj i sterylizuj CFUM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać CFUM do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować trypsynę, rozpuszczając 400 mg trypsyny, 200 mg EDTA i 1000 mg bezwodnej D(+)-glukozy w 1000 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+,
    nuta: Podzielić świeżą trypsynę-EDTA na 50 ml porcji w kolbach o średnicy 25cm2 za pomocą filtra 0,22 μm i zamrażać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy. Rozmrożone, wysterylizowane przez filtr podwielokrotności przechowywać w temperaturze 4 °C bez utraty aktywności.
  6. Przygotuj pożywkę do wzrostu komórek macierzystych (SCGM), dodając 10% FBS, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10 ng/ml bFGF (25 μg/ml bulionu) do zmodyfikowanej pożywki F12 firmy Coon's. Przefiltruj SCGM za pomocą filtra 0,22 μm i przechowuj SCGM do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować 2% metylocelulozy (MC), rozpuszczając MC w ultraczystymH2Ow temperaturze 4 °C przez 3 dni. Gdy MC całkowicie się rozpuści, należy go sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Po wysterylizowaniu MC staje się stały. Aby doprowadzić MC do stanu ciekłego, przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować pożywkę do wzrostu sarkosfery (SGM). Przygotować tę pożywkę na świeżo (nie później niż 2 tygodnie przed użyciem), dodając 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml ludzkiego bFGF (25 μg/ml bulionu), 20 nM progesteronu (10 μM podstawy), 100 μM putrescyny, 30 nM seleninu sodu (30 μM podstawy), 25 μg/ml transferyny (25 mg/ml bulionu), 20 μg/ml insuliny (20 mg/ml zapasu) i 10 ng/ml ludzkiego EGF (10 μg/ml zapasu) do 2X zmodyfikowanej pożywki Coon's Ham's F12. Filtruj i sterylizuj SGM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4°C.
  9. Przygotować pożywkę osteogenną (OM), dodając 10% FBS (pochodzenie południowoamerykańskie), 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 nM deksametazonu (zapas 100 μM), 0,2 mM L-askorbylo-2-fosforan sodu (1 M zapas), 10 mM β-glicerofosforanu (5 mg/ml bulionu) i 1 μg/ml kalceiny (200 μg/ml bulionu) do zmodyfikowanej pożywki F12 Coon's Ham's. Przefiltruj i wysterylizuj OM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Roztwory podstawowe deksametazonu należy przechowywać w ciekłym azocie w celu utrzymania ich aktywności. Przygotuj świeży OM co 2 tygodnie, aby utrzymać aktywność deksametazonu w celu utrzymania potencjału różnicowania pożywki.
  10. Przygotować bufor do lizy erytrocytów (ELB) przez rozpuszczenie 1,66 mg NH4Cl, 0,2 mg K2HPO4 i 0,007 mg EDTA w 200 ml wody destylowanej (dH2O). Przefiltruj i wysterylizuj ELB za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  11. Przygotuj pożywkę adipogenną (AM), dodając 10% FBS (pochodzenie z Ameryki Południowej), 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 μM deksametazonu (1 mM zapasu), 1 μM insuliny bydlęcej (10 mM bulionu), 0,5 mM izobutylometyloksantyny (IBMX) (500 mM zapasu) i 100 μM indometacyny (200 mM) do zmodyfikowanej pożywki F12 firmy Coon's. Filtruj i sterylizuj AM za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Roztwory podstawowe deksametazonu należy przechowywać w ciekłym azocie w celu utrzymania ich aktywności. Przygotuj świeże AM co 2 tygodnie, aby utrzymać aktywność deksametazonu w celu utrzymania potencjału różnicowania pożywki.
  12. Przygotuj 2% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS (BSA/DPBS). Rozpuścić 10 g masy ciała w 500 ml DPBS i przygotować roztwór podstawowy, dzieląc 50 ml roztworu podstawowego w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  13. Przygotować roztwór 4% paraformaldehydu (PFA) w DPBS (PFA/DPBS). W kapturze chemicznym rozcieńczyć paraformaldehyd w DPBS i przygotować roztwór podstawowy, rozdzielając 50 ml roztworu podstawowego w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Ustanawianie podstawowych hodowli komórkowych OS i linii komórkowych OS (OSA)

UWAGA: Pierwotne hodowle komórek OS przygotowano ze świeżych próbek konwencjonalnych biopsji OS pobranych w "Unità Ortopedia Oncologica e Ricostruttiva", AOUC Careggi, Florencja. Wszystkie biopsje, które uzyskano przez aspirację igłową lub chirurgiczną resekcję niewielkiej części guza (ryc. 1A, B), natychmiast umieszczono w pożywce hodowlanej uzupełnionej 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (pH 7,4) i przetransportowano do laboratorium, gdzie zostały przetworzone. Wszystkie opisane manipulacje przeprowadzono w warunkach aseptycznych przy użyciu okapu z przepływem laminarnym.

  1. Izolacja komórek OS
    1. Umieścić biopsję na szalce Petriego o średnicy 100 mm z niewielką objętością GM. Za pomocą sterylnego lancetu i pęsety Perry zmielić próbki tkanek OS, krojąc je na jak najmniejsze kawałki (0,5 - 1 mm) (Rysunek 2A, B) .
    2. Przykryć fragmenty tkanek 10 ml CM do trawienia enzymatycznego (ryc. 2B) i inkubować przez 3 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Delikatnie usunąć zawiesinę fragmentów za pomocą pipety i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu natychmiastowego odwirowania (400 x g przez 5 min) w celu osadzenia fragmentów.
      nuta: Po odwirowaniu, jeśli biopsje są bogate w erytrocyty, na fragmentach można zobaczyć czerwony osad złożony z erytrocytów. Dlatego przed przystąpieniem do dyspersji mechanicznej należy potraktować próbkę buforem do lizy erytrocytów. Odrzucić supernatant przez aspirację i dodać 5 ml ELB.
    3. Zawiesić fragmenty osadu na 1 minutę i odwirować zawiesinę o sile 400 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant przez aspirację. Dodać 5 ml GM i mechanicznie rozproszyć fragmenty za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml (wielkość otworu, Ø wewnętrzna 1,5 mm) 10 - 20 razy.
    4. Odwirować zawiesinę o sile 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant przez aspirację, zawiesić osad komórkowy w 10 ml GM, a następnie przenieść powstałą zawiesinę komórek na płytkę Petriego o średnicy 100 mm. Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i zastępować zmodyfikowane genetycznie zmodyfikowane maszynowo świeżym, kompletnym roztworem zmodyfikowanym genetycznie co 3 d.
      nuta: Dość często próbki tkanek OS uzyskane przez aspirację igłową są bardzo małe i zawierają fragmenty kości, które nie są trawione przez trawienie enzymatyczne z kolagenazą. Dlatego po usunięciu supernatantu należy podjąć próbę oddzielenia komórek od tkanki kostnej poprzez rozgniecenie fragmentów osadu pipetą.
  2. Subkultura
    UWAGA:     Aby ustalić OBS, gdy komórki osiągną przybliżoną konfluencję, wyjmij je z naczynia hodowlanego, rozcieńcz i umieść na świeżej płytce, aby umożliwić dalszy wzrost. Ta procedura subhodowli jest osiągana za pomocą procedury enzymatycznej zwanej trypsynizacją.
    1. Usunąć pożywkę przez aspirację. Aby oddzielić monowarstwę komórkową, dodaj 2 - 3 ml trypsyny w temperaturze pokojowej (maks. 18 - 20 °C), delikatnie wstrząśnij raz i natychmiast usuń trypsynę przez aspirację. Powtórz dwa razy. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3-4 minuty, aż zaczną się odrywać.
      nuta: Dobra trypsynizacja może być zauważona przez doświadczonego użytkownika jako małe otwory tworzące się w lekko nieprzezroczystej monowarstwie, gdy naczynie jest trzymane przy świetle. Ta dysocjacja może być również monitorowana za pomocą odwróconego mikroskopu; Takie podejście jest zalecane dla początkujących.
    2. Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając 10 ml GM i dobrze umyj naczynie za pomocą pipety, aby usunąć wszystkie komórki. Przenieść 1 ml zawiesiny na nową płytkę Petriego o średnicy 100 mm i dodać 9 ml GM (1:10 podział komórek).
      nuta: Pozostała zawiesina komórkowa może być wykorzystana do namnażania komórek (przeniesienie na inną szalkę Petriego o średnicy 100 mm), może być kriokonserwowana (patrz sekcja 2.3) lub może być policzona i posiana w eksperymentalnych szalkach lub studzienkach do oznaczania proliferacji lub do innych celów (patrz poniżej).
  3. Kriokonserwacja kultur pierwotnych OS i OSA
    nuta: Zamrozić jedną zlewającą się 100 mm szalkę Petriego w 4-5 kriowialiach. Proces kriokonserwacji musi być przeprowadzony szybko, ponieważ DMSO, który chroni błony komórkowe podczas zamrażania, jest toksyczny dla komórek w temperaturach niezamarzających.
    1. Oddzielić hodowle komórkowe od monowarstwy przez trypsynizację (patrz sekcja 2.2), osadzać komórki przez wirowanie przy 400 x g przez 5 minut, usunąć supernatant przez aspirację, a następnie szybko zawiesić osad komórkowy w FM.
    2. Podwielokrotność 1 ml tej zawiesiny na fiolkę kriogeniczną. Napełnione fiolki należy natychmiast umieścić w zamrażarce z płaszczem z 2-propanolu i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C O/N. Następnego dnia przenieść kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  4. Rozmrażanie linii komórkowych OS i kultur pierwotnych
    1. Rozmrozić linie komórkowe OS z magazynowania ciekłego azotu, szybko rozmrażając kriowialisty, umieszczając je w laboratoryjnej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść zawartość kriowiali do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać około 10 ml GM (patrz sekcja 2.3 w celu usunięcia DMSO). Usunąć supernatant przez aspirację i zawiesić osad komórkowy w 10 ml GM. Zawiesinę komórek umieścić na płytce Petriego o średnicy 100 mm i inkubować w inkubatorze o temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.

3. Test Sarkosfery do izolacji OS-CSC

UWAGA: Ten eksperyment jest przeprowadzany na OBS. Czas trwania tego eksperymentu jest związany ze zdolnością komórek do tworzenia tych kolonii sferycznych (sarkosfer), a zakres czasu wynosi 7, 14, 21 i 28 dni.

  1. Ustanowienie testu sarkosfery
    1. Przygotuj wcześniej komorę hemocytometru i wszystkie odczynniki.
    2. Usunąć pożywkę przez aspirację i oddzielić komórki od monowarstwy przez trypsynizację (patrz sekcja 2.2). Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek, pipetując w celu rozproszenia wszelkich grudek, a następnie zebrać 10 μl za pomocą końcówki do pipety o pojemności 20 μl.
    3. Zawiesinę komórek o objętości 10 μl należy natychmiast przenieść na krawędź komory hemocytometru, usunąć zawiesinę i pozwolić, aby została wciągnięta pod szkiełko nakrywkowe przez działanie kapilarne.
    4. Obserwuj komorę hemocytometru pod wpływem kontrastu fazowego. Wybierz obiektyw 10X i skup się na liniach siatki w komorze. Policz komórki leżące na tym obszarze o powierzchni 1mm2, korzystając z podpodziałów (również ograniczonych trzema równoległymi liniami) i pojedynczych linii siatki jako pomocy przy liczeniu.
    5. Zmierzyć stężenie i zastosować następujące równanie: 1 ml = n*104/z (n: całkowita liczba komórek we wszystkich policzonych kwadratach 1 mm2; z: liczba zliczonych kwadratów 1 mm2). Oblicz objętość zawiesiny komórek niezbędną do płytki całkowitej ilości 240 000 komórek podzielonych na 40 000 komórek dla każdego dołka w 6-dołkowej płytce o bardzo niskim przyłączeniu.
      nuta: Upewnij się, że pokryłeś odpowiednią liczbę komórek, posiewając komórki w jednym dodatkowym dołku. W związku z tym całkowita liczba komórek do posiewu wynosi 280 000 komórek.
    6. Przygotować 35 ml SGM, dodając 50% 2% MC (SGM-MC) do kolby o średnicy25 cm2. Przygotować całkowitą objętość SGM, biorąc pod uwagę dodatkowe 5 ml w celu nałożenia jednego dodatkowego dołka.
    7. Dodać obliczoną objętość zawiesiny komórek do SGM-MC przygotowanego w kolbie i delikatnie wymieszać za pomocą pipety w celu rozproszenia wszelkich grudek. Umieść komórki w 6-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu i użyj odwróconego mikroskopu, aby obserwować, jak komórki wyglądają po platerowaniu.
    8. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Co 3 dni dodawać świeże porcje bFGF i EGF do każdej studzienki, aby odświeżyć stężenie czynników wzrostu. Dodać 2 μl bFGF i 5 μl EGF, aby utrzymać oba w końcowym stężeniu 10 ng/ml w każdym dołku.
  2. Izolacja sarkosfer<br /> nuta: Monitoruj dobry postęp testu sarkosfery w 7, 14, 21 i 28 d, aby zdecydować, kiedy konieczne jest wyizolowanie powstałych sarkosfer.
    1. Przygotuj wszystkie odczynniki i sprzęt w okapie z przepływem laminarnym (Rysunek 3A, B). Zmontować jednostkę filtracyjną, umieszczając filtr siatkowy o średnicy 25 mm i siatkę 40 μm w uchwycie filtra membranowego; sterylizować w autoklawie (rysunek 4A-E).
    2. Dla każdej studzienki przenieść pożywkę zawierającą sarkosfery do strzykawki ze sterylnym uchwytem filtra membranowego za pomocą sterylnej pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl. Po całkowitym usunięciu pożywki zawierającej sarkosfery, umyj studzienkę, dodając 5 ml GM, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały przeniesione do strzykawki. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy wszystkie sarkosfery zostały odzyskane. Jeśli nie, kontynuuj, powtarzając ten krok .
    3. Zawiesinę należy filtrować za pomocą uchwytu filtra membranowego tylko grawitacyjnie bez ciśnienia, aby zapobiec uszkodzeniu kulek i uniknąć przechodzenia sarkosfer przez filtr, unikając w ten sposób utraty kulek. Delikatnie usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.
      nuta: Czasami filtracja jest blokowana przez obecność pęcherzyków powietrza w uchwycie filtra membranowego.
    4. Umyj jednostkę filtracyjną, dodając 10 ml GM do strzykawki i pozwalając jej przefiltrować bez ciśnienia, aby mieć pewność, że wyeliminowano pojedyncze komórki. Wyjmij jednostkę filtrującą ze strzykawki i umieść ją na szalce Petriego.
    5. Wyjmij filtr siatkowy z uchwytu filtra membranowego za pomocą pęsety Perry'ego i umyj go, delikatnie potrząsając pęsetą na szalce Petriego o średnicy 60 mm, aby uwolnić sarkosfery z plątaniny membrany. Następnie umieść membranę w studzience i potwierdź obserwacją mikroskopową, że w membranie nie ma już zaplątanych kulek. Jeśli kulki są nadal zaplątane w membranę, należy przeprowadzić kolejne płukanie zgodnie z opisem w kroku 3.2.4.
    6. Obserwuj uwolnione sarkosfery za pomocą mikroskopu. Uwolnione sarkosfery należy inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Powtórz wszystkie kroki dla każdego dołka 6-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie.

4. Linie OS-CSC

UWAGA: OS-CSC są otrzymywane z sarkosfer, które wykazują adherentną ekspansję poprzez ponowne wprowadzenie i rekulturację tych komórek w monowarstwie po ich posianiu na małych 60-milimetrowych szalkach Petriego, które nie są już w bardzo niskich warunkach przylegania.

  1. Kultury OS-CSC
    1. Aby umożliwić dalszy wzrost, subkulturuj komórki, gdy osiągną około 90% konfluencji na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Powtórz krok 2.2.1, aby ustalić kultury OS-CSC.
    2. Zatrzymaj trypsynizację, dodając 4 ml SCGM i dobrze umyj naczynie, używając pipety, aby odłączyć wszystkie komórki. Przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę Petriego o średnicy 100 mm i dodać 6 ml SCGM. Gdy OS-CSC osiągną 90% konfluencji, subkultura poprzez powtórzenie sekcji 2.2.
      nuta: W celu przeprowadzenia analizy in vitro w celu scharakteryzowania fenotypu podobnego do komórek macierzystych wyizolowanych OS-CSC, komórki można posiać na różnych typach płytek.
    3. Zachować ustalone linie OS-CSC przez kriokonserwację (powtórzyć wszystkie kroki z sekcji 2.3). Rozmrozić kriokonserwowane OS-CSC, powtarzając wszystkie kroki opisane w sekcji 2.4.

5. Analiza in vitro Aw celu scharakteryzowania OS-CSC:

  1. Przygotowanie komórek do immunofluorescencji
    nuta: Komórki są utrwalane w paraformaldehydzie, gdy osiągną odpowiedni stopień konfluencji w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Stopień zbieżności jest związany z rodzajem eksperymentów.
    1. Umieść OS-CSC w 24-dołkowej płytce w celu zbadania powierzchniowych markerów mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pomocą immunofluorescencji. Napraw komórki w każdym dołku, gdy osiągną 50-60% konfluencji. Wyjąć SCGM przez aspirację i umyć dwukrotnie w 24-dołkowej płytce DPBS.
    2. Pod kapturem chemicznym dodaj 500 μl 4% PFA/DPBS do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wyjmij PFA/DPBS i przemyj 3x ultraczystymdH2O. Pozostaw 24-dołkową płytkę do wyschnięcia w dygestorium.
  2. Immunofluorescencja markerów MSC
    nuta: Barwienie immunofluorescencyjne OS-CSC utrwalone w 4% PFA/DPBS można zastosować do zbadania fenotypu podobnego do MSC OS-CSC przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko CD44, Stro-1 i CD105. Poniższa metoda jest rutynowo stosowana przez autorów.
    1. W kapturze chemicznym przeniknij komórki, które zostały utrwalone w 4% PFA/DPBS, dodając 500 μl 0,2% Triton X-100/DPBS do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 30 minut. Delikatnie umyj komórki 3x za pomocą DPBS. Dodać 300 μl RNazy rozcieńczonej 1/1 000 z 2% BSA/DPBS do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Delikatnie umyj komórki 3x 2% BSA/DPBS. Wybarwić komórki w poszukiwaniu markerów MSC. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe tylko do studzienek wybranych jako kontrole dodatnie dla każdego przeciwciała.
      1. Dodać 300 μl anty-CD105 rozcieńczonego 1/10 z 2% BSA/DPBS, 300 μl anty-CD44 rozcieńczonego 1/10 z 2% BSA/DPBS, 300 μl anty-Stro-1 rozcieńczonego 1/10 z 2% BSA/DPBS i tylko 200 μl 2% BSA/DPBS do studzienek wybranych jako kontrole ujemne dla każdego przeciwciała.
      2. Inkubować komórki w wilgotnym środowisku w temperaturze 4 °C O/N. Przemyć studzienki 3x DPBS, a następnie dwukrotnie 2% BSA/DPBS.
    3. Ujawnij przeciwciała pierwszorzędowe, dodając specyficzne przeciwciała drugorzędowe.
      1. Dodać 300 μl anty-króliczej IgG (IgG anty-króliczej osła [H + L]) rozcieńczonej 1/100 z 2% BSA/DPBS do każdego dobrze wybranego jako kontrola pozytywna i ujemna dla CD44 i CD105. Dodać 300 μl FITC anty-mysi IG (FITC-królik anty-mysie IgG [H + L]) rozcieńczony 1/100 z 2% BSA/DPBS do każdego dobrze wybranego jako kontrola pozytywna i ujemna dla Stro-1. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Umyj studzienki 6x za pomocą DPBS.
    4. Wybarwić komórki z dodatnim markerem MSC dla aktyny cytoszkieletu, dodając 300 μl falloidyny rozcieńczonej 1/100 z 2% BSA/DPBS do każdego dobrze wybarwionego pod kątem immunofluorescencji markera MSC.
    5. Inkubować komórki przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć studzienki 3x DPBS, a następnie przemyć je dwukrotnie ultraczystymdH2O. Przystąpić do barwienia przeciwstawnego jąder po barwieniu immunofluorescencyjnym opisanym powyżej. Przygotować roztwór jodku propydu 10-5 M w DPBS (zapas 1,5 x 10-3 M) w dygestorium.
      1. Dodać 200 μl roztworu jodku propidyny do każdej studzienki zabarwionej zgodnie z powyższym opisem. Inkubować komórki przez 2 - 3 minuty w temperaturze pokojowej. Przemyć studzienki dwukrotnie ultraczystym dH2O.
        nuta: Powtórzyć wszystkie kroki opisane w sekcjach 5.1 - 5.2 na linii komórkowej HCT8, pierwotnej linii komórkowej raka jelita grubego z ciągłym różnicowaniem, która jest stosowana jako kontrola ujemna.
  3. Test różnicowania osteogennego
    UWAGA:     Różnicowanie osteogenne trwa 20 dni.
    1. Umieścić OS-CSC w płytkach 24-dołkowych o gęstości komórek 1 x 104 komórek/cm2 w SCCGM. Pozwól komórkom rosnąć w SCGM, aż osiągną 80-90% zbiegu w każdym dołku.
    2. Rozpocznij różnicowanie osteogenne od zmiany SCGM na OM. Pozwól komórkom rosnąć w OM i odświeżaj pożywkę co 3 - 4 dni. Zatrzymaj test różnicowania osteogennego po 10 dniach, aby ocenić obecność fosfatazy alkalicznej (ALP).
    3. Utrwalić komórki w 4% PFA/DPBS (patrz sekcja 5.1). Oceń fenotyp osteoblastyczny za pomocą barwienia cytochemicznego dla ALP i HA przy użyciu barwienia czerwienią S alizaryny.
    4. Barwienie cytochemiczne ALP
      nuta: Przygotuj mieszaninę barwników w okapie chemicznym bezpośrednio przed rozpoczęciem barwienia.
      1. Rozpuścić 40 mg soli Fast Blue BB lub Fast Red Violet LB w 50 ml Tris-HCl, pH 9 (roztwór A). Rozpuścić 5 mg soli sodowej fosforanu naftolu-AS-MX w 1 ml DMSO (roztwór B). Dodać roztwór B całkowicie do roztworu A i dobrze wymieszać, uzyskując roztwór C. Umyć komórki dwukrotnie DPBS.
      2. Dodać 500 μl - 1 ml roztworu C do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Monitoruj przebieg barwienia co 10 minut, obserwując komórki pod mikroskopem.
      3. Zatrzymaj barwienie, gdy komórki ALP-dodatnie staną się intensywnie zabarwione (na niebiesko z solą Fast Blue BB lub na czerwono z solą Fast Red Violet LB), co zwykle następuje w ciągu 30 minut. Przemyj komórki 3x ultraczystym dH2O, aby usunąć wszystkie pozostałości roztworu C. Jeśli obecny jest osad plamy, szybko umyj komórki absolutnym etanolem.
      4. Przystąpić do barwienia przeciwstawnego jąder po barwieniu ALP, jak opisano w krokach 5.2.5 i 5.2.5.1.
    5. Barwienie cytochemiczne czerwieni alizarynowej S
      nuta: Przygotuj mieszaninę barwników przed rozpoczęciem eksperymentu.
      1. Przygotować 2% Alizarin Red S (2 g Alizarin Red S w 100 ml ultraczystegoH2O). Dodaj 2,5% NH3 do 2% Alizarin Red S, aby osiągnąć pH 6,0. Przechowywać 2% roztwór Alizarin Red S w temperaturze 4 °C. Umyć komórki raz za pomocą DPBS.
      2. Dodaj Alizarin Red S do komórek tylko na kilka sekund.
      3. Umyć studzienki ultraczystymdH2O, aby kontrolować stopień zabarwienia; jeśli osady HA nie są intensywnie zabarwione, powtórzyć krok 5.3.5.2. Zatrzymaj barwienie, gdy osady HA staną się intensywnie czerwone, co zwykle następuje w ciągu kilku minut. Umyj studzienki ultraczystym dH2O.
  4. Różnicowanie adipogenne
    nuta: Czas trwania testu zależy od linii OS-CSC. Test może trwać 14 - 30 dni.
    1. Umieścić OS-CSC na płytkach 24-dołkowych o gęstości komórek 1 x 104 komórki/cm2 w SCGM. Pozwól komórkom rosnąć w SCGM, aż osiągną 80-90% zbiegu w każdym dołku. Zainicjuj różnicowanie adipogenne, zmieniając SCGM na AM. Pozwól komórkom rosnąć w godzinach porannych i odświeżaj je dwa razy w tygodniu.
    2. Zatrzymaj test różnicowania adipogennego, gdy widoczne są pęcherzyki lipidowe. Oceń fenotyp adipogenny przez barwienie czerwienią olejową O i przez barwienie przeciwstawne hematoksyliny dla jąder.
    3. Barwienie przeciwstawne hematoksyliny dla jąder
      UWAGA: Przygotuj mieszaninę barwników przed rozpoczęciem eksperymentu.
      1. Przygotować 5% roztwór hematoksyliny o nazwie Emallume Carazzi39. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C. Dodawać Emallume Carazzi tylko przez 2 minuty. Umyj studzienki ultraczystym dH2O.
  5. Test CFU
    nuta: Doświadczenie to należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
    1. Płytka OS-CSC na 100 mm szalkach Petriego o gęstości komórek 450 komórek/cm2 w CFUM. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 4 tygodnie. Odświeżaj CFUM dwa razy w tygodniu.
    2. Zabarwić CFU błękitem toluidyny. Policz kolorowe kolonie za pomocą odwróconego mikroskopu. Oblicz wydajność CFU według następującego wzoru: (liczba utworzonych kolonii/liczba zasianych komórek)*100.
  6. Analiza aktywności ALDH
    nuta: Aktywność ALDH oceniono za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego aktywności ALDH na dwóch liniach OS-CSC i na skończonej linii fibroblastów, która została użyta jako kontrola ujemna. Ten zestaw określa ilościowo aktywność enzymatyczną ALDH poprzez odczyt absorbancji przy 450 nm. Wszystkie badania zostały wykonane w trzech egzemplarzach.
    1. Oddzielić kultury komórkowe od monowarstwy przez trypsynizację (patrz sekcja 2.2). Komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 min. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
  7. Analiza cytometryczna przepływowa:
    nuta: Zawiesiny pojedynczych komórek są wymagane do optymalnego barwienia próbek do cytometrii przepływowej. Dla każdego badanego przeciwciała należy przygotować zawiesinę pojedynczej komórki. Oddzielić kultury komórkowe od monowarstwy przez trypsynizację (patrz sekcja 2.2).
    1. Umieścić zawiesinę komórek w stożkowej probówce, przeprowadzić liczenie komórek za pomocą komory liczącej Bürker, odwirować komórki przy 400 x g i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości buforu separacyjnego w celu uzyskania zawiesiny komórek o końcowym stężeniu komórek 1 x10,5 komórek/ml.
    2. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć osad buforem rozdzielającym. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    3. Komórki barwiące dla markerów MSC (tj. CD44, CD105 i Stro-1)40.
    4. Analizuj dodatnio zabarwione zawiesiny komórek w cytometrze przepływowym. Przeanalizować oznaczone próbki w ciągu 1 dnia. Próbki te inkubować w temperaturze 4 °C aż do analizy.
  8. Technologia RT-PCR (Protokół RT-PCR)
    1. Ekstrakcja i izolacja RNA
      1. Dodać 1 ml odczynnika do lizy do zamrożonych w komórkach zapakowanych próbek OS-CSC i poddać komórki lizie bezpośrednio w probówce, kilkakrotnie pipetując osad w górę i w dół.
      2. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Delikatnie usunąć sklarowany osad. Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać 200 μl chloroformu i szczelnie zamknąć probówkę. Potrząsać energicznie probówką przez 15 sekund i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Mieszanina rozdziela się na trzy różne fazy. RNA znajduje się wyłącznie w bezbarwnej górnej górnej fazie wodnej.
      4. Zachowując szczególną ostrożność, usuń tylko fazę wodną i przenieś tę fazę do nowej probówki, aby przystąpić do izolacji RNA. Dodać 500 μl izopropanolu do probówki zawierającej fazę wodną. Delikatnie potrząśnij tubką ręcznie. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
        nuta: Po odwirowaniu próbki można zobaczyć RNA, które tworzy żelowaty osad z boku i na dnie probówki.
      5. Usunąć supernatant z probówki, uważając, aby pozostawić osad RNA na dnie. Dodać 1 ml 75% etanolu do probówki. Ręcznie wirować probówkę przez kilka sekund, a następnie odwirować probówkę o stężeniu 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      6. Wyrzuć etanol i wysusz na powietrzu osad RNA. Gdy osad wyschnie, ponownie zawiesić osad RNA w wodzie wolnej od RNaz (10 - 50 μL), kilkakrotnie pipetując roztwór w górę iw dół.
      7. Oznaczyć wydajność i czystość RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru. Oceń integralność całkowitego RNA na standardowym 1% żelu agarozowym. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
    2. Odwrócona reakcja łańcuchowa polimerazy
      1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA z próbek 500 ng RNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji. Rozmrozić próbki RNA na lodzie i rozmrozić niezbędne roztwory zawarte w zestawie w RT. Przystąp do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta.
    3. Półilościowa reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy z polimerazą (RT-PCR)
      1. Wykonać wszystkie PCR, używając 1 μl cDNA dla każdej próbki jako matrycy w końcowej objętości reakcji wynoszącej 24 μl. Użyj sekwencji starterów wymienionych w tabeli 1 do amplifikacji genów Nanog, Oct 3/4, SOX2 i CD133.
      2. Oddzielić produkty RT-PCR za pomocą 1,8% elektroforezy w żelu agarozowym i zabarwić bromkiem etydyny. Fotografuj w świetle UV.

Wyniki

Próbki OS uzyskane poprzez aspirację cienkoigłową lub resekcję chirurgiczną niewielkiej części guza (Rysunek 1A, B) pozwalają na wyizolowanie tylko jednej linii OSA, jeśli są one przetwarzane precyzyjnie, zgodnie z opisem w sekcji Protokół (Rysunek 2A, B). Niestety, liczba komórek wyizolowanych z biopsji jest niska, a wydajność mieści się w przedziale 30 - 50%. Wydajność zależy od rodzaju i rozmiaru biopsji (Rysunek 5A, B). Komórki te muszą być traktowane z najwyższą precyzją. W konsekwencji potrzeba około jednego miesiąca, aby kultury pierwotne osiągnęły konfluencję w szalce Petriego 100 mm. Po tym czasie uzyskano linie OSA z dwóch próbek OS oznaczonych jako OSA5 i OSA6 (Rysunek 6A, B). Następnie konieczne jest spasażowanie pierwotnej linii komórkowej w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek do przeprowadzenia analizy charakterystyki oraz krio konserwacji linii komórkowych. W 3rd pasażu subkultury, gdy obie pierwotne linie komórkowe OSA osiągnęły konfluencję, zostają one wysiane na 6-dołkowe płytki ultra-low attachment do testu sarkosferycznego. Ten typ płytek jest stosowany, ponieważ pozwala na utrzymanie komórek w stanie zawieszenia, co zapobiega różnicowaniu komórek macierzystych indukowanemu przez adhezję, zapobiega podziałom komórek zależnych od kotwiczenia, a wreszcie ogranicza przyleganie do podłoża. Zatem ich zastosowanie pozwala na stworzenie stresujących warunków dla komórek nowotworowych, co jest niezbędne do selekcji CSC. 24 h po rozpoczęciu testu komórki wydają się być od siebie odizolowane (Rysunek 7). Po 7 dniach monitorowania postępu testu zaczynają formować się i stają się widoczne małe kolonie sferyczne (Rysunek 8). W 28 dniu w każdym dołku można zaobserwować kilka dużych kolonii sferycznych (Rysunek 9A, B). Po 28 dniach hodowli sarkosfery te duże kolonie sferyczne mogą zostać wyizolowane. Rysunek 10 przedstawia etapy izolowania sarkosfer z 6-dołkowych płytek ultra-low attachment i ponownego hodowania ich w warunkach adherentnych. Rysunek 11 przedstawia pływające kolonie sferyczne po izolacji. Duże kolonie sferyczne wysiane na standardowe płytki adherentne wykazują ekspansję adherentną po izolacji (Rysunek 12A, B). Komórki, które namnażają się z pojedynczych sarkosfer, są prawdopodobnie komórkami nowotworowymi o fenotypie podobnym do komórek macierzystych. Zatem po izolacji prawdopodobnie uzyskano OS-CSC. Komórki te nazwano OSA5-CSC oraz OSA6-CSC (Rysunek 13A, B).

Na tym etapie konieczne jest przeprowadzenie charakterystyki fenotypu przypominającego komórki macierzyste dla dwóch uzyskanych linii OS-CSC, zgodnie z powyższym opisem. Analizy w celu charakterystyki fenotypu przypominającego komórki macierzyste wykonano w 4tym pasażu subkultury po izolacji sarkosfer dla każdej linii OS-CSC. Dwie linie komórkowe, OSA5-CSCs i OSA6-CSCs, wykazały silną pozytywność w odniesieniu do markerów powierzchniowych MSC (CD105 i CD44) (Rycyna 14A, B i Rycina 15A, B), natomiast wykazały umiarkowaną pozytywność dla markera powierzchniowego MSC Stro-1 (Rycina 16A, B). Nasze obserwacje zostały potwierdzone przez negatywne wyniki uzyskane dla komercyjnej i zróżnicowanej linii komórek raka jelita grubego HCT8 (Rycina 14C, Rycina 15C, Rycina 16C). W linii komórkowej HCT8 zaobserwowano całkowity brak specyficznego i niespecyficznego barwienia dla tych markerów powierzchniowych.

Aby ocenić fenotyp MSC w przypadku obu linii OS-CSC, przeprowadzono również analizy cytometryczne. Obie linie OS-CSC wykazywały wysoki poziom CD44 i CD105. Jednakże w obu liniach komórkowych jedynie 1,14% komórek wykazuje ekspresję Stro-1. Wynik ten potwierdził zatem umiarkowaną obecność Stro-1, co wykazano w barwieniu immunofluorescencyjnym. Z kolei 99,62% komórek OSA5-CSC wykazywało ekspresję CD44, a 87,38% tych komórek wykazywało ekspresję CD105; 99,88% komórek OSA6-CSC wykazywało ekspresję CD44, a 95,79% tych komórek wykazywało ekspresję CD105. Dodatkowo obie linie komórkowe są CD45-.

Za pomocą RT-PCR oceniliśmy ekspresję 3 markerów ESC (Nanog, Oct 3/4, Sox2) oraz genu CD133, będącego kolejnym markerem CSCs. Zauważyliśmy, że wszystkie te geny były eksponowane w obu liniach OS-CSC (Rysunek 17). Testy różnicowania adipogennego i osteogennego wykazały zdolność obu wyizolowanych linii OSA-CSC do różnicowania się w osteoblasty (Rysunek 18A - D oraz Rysunek 19A - D) i w adipocyty (Rysunek 20A - D).

Ponadto test CFU (Rycina 21) wykazał dobrą wydajność klonogeniczną, wynoszącą 13% dla OSA5-CSCs i 14% dla OSA6-CSC. Kilka niedawnych badań wykazało, że wysokie poziomy aktywności ALDH są charakterystyczne dla różnych typów nowotworów. Parametr ten może być wykorzystany jako marker komórek macierzystych nowotworu i koreluje ze złym rokowaniem. Test aktywności ALDH wykazał, że obie linie OS-CSC posiadają wysokie poziomy aktywności ALDH (Rycina 22), podczas gdy aktywność ALDH w linii fibroblastów, która służyła jako kontrola negatywna w tym teście, znajdowała się na dolnej granicy oznaczalności.

Eksperyment na szalce Petri przedstawiający próbki A i B w celu porównania wzrostu komórek w pożywce hodowlanej.
Rycina 1. Przykłady próbek biopsji OS. (A). Próbka biopsji pobrana metodą aspiracji cienkoigłowej. (B). Próbka biopsji pobrana drogą chirurgicznej resekcji części guza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obsługa hodowli komórkowej pęsetą (A) oraz obraz mikroskopowy przedstawiający szczegóły próbki (B), eksperyment laboratoryjny.
Rycina 2. Mechaniczna dysagregacja próbki OS. (A) Fragmentacja próbki przy użyciu pęsety Perry'ego i lancetu. (B) Fragmenty zawieszone w CM (wskazane strzałką). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ chromatograficzny ze strzykawką w statywie do probówek do oczyszczania białek; metoda eksperymentalna.
Rycina 3. Sprzęt i materiały zużywalne niezbędne do izolacji sarkosfer.** (A). Cały sprzęt niezbędny do izolacji komórek. 1. Sterylna strzykawka ze sterylnym uchwytem filtra membranowego; 2. Dwa różne pożywki: GM oraz SCGM; 3. Sterylna szklana pipeta Pasteura. (B) Szczegół strzykawki zamontowanej na wsporniku, wraz z uchwytem filtra membranowego. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Proces montażu filtra; komponenty i konfiguracja filtracji laboratoryjnej; widoczny detal mikroskopowy.
Rysunek 4. Jednostka filtracyjna. Kilka komponentów niezbędnych do zmontowania jednostki filtracyjnej (A) (filtr siatkowy wskazany jest strzałką). Obserwacja w kontraście fazowym oczek o rozmiarze 40 µm (jedno oczko wskazane jest strzałką) filtra siatkowego (B). Powiększenie oryginalne: 10X. Zmontowana jednostka filtracyjna (C - D). Sterylna jednostka filtracyjna (E). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Porównanie kultur komórkowych; obraz mikroskopowy; lewa strona: gęsty wzrost komórek, prawa strona: odrywanie się komórek.
Rysunek 5. Pierwotne kultury komórkowe konwencjonalnego OS. Obserwacja w kontraście fazowym pierwotnych kultur komórkowych OS wysokiego stopnia złośliwości. W (A) widocznych jest kilka jasnych fragmentów kostnych, natomiast w (B) obecnych jest kilka małych, zaokrąglonych i pływających erytrocytów. Powiększenie oryginalne: 10X. Skala: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie hodowli komórkowych; obrazy mikroskopowe fibroblastów, analiza wysokiej gęstości vs niskiej gęstości.
Rysunek 6. Konwencjonalne linie komórkowe osteosarcoma (OSA). (A) OSA5 oraz (B) OSA6. Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie pierwotne: 10X. Odcinek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy komórek drożdży w procesie pączkowania, ukazujący podział komórkowy i wzrost populacji.
Rycina 7. Analiza sarkosfery OSA5 i OSA6. Po 24 h od rozpoczęcia analizy komórki unosiły się w zawiesinie i były odseparowane od siebie (komórki zaznaczono strzałkami). Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie oryginalne: 20X. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Tworzenie się kryształów pod mikroskopem; powiększony obraz ze strzałkami wskazującymi formacje.
Rysunek 8. Analiza sarkosfery OSA5 i OSA6 w 7. dniu. W 7. dniu badania można było zaobserwować kilka małych sferycznych kolonii otoczonych pojedynczymi komórkami. Sarkosfery (niektóre z nich wskazano strzałkami) wydają się unosić w medium lub lekko osadzać na dnie studzienki. Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie oryginalne: 20X. Rozmiar paska skali: 100 µm. Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

Obraz mikroskopowy skupisk i struktur komórkowych, prawdopodobnie wykazujący wzorce agregacji lub wzrostu.
Rysunek 9. Analiza sarkosfer OSA5 i OSA6 w 28 dniu. Po 28 d w każdym dołku płytek dla każdej linii komórkowej OSA, OSA5 (A) i OSA6 (B), obserwuje się kilka dużych, bursztynowych sarkosfer. Rozmiar paska: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment z hodowlą komórkową demonstrujący przygotowanie procesu oczyszczania białek w laboratorium.
Rysunek 10. Pasaże w celu izolacji sarkosfer. Przedstawiono etapy izolowania sarkosfer z płytek 6-dołkowych o ultra-niskim przywieraniu oraz ich ponownego hodowania w warunkach adhezyjnych. (A) Wszystkie urządzenia niezbędne do izolacji: 1. Jedna płytka 6-dołkowa o ultra-niskim przywieraniu z uformowanymi sarkosferami w każdym dołku, 2. strzykawka z uchwytem do filtra siateczkowego, 3. pipeta, 4. 1,000 µL sterylne końcówki, 5. 2 sterylne pęsety Perry’ego, 6. 2 różne pożywki hodowlane, 7. sterylna pipeta Pasteura, 8. szalki Petriego. (B) Zbieranie sarkosfer. Pożywkę znajdującą się w każdej studzience pobiera się za pomocą pipety ze sterylną 1,000 µL końcówka. (C) Należy zebrać zawiesinę do strzykawki. Zebraną zawiesinę przenosi się do strzykawki, aby rozpocząć proces filtracji naturalnej z wykorzystaniem uchwytu filtra membranowego.D) Filtracja naturalna. (E) Demontaż uchwytu filtra membranowego z strzykawki. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny uchwyt filtra zostaje rozłożony i umieszczony w czarce Petriego;F) Demontaż uchwytu filtra membranowego. Sarkosfery znajdują się w porach filtra siatkowego w uchwycie filtra siatkowego, dlatego należy je uwolnić za pomocą pęsety Perry'ego.G, H) Usuwanie sarkosfer z filtra membranowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy mikroorganizmu; podkreśla strukturę komórkową, wizualizację fluorescencyjną.
Rysunek 11. Izolacja sarkosfery. Izolowane sarkosfery unoszą się w medium w szalce Petriego o średnicy 60 mm. Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie oryginalne: 40X. Skala: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie wzrostu komórek pod mikroskopem; eksperyment pokazujący różnice strukturalne w próbkach A i B.
Rycina 12. Sarkosfera po izolacji. Sarkosfery z linii komórkowych OSA5 (A) i OSA6 (B) na początku ekspansji adherentnej po ponownym wprowadzeniu i rekułtury w monowarstwie w warunkach adherentnych 48 h po izolacji. Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie oryginalne: 20X. Rozmiar paska skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe z hodowli komórek macierzystych; A: Niestymulowane; B: Inicjacja różnicowania.
Rycina 13. Sarkosfery 7 dni po izolacji. Sarkosfery z linii komórkowych OSA5 (A) i OSA6 (B) wykazały adhezyjną ekspansję po ponownym wprowadzeniu i renowacji w monowarstwie w warunkach adhezyjnych 7 d po izolacji. Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie pierwotne: 20X. Skala: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające morfologię komórek; zielone filamenty aktynowe, czerwone jądra w fibroblastach.
Rycina 14. Barwienie immunofluorescencyjne na CD105. Barwienie immunofluorescencyjne na CD105 w liniach OSA-CSC OSA5-CSCs (A) i OSA6-CSCs (B) oraz w ciągłej linii komórkowej HCT8 (C), która posłużyła jako kontrola negatywna. LSCM w kolorach konwencjonalnych: zielony dla CD105 i czerwony dla cytoszkieletu. Powiększenie oryginalne: 10X. Skala: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym; metoda immunobarwienia, obrazy mikroskopowe A-C, struktura komórkowa.
Rysunek 15. Barwienie immunofluorescencyjne CD44. Barwienie immunofluorescencyjne CD44 w liniach OSA-CSC OSA5-CSCs (A) i OSA6-CSCs (B) oraz w ciągłej linii komórkowej HCT8 (C), która posłużyła jako kontrola negatywna. LSCM w standardowych kolorach: zielony dla CD44 i czerwony dla cytoszkieletu. Powiększenie oryginalne: 10X. Długość paska skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna; hodowle komórkowe znakowane markerami; czerwone i zielone znaczniki fluorescencyjne.
Rysunek 16. Barwienie immunofluorescencyjne Stro1. Barwienie immunofluorescencyjne przeciwko Stro-1 w liniach OSA-CSC OSA5-CSCs (A) i OSA6-CSCs (B) oraz w ciągłej linii komórkowej HCT8 (C), która posłużyła jako kontrola negatywna. LSCM w konwencjonalnych kolorach: zielony dla Stro-1 i czerwony dla cytoszkieletu. Powiększenie oryginalne: 10X. Odcinek skali: 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza Western blot wykazująca poziomy białek: Nanog, Oct3/4, Sox2, CD133, Beta-Actin.
Rysunek 17. Ekspresja jądrowych markerów ESC oraz genu CD133. RT-PCR wykazujący ekspresję Nanog, Oct 3/4, Sox2 i CD133 w OSA5-CSCs (A) oraz w OSA6-CSCs (B). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Proces różnicowania OSA5, OSA6-CSC, obrazy mikroskopowe, dni 0-10, analiza zmian komórkowych.
Rysunek 18. Test różnicowania osteogenicznego – ALP. Różnicowanie osteogeniczne w dniu 0 (A, B) i po 10 dniach (C, D) indukcji, określone poprzez cytochemiczne barwienie na ALP z użyciem Fast Blue BB. Na niebiesko komórki ALP+; na czerwono jądra komórkowe przebarwione jodkiem propidyny. Obserwacja kompozycyjna w świetle przechodzącym i w fluorescencji. Powiększenie pierwotne: 20X. Skala: 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe komórek macierzystych nowotworu w dniu 0 i 20, ukazujące zmiany komórkowe w czasie.
Rysunek 19. Test różnicowania osteogenicznego - HA. Różnicowanie osteogeniczne w dniu 0 (A, B) oraz po 20 d (C, D) indukcji, określone za pomocą barwienia cytochemicznego na hydroksyapatyt (HA) z użyciem Alizarin Red S. Komórki są skontrastowane w kolorze niebiesko-szarym, a ziarniste złogi HA są zabarwione na czerwono. Obserwacja w kontraście fazowym. Powiększenie oryginalne: 40X. Skala: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Różnicowanie OSA5-CSCs i OSA6-CSCs, dni 0 i 14, analiza morfologii komórek, obraz mikroskopowy.
Rysunek 20. Test różnicowania adipogenicznego. Różnicowanie adipogeniczne w dniu 0 (A, B) oraz po 14 d (C, D) indukcji, określone za pomocą barwienia cytochemicznego Oil Red O. Na czerwono zaznaczono pęcherzyki lipidowe (większe pęcherzyki wskazują strzałki czarno-czerwone; mniejsze pęcherzyki wskazują strzałki biało-czarne); na niebiesko/fioletowo jądra komórkowe przeciwbarwione hematoksyliną. Obserwacja w polu jasnym. Powiększenie oryginalne: 40X. Skala: 100 µM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost kolonii bakteryjnych na płytkach agarowych; eksperyment mikrobiologiczny; analiza hodowli; szalki Petriego.
Rycina 21. Test CFU. Test CFU linii OSA-CSC barwionych błękitem toluidynowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający aktywność ALDH w komórkach; wyższa w OSA5-CSC niż w OSA6-CSC; analiza statystyczna.
Rycina 22. Analiza aktywności ALDH. Kolorymetryczny test ALDH wykazał wysoki poziom aktywności ALDH w dwóch liniach OS-CSC, OSA5-CSC oraz OSA6-CSC, podczas gdy w skończonej zróżnicowanej linii komórek fibroblastów, FIB, nie stwierdzono tej aktywności. Słupki błędów: SD. **: p < 0.001 vs FIB; *: p < 0.01 vs FIB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

GenOligonukleotydySekwencja (5¹-3¹)Rozmiar amplikonu (bp) Tₐ (°C)
NanogStarter forward                    Starter reverseCCCAGCTGTGTGTACTCAAT GGTTCAGGATGTTGGAGAGTT8760
3 października 2/2Starter bezpośredni                    Starter odwrotnyGGGAGGAGCTAGGGAAAGA TCCTTCCTTAGTGAATGAAGAACT7760
Sox2Startery bezpośredni                    Startery odwrotnyTGCAGTACAACTCCATGACC  GGACTTGACCACCGAACC12555
CD133Starter prawy                    Starter lewyCCAGAAGCCGGGTCATAAAT ATTCACTCAAGGCACCATCC12756
bp, pary zasad wielkości amplikonu; Tₐ, temperatura przyłączania

Tabela 1. Szczegółowa lista sekwencji starterów dla Nanog, Oct 3/4, Sox2 i CD133 wraz z wielkością amplikonu i temperaturą przyłączania

Dyskusja

CSC mają kilka właściwości, które pozwalają na identyfikację tego konkretnego podzbioru komórkowego w masie guza. Na podstawie tych cech, takich jak nabyta oporność na cytotoksyczne środki chemioterapeutyczne na nadekspresję wielolekowych transporterów wypływu kasety wiążącej ATP28, 32, 33 lub na zwiększenie ekspresji enzymów detoksykacyjnych, takich jak ALDH32, na ekspresję określonego markera powierzchniowego, takiego jak CD133, CD44, CD34, CD90 i inne30, 34, 35, 41, opracowano kilka różnych metod izolacji CSC42-44. Jedną z tych technik jest test tworzenia kuli, który opiera się na zdolności CSC do wzrostu w warunkach nieprzylegających.

Zdolność tkankowych komórek macierzystych i CSC do tworzenia kul została po raz pierwszy opisana w badaniach nad identyfikacją nerwowych komórek macierzystych przez Reynoldsa i wsp.37. Następnie Gibbs i wsp.38 wykorzystali te badania, aby rozpocząć izolację CSC od guzów litych, w szczególności od mięsaków kostnych. Zdecydowaliśmy się na zastosowanie metody tworzenia kul zilustrowanej przez Gibbsa i wsp. do izolowania CSC z linii komórkowych OBS uzyskanych z konwencjonalnych biopsji OS. Dostosowaliśmy oryginalną metodę, aby poprawić wyniki tego testu i ułatwić jego odtwarzalność dla innych linii komórek nowotworowych. W odniesieniu do ustanowienia testu tworzenia kuli, sprawdziliśmy, że posiew 40 000 komórek/studzienkę jest dobrą praktyką utrzymywania komórek w izolacji na początku testu. Ta sztuczka jest bardzo ważna, aby uniknąć możliwości, że kuliste kolonie pochodzą z agregacji komórek, a nie ze szczególnej i wyłącznej zdolności pojedynczego CSC do wzrostu w warunkach nieprzylegających i tworzenia kulistej kolonii. Ta zdolność jest szczególnie krytycznym punktem tego testu.

Certyfikat wykazał również, że aby uzyskać dobre tempo tworzenia się sfery, wystarczy odświeżać porcje czynników wzrostu co 3 dni, a nie codziennie, jak opisano w oryginalnej metodzie. W tym badaniu ustaliliśmy również i obszernie opisaliśmy dobrą metodę izolowania kulistych kolonii, które utworzyły się podczas hodowli w warunkach nieprzylegających. Ten krok ma kluczowe znaczenie w tym teście, ponieważ bardzo ważne jest, aby spróbować wyizolować jak najwięcej kulek, które tworzą się w każdej studzience, nie uszkadzając ich. Ważne jest również, aby wyizolować tylko kulki, a nie pojedyncze komórki, które mogą pozostać w zawieszeniu przez czas trwania testu. Aby przezwyciężyć te krytyczne punkty, opracowaliśmy specjalną metodę izolacji, która, jak pokazano powyżej, dała dobre wyniki w izolacji CSC. Oczywiście istnieje możliwość, że nie wszystkie uformowane kule da się odzyskać, ale procent strat jest bardzo niski. Rzeczywiście, mamy również możliwość zastosowania filtra z porami 40 μm do izolowania kul po tym, jak staną się duże (utworzą około 100 - 200 komórek).

Ta izolacja zatrzymuje tworzenie się kulek, ale pozwala na filtrowanie pojedynczych komórek, części reszty metylocelulozy i najmniejszych kulek. Eliminacja ta odbywa się poprzez dokładną filtrację, jak opisano w protokole.

Co więcej, selekcja największych kulistych kolonii przez siatkę 40 μm z wynikającą z tego utratą najmniejszych kulistych kolonii pozwala na wyselekcjonowanie CSC o największej zdolności do tworzenia kulistych kolonii i o większej macierzystości. Wszystkie te modyfikacje zostały przeprowadzone, aby ulepszyć test i pomóc naukowcom badającym CSC w zrozumieniu i odtworzeniu najbardziej krytycznego kroku oryginalnej metody testu formowania kul.

Wśród badań dotyczących metod in vitro do izolowania CSC, niniejsze badanie miało na celu pokazanie, w jaki sposób ten dostosowany test tworzenia kulek może być dobrą metodą izolowania CSC z linii komórkowych OBS. Adaptacje do oryginalnej metody i szczegółowo opisana technika izolacji poprawiają jej skuteczność. W krótkim czasie można uzyskać dużą liczbę CSC i wykorzystać je do kilku eksperymentów. W związku z tym możliwe jest szybkie potwierdzenie fenotypów podobnych do łodyg, a w szczególności zbadanie fenotypu podobnego do podwójnej łodygi, który charakteryzuje OS-CSC. Dlatego ten zmodyfikowany test może być dobrą techniką izolowania CSC i badania ich biologii. W przyszłości metoda ta, z dodatkowymi adaptacjami, może być również stosowana do izolowania CSC z innych skończonych linii komórek nowotworowych uzyskanych za pomocą biopsji rzadkich guzów litych.

Możliwość izolowania CSC z rzadkich guzów litych, takich jak OS, nie tylko pozwala na ulepszenie badań nad tym konkretnym nowotworem, ale także rozszerza się na badania różnych typów nowotworów w celu opracowania lepszych metod ich izolacji oraz na przyszłe badania biologii tego ważnego podzbioru komórkowego. Dlatego, jak to zrobiliśmy w tym badaniu, ważne jest, aby ulepszyć metody izolacji CSC poprzez badanie biologii CSC, z ostatecznym celem znalezienia celów molekularnych i opracowania bardzo specyficznej terapii przeciwnowotworowej skierowanej przeciwko tej konkretnej podgrupie komórkowej, która jest prawdopodobnie odpowiedzialna za utrzymanie guza pierwotnego, rozwój jego nawrotu i pochodzenie przerzutów w kilku narządach. Badanie biologii CSC jest również ważne dla znalezienia terapii, które mogłyby być skuteczne w leczeniu nowotworów, takich jak OS, w przypadku których wskaźnik przeżycia po leczeniu neoadjuwantowym pozostaje bardzo niski.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco z Ca2+ i Mg2+ (DPBS)LONZABE17-513F_
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco  bez Ca2+ i Mg2+ (DPBS)LONZABE17-512F_
Trypsyna wieprzowa 1:250BD Difco215310Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie magazynowe: Proszek
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)Sigma-AldrichE4884Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: Kolagenaza w proszku
z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC0130Rozpuszczalnik: roztwór buforowy, pH 7,4. Stężenie zapasów: Proszek
Dimetylosulftlenek (DMSO)BDH Chemicals-VWR10323_
Mieszanina składników odżywczych F-12 HamSigma-AldrichF6636Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie w magazynie:
Sól trisodowa kwasu 2-fosfo-L-askorbinowegow proszku Sigma-Aldrich49752Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: 5 mg/ml
i beta;-Fosforan glicerolu sól disodowa pentahydratSigma-Aldrich50020Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: 1 M
insuliny. Ludzki rekombinowanySigma-Aldrich91077Rozpuszczalnik: NaOH 0,1 M. Stężenie podstawowe: 10 mM
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-AldrichI5879Rozpuszczalnik: DMSO. Stężenie magazynowe: 500 mM
IndometacynaSigma-AldrichI7378Rozpuszczalnik: DMSO. Stężenie magazynowe: 200 mM
DeksametazonSigma-AldrichD4902Rozpuszczalnik: DMSO. Koncentracja zapasów:  1 mM / 100 &mikro;M. Przechowywać w ciekłym azocie w celu utrzymania aktywności biologicznej
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524_
Płodowa surowica bydlęca Ameryka Południowa EUROCLONEECS0180L_
Penicylina-Streptomycyna (PEN-STREP) 10 000 U/mlLONZADE17-602E_
MetylocelulozaSigma-Aldrich274429Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie podstawowe: 2%
dichlorowodorek putresceinySigma-AldrichP5780Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie zapasów: Proszek
apo-Transferrin Sigma-AldrichT-1147Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: 25 mg / ml
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EFGF)Sigma-AldrichE5036Rozpuszczalnik: DPBS pH 7,4. Stężenie w magazynie: 10 i mikro; g / ml
Czynnik wzrostu fibroblastów-Zasadowy ludzkiSigma-AldrichF0291Rozpuszczalnik: DPBS + 0,2% BSA. Stężenie w magazynie: 25 i mikro; g/ml
Kwas selenowySigma-Aldrich211176Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie magazynowe: 30 mM
ProgesteronSigma-AldrichP8783Rozpuszczalnik: ETOH. Stężenie magazynowe: 10 mM
Błękit toluidynowy OSigma-Aldrich198161Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie w magazynie: Olej w proszku
Red OICN Biochemicals155984Rozpuszczalnik: 2-propanol. Stężenie magazynowe: Proszek
Naftol AS-MX Fosforan Sól disodowaSigma-AldrichN5000Rozpuszczalnik: DMSO. Stężenie w magazynie:
Powder Fast Blue BB SaltSigma-AldrichF3378Rozpuszczalnik: Tris HCL, pH 9,0. Stężenie w magazynie:
Powder Fast Red Violet LB SaltSigma-AldrichF3381Rozpuszczalnik: Tris HCL, pH 9,1. Stężenie magazynowe:
Albumina surowicy bydlęcej w proszku, frakcja V (BSA)Sigma-AldrichA-4503Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: 2%
Alizarin Red SICN Biochemicals100375Rozpuszczalnik: Ultrapure dH2O. Stężenie w magazynie:
Roztwór formaldehyduw proszku Sigma-Aldrich5339984%
Triton-100XMERCK11869Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: 0,2%. Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym
CalceinMERCK2315Rozpuszczalnik: DPBS . Stężenie w magazynie: 200 i mikro; g/ml
2-propanoluMERCK109634Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym
Ab-CD105                                                                                                      (Mysz monoklonalna [SN6] do CD105 (FITC)Abcamab11415Ciecz. Podanie:                            Cytometria przepływowa (Flow Cyt)
Ab-CD44                                                                            (Mysz monoklonalna                        [F10-44-2] na CD44 (PE/Cy7®) )Abcamab46793Płyn. Podanie:                            Cytometria przepływowa (Flow Cyt)
Ab-CD45                                                                                          (Mysz monoklonalna                        [MEM-28] do CD45 (PerCP)) Abcamab65952Płyn. Podanie:                            Cytometria przepływowa (Flow Cyt)
Ab-CD105                                                                                                      (Oczyszczone przeciwciało ludzkie CD105) InvitrogenMHCD10500rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
Ab-CD44                                                                            (Przeciwciało anty-CD44) AbcamEPR1013Y(ab51037)Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
Ab-Stro-1                                                                    (Mysz anty-STRO-1) Invitrogen398401rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Podanie:                            Cytometria przepływowa (Flow Cyt)            Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
Alexa Fluor 488                        (IgG przeciw królikom (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L))InvitrogenA-21206Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L)))Invitrogen61-6511Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Podanie:                            Cytometria przepływowa (Flow Cyt)            Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
Alexa Fluor 635 Falloidyna InvitrogenA34054Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
AutoMACS™ Uruchomiony bufor separacji MACS BuforMiltenyi130,091,221Ciecz. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
QIAzol® Odczynnik do lizyQIAGEN79306Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym
QUANTITECT®                                                         Zestaw do odwrotnej transkrypcjiQIAGEN205314_ 
Płyn ChlorophormSigma-AldrichC2432. Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym
Okap z przepływem laminarnymGELAIREBSB6A_ 
Kaptur chemicznyARREDI TECNICI                                                        WillaModello                                                                                                          DYNAMIKA_ 
WirówkaEPPENDORF5415R_ 
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna LSM 5109 Meta ZEISS_ _ 
Thermalcykler iCycler PCR BIORAD_ _ 
CyFlow® PRZESTRZEŃ (PARTEC)_ _ 
Odwrócony Micrposkop Aksjowert 200M ZEISS_ _ 
Pojemnik do zamrażania ,Nalgene_ _ 
Oryginalny Pipet-AidpbiBrand_ _ 
MikropipetyEPPENDORF_ _ 
Szklana pipeta PasteuraSIGMA_ _ 
VICTOR3&handel;                                            PERKIN ELMER_ _ 
Rury stożkowe                                                (15 i 50 ml)                                                       BD FALCON352096 (na 15 ml)                  352070 (na 50 ml)_ 
24-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnem poddanym TCBD FALCON353047_ 
6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z płaskim dnem i bardzo niskim mocowaniemCORNING3471_ 
Pipety serologiczne                                      (5 i 10 ml)                                                                                   BD FALCON357543 (na 5 ml)                          357551 (na 10 ml)_ 
Strzykawka (5mL)                                                         B|BRAUN4617053V_ 
szalka Petriego 100X20 mm                         BD SOKÓŁ353003_ 
Rö hren Rury                                        (3,5 mL, 55x12mm, PS)                             SARSTEDT55,484_ 
szalka Petriego 60X15 mm                               BD SOKÓŁ353004_ 
Kriowiale 1,5 mL                       NALGENE5000-1020_ 
Kolby do hodowli komórkowych 25 cm²            BD SOKÓŁ353014_ 
Filtr siatkowy nylonowy, hydrofilowyMERCKNY4104700_ 
Uchwyt filtra SwinnexMERCKSX0002500_ 
Pęseta Perry _ _ _ 
Lancet_ _ _ 
Odbicie___

Bibliografia

  1. Reddick, R. L., Michelitch, H. J., Levine, A. M., Triche, T. J. Osteogenic sarcoma: a study of the ultrastructure. Cancer. 45 (1), 64-71 (1980).
  2. Gatta, G., et al. Childhood cancer survival trends in Europe: a EUROCARE Working Group study. J. Clin. Oncol. 23 (16), 3742-3751 (2005).
  3. Olstad, O. K., et al. Molecular heterogeneity in human osteosarcoma demonstrated by enriched mRNAs isolated by directional tag PCR subtraction cloning. Anticancer. Res. 23 (3B), 2201-2216 (2003).
  4. Geller, D. S., Gorlick, R. Osteosarcoma: a review of diagnosis, management, and treatment strategies. Clin Adv Hematol Oncol. 8 (10), 705-718 (2010).
  5. Tang, N., Song, W. X., Luo, J., Haydon, R. C., He, T. C. Osteosarcoma development and stem cell differentiation. Clin. Orthop. Relat. Res. 466 (9), 2114-2130 (2008).
  6. Kempf-Bielack, B., et al. Osteosarcoma relapse after combined modality therapy: an analysis of unselected patients in the Cooperative Osteosarcoma Study Group (COSS). J. Clin. Oncol. 23 (3), 559-568 (2005).
  7. Meyers, P. A., et al. Osteosarcoma: a randomized, prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and high-dose methotrexate. J. Clin. Oncol. 23 (9), 2004-2011 (2005).
  8. Gorlick, R., et al. Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary. Clin. Cancer Res. 9 (15), 5442-5453 (2003).
  9. Hayden, J. B., Hoang, B. H. Osteosarcoma: basic science and clinical implications. Orthop. Clin. North Am. 37 (1), 1-7 (2006).
  10. Thomas, D., Kansara, M. Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation. J. Cell. Biochem. 98 (4), 757-769 (2006).
  11. Araki, N., et al. Involvement of the retinoblastoma gene in primary osteosarcomas and other bone and soft-tissue tumors. Clin. Orthop. Relat. Res. 270 (270), 271-277 (1991).
  12. Chou, A. J., Gorlick, R. Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions. Expert. Rev. Anticancer Ther. 6 (7), 1075-1085 (2006).
  13. Arndt, C. A. S., Crist, W. M. Common musculoskeletal tumorsof childhood and adolescence. N. Engl. J. Med. 341 (5), 342-352 (1999).
  14. Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: state of the art. Cancer. Treat. Rev. 32 (6), 423-436 (2006).
  15. Bacci, G., et al. Long-term outcome for patients with nonmetastatic osteosarcoma of the extremity treated at the istituto ortopedico rizzoli according to the istituto ortopedico rizzoli/osteosarcoma-2 protocol: an updated report. J. Clin. Oncol. 18 (24), 4016-4027 (2000).
  16. Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells. Cancer. Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
  17. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  18. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3 (7), 730-737 (1997).
  19. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumors: accumulating evidence and unresolved questions. Nat. Rev. Cancer. 8 (10), 755-768 (2008).
  20. Bapat, S. A. Evolution of cancer stem cells. Semin. Cancer Biol. 17 (3), 204-213 (2007).
  21. Rubio, D., et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer. Res. 65 (8), 3035-3039 (2005).
  22. Burns, J. S., et al. Tumorigenic heterogeneity in cancer stem cells evolved from long-term cultures of telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells. Cancer. Res. 65 (8), 3126-3135 (2005).
  23. Zhang, M., Rosen, J. M. Stem cells in the etiology and treatment of cancer. Curr. Opin. Genet. Dev. 16 (1), 60-64 (2006).
  24. Li, Y., et al. Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 100 (26), 15853-15858 (2003).
  25. Sell, S. Cellular origin of cancer: dedifferentiation or stem cell maturation arrest? Environ Health Perspect. 101 (Suppl 5), 15-26 (1993).
  26. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  27. Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24 (4), 372-376 (2000).
  28. Hochedlinger, K., Jaenisch, R. Nuclear reprogramming and pluripotency. Nature. 441 (7097), 1061-1067 (2006).
  29. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumor stem cells and drug resistance. Nat. Rev. Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  30. Ma, S., Lee, T. K., Zheng, B. J., Chan, K. W., Guan, X. Y. CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway. Oncogene. 27 (12), 1749-1758 (2008).
  31. Wu, C., et al. Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential. Cancer. Res. 67 (17), 8216-8222 (2007).
  32. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem. Cell. Rev. 7 (2), 292-306 (2011).
  33. Awad, O., et al. High ALDH activity identifies chemotherapy-resistant Ewing's sarcoma stem cells that retain sensitivity to EWS-FLI1 inhibition. PLoS One. 5 (11), e13943(2010).
  34. Fujii, H., et al. Sphere-forming stem-like cell populations with drug resistance in human sarcoma cell lines. Int. J. Oncol. 34 (5), 1381-1386 (2009).
  35. Di Fiore, R., et al. Genetic and molecular characterization of the human osteosarcoma 3AB-OS cancer stem cell line: a possible model for studying osteosarcoma origin and stemness. J. Cell. Physiol. 228 (6), 1189-1201 (2013).
  36. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonicprogenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
  37. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  38. Gibbs, C. P., et al. Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis. Neoplasia. 7 (11), 967-976 (2005).
  39. Beccari, N., Mazzi, V. Manuale di tecnica microscopic. Casa Editrice Dr. Francesco Vallardi Società Editrice Libraria. , 99-100 (1966).
  40. Majumdar, M. K., Thiede, M. A., Mosca, J. D., Moorman, M., Gerson, S. L. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J. Cell. Physiol. 176 (1), 57-66 (1998).
  41. Tirino, V., et al. Human primary bone sarcomas contain CD133+ cancer stem cells displaying high tumorigenicity in vivo. FASEB J. 25 (6), 2022-2030 (2011).
  42. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
  43. Martins-Neves, S. R., et al. Therapeutic implications of an enriched cancer stem-like cell population in a human osteosarcoma cell line. BMC Cancer. 12 (1), 139(2012).
  44. Tang, Q. L., et al. Enrichment of osteosarcoma stem cells by chemotherapy. Chin. J. Cancer. 30 (6), 426-432 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rakowe komórki macierzystebiopsja kostniakomięsakatest formowania sferpłytki ultra-low attachmentcytometria przepływowaimmunofluorescencjaanaliza RT-PCRmarker CD44marker CD105Nanog Oct3/4 Sox2
Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.