Artykuł metodologiczny

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

6 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Streszczenie

W obecnym badaniu połączyliśmy model 3D guza płuca in vitro z modelem in silico, aby zoptymalizować przewidywania odpowiedzi na lek w oparciu o specyficzne tło mutacyjne. Model jest generowany na bezkomórkowym rusztowaniu świni, które odtwarza cechy specyficzne dla tkanek w zakresie składu i architektury macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym błony podstawnej. Ustandaryzowaliśmy protokół, który umożliwia wytworzenie sztucznej tkanki nowotworowej w ciągu 14 dni, w tym trzy dni leczenia farmakologicznego. Nasz artykuł zawiera kilka szczegółowych opisów technik przesiewowych odczytu 3D, takich jak oznaczanie wskaźnika proliferacji barwienia Ki67, apoptoza z supernatantów za pomocą M30-ELISA oraz ocena przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT), które są pomocnymi narzędziami do oceny skuteczności związków terapeutycznych. Mogliśmy pokazać w porównaniu z hodowlą 2D zmniejszenie proliferacji w naszym modelu guza 3D, co jest związane z sytuacją kliniczną. Pomimo tej mniejszej proliferacji, model przewidywał prawidłowo odpowiedzi na leki ukierunkowane na EGFR zgodnie ze statusem biomarkera, jak wykazano przez porównanie linii komórkowych raka płuc HCC827 (zmutowany EGFR, KRAS typu dzikiego) i A549 (EGFR typu dzikiego, zmutowany KRAS) leczonych inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI) gefitynib. Aby zbadać odpowiedzi na leki bardziej zaawansowanych komórek nowotworowych, wyindukowaliśmy EMT poprzez długotrwałe leczenie TGF-beta-1, co oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego wimentyny / pan-cytokeratyny. Wykorzystano bioreaktor przepływowy, aby dostosować hodowlę do warunków fizjologicznych, co usprawniło wytwarzanie tkanek. Ponadto pokazujemy integrację odpowiedzi na leki po leczeniu gefitynibem lub stymulacji TGF-beta-1 - apoptoza, wskaźnik proliferacji i EMT - w modelu Boole'a in silico. Dodatkowo wyjaśniamy, w jaki sposób można przewidzieć reakcje komórek nowotworowych o określonym tle mutacyjnym na leki i strategie przeciwdziałania oporności. Jesteśmy przekonani, że nasze podejście 3D in vitro, zwłaszcza z jego ekspansją in silico, zapewnia dodatkową wartość dla przedklinicznych testów leków w bardziej realistycznych warunkach niż w hodowli komórkowej 2D.

Wprowadzenie

Przemysł farmaceutyczny boryka się z wysokimi wskaźnikami rotacji sięgającymi 95% w dziedzinie leczenia raka w fazie klinicznej, co powoduje ogromne koszty 1-5. Jedną z przyczyn tego deficytu jest fakt, że obecnie skuteczność potencjalnych nowych związków jest oceniana w badaniach przesiewowych na dużą skalę na hodowlach komórkowych 2D linii komórek nowotworowych lub w modelach zwierzęcych. Modele zwierzęce mają większą złożoność, ale istnieją zasadnicze różnice między myszami a ludźmi 6,7. W ciągu ostatniej dekady wygenerowano modele 3D raka przy użyciu różnych podejść, aby wypełnić lukę między hodowlą 2D linii komórek rakowych a złożonym guzem in vivo 6,8,9. Wpływ środowiska 3D na różnicowanie komórek, a także na sygnalizację, wykazano w kilku badaniach sprzed lat (np. Mina Bissell) 10,11. Obecnie dostępnych jest wiele modeli hodowli komórkowych 3D, takich jak kultury sferoidalne, hydrożele lub chipy mikroprzepływowe 12-16. Mimo że modele te zwiększają złożoność w porównaniu z konwencjonalnymi systemami hodowli 2D, w większości brakuje im mikrośrodowiska tkankowego, o którym wiadomo, że ma działanie wspomagające nowotwór, a także wpływa na skuteczność leków.

Aby rozwiązać ten problem, wygenerowaliśmy model 3D guza oparty na biologicznym rusztowaniu o nazwie SISmuc (podśluzówka jelita cienkiego + błona śluzowa), która pochodzi z pozbawionego komórek jelita czczego świni. W ten sposób zachowana jest architektura tkankowa i ważne składniki ECM, takie jak różne kolageny, a także struktura błony podstawnej 17. Ta unikalna cecha ma kluczowe znaczenie dla generowania modeli nowotworów nowotworowych, które powstają z nabłonka i stanowią około 80% guzów litych. Co więcej, tempo proliferacji w naszym modelach guza inżynierii tkankowej jest zmniejszone w porównaniu ze sztucznie wysokimi wskaźnikami osiąganymi w hodowli 2D. Ponieważ proliferacja jest ważnym parametrem w ocenie skuteczności leku, testowanie leków jest możliwe w naszym modelu w warunkach bardziej podobnych do nowotworów in vivo 17.

Aby ocenić potencjał naszego modelu do prawidłowego przewidywania skuteczności leków zależnych od biomarkerów, prezentujemy tutaj dane dla dwóch różnych linii komórkowych raka płuc, które różnią się statusem biomarkerów EGFR. Ten status mutacji zaczęto rutynowo określać u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Celowane leczenie TKI, takie jak inhibitor EGFR gefitynib, przeciwko nowotworom z aktywującą mutacją EGFR, wykazuje lepsze wyniki w porównaniu z chemioterapią opartą na platynie 18-21.

Ustaliliśmy kilka technik odczytu, które są istotne dla oceny skuteczności związku. Co więcej, po stymulacji TGF-beta-1 jesteśmy w stanie zbadać działanie związków w komórkach nowotworowych, które rozpoczęły proces EMT, który jest uważany za ważny krok w złośliwej transformacji 22,23 i który jest związany z opornością na leki 24.

Model guza 3D pozwala na monitorowanie specyficznych dla komórek odpowiedzi na celowane leczenie, chemioterapię lub kombinacje leków z dobrymi kontrastami. Aby jeszcze bardziej usprawnić i przyspieszyć badania przesiewowe leków oraz napotkać oporność, uzupełniono je symulacją in silico. Na podstawie kilku eksperymentów można przewidzieć odpowiedź guza in silico w odniesieniu do wyników dla pełnej gamy leków i ich kombinacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Dwuwymiarowa (2D) hodowla komórek

  1. Nabyć komercyjnie linię komórkową guza HCC827 (DSMZ). Hodować linię komórkową gruczolakoprzewodowego raka płuca HCC827 (zmutowany EGFR, KRAS typu dzikiego) w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 20% FCS. Wymieniać pożywkę co 2 - 3 dni. Przesiewać komórki dwa razy w tygodniu. Komórki są wykorzystywane do 20. pasażu.
  2. Nabyć komercyjnie linię komórkową guza A549 (DSMZ). Hodować linię komórkową raka płuca A549 (EGFR typu dzikiego, zmutowany KRAS) w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FCS. Hodowlę prowadzić zgodnie z powyższym opisem. Komórki są wykorzystywane do 20. pasażu.
  3. Regularnie (co 4 - 6 tygodni) testować komórki pod kątem zanieczyszczeń, takich jak zakażenia mycoplasma.
  4. Hodowanie komórek A549 lub HCC827 na szklanych zakrywkach
    1. Za pomocą pęsety umieścić 1 sterylną szklaną zakrywkę w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
    2. Zasiać 50 00 komórek guza obu linii komórkowych w objętości 50 µl odpowiednio w dołkach z szklanymi zakrywkami.
    3. Hodować komórki do osiągnięcia 70% konfluencji w standardowych warunkach hodowli (37 °C; 5% CO2). W tym czasie odsysać starą pożywkę za pomocą pipety Pasteura i dodawać 500 µl świeżej pożywki co 2 - 3 dni hodowli.

2. Generowanie systemów testowych guza na biologicznym rusztowaniu kolagenowym

  1. Warunki hodowli statycznej
    1. Przygotować zdekularyzowaną błonę podśluzową i śluzówkę jelita cienkiego (SISmuc) i zamocować ją pomiędzy dwoma metalowymi pierścieniami, tzw. koronami komórkowymi, zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji25.
    2. Zasiać 10 0 komórek linii HCC827 lub A549 w całkowitej objętości 50 µl na ścianę byłego światła jelita zamocowanego w koronach komórkowych.
    3. Pozostawić komórki nowotworowe do adhezji przez 2 hr w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Dodać 1 ml pożywki do wnętrza korony komórkowej oraz 1 ml na zewnątrz.
    4. Hodować model nowotworowy w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przez 14 dni. Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2 - 3 dni. W tym celu odessać pożywkę za pomocą pipety Pasteura i nalać 1 ml świeżego RPMI z odpowiednią ilością FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) do wnętrza korony komórkowej oraz 1,5 ml tej samej pożywki na zewnątrz.
  2. Warunki hodowli dynamicznej
    1. Przygotować system testowy zdekularyzowaną macierzą w koronach komórkowych oraz zasiać komórki zgodnie z opisem w podpunktach 2.1.1 do 2.1.3.
    2. Hodować model nowotworowy w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przez 3 dni.
    3. Złożyć autoklawowany bioreaktor i włożyć zasianą błonę SISmuc zgodnie z poprzednią publikacją 25.
    4. Nalać 45 ml RPMI z odpowiednią ilością FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) do kolby i podłączyć beziglowe urządzenie do pobierania próbek do systemu rurek pomiędzy bioreaktorem a kolbą z pożywką.
    5. Umieścić bioreaktor w inkubatorze, podłączyć go do pompy i hodować model nowotworowy przez kolejne 14 dni przy stałym przepływie pożywki (3 ml/min) w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    6. Wymienić całą pożywkę hodowlaną po 7 dniach. W tym celu przenieść bioreaktor z inkubatora pod komorę z laminarnym przepływem powietrza. Odessać pożywkę z kolby za pomocą pipety Pasteura. Unieść bioreaktor podczas odsysania, aby usunąć pożywkę z systemu rurek. Nalać 45 ml świeżej pożywki do kolby. Umieścić bioreaktor z powrotem w inkubatorze i podłączyć go do pompy.

3. Leczenie statycznego modelu guza gefitynibem

  1. Hodować model guza zgodnie z opisem w sekcji 2.1.
  2. W 1. dniu hodowli przygotować RPMI/FCS z 1 µM gefitinibu (2,5 ml dla każdej korony komórkowej). Odessać stare medium z dołków za pomocą pipety Pasteura i dodać 1 ml przygotowanego RPMI/FCS/gefitinib wewnątrz korony komórkowej oraz 1,5 ml tego samego medium na zewnątrz.
    UWAGA: Rozmrożony roztwór zapasowy gefitinibu można przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.
  3. Wymienić medium w 13. dniu zgodnie z opisem w podsekcji 3.2.

4. Stymulacja statycznego modelu guza TGF-beta-1 w celu indukcji EMT

  1. Hodować model guza zgodnie z opisem w sekcji 2.1.
  2. W 3. dniu hodowli przygotować pożywkę RPMI/FCS z dodatkiem 2 ng/ml TGF-beta-1 z nośnikiem (2,5 ml na każdy pierścień komórkowy). Odessać starą pożywkę z dołków za pomocą pipety Pasteura i dodać 1 ml przygotowanego RPMI/FCS/TGF-beta-1 do wnętrza pierścienia komórkowego oraz 1,5 ml tej samej pożywki na zewnątrz. Wymieniać pożywkę suplementowaną TGF-beta-1 co 2-3 dni aż do 14. dnia, zgodnie z opisem w punkcie 4.2.

5. Odczyty

  1. Pobieranie próbek do pomiarów metodą ELISA
    1. Pobrać próbki z supernatantów kultur statycznych (rozdział 2.1) i dynamicznych (rozdział 2.2) podczas leczenia gefitynibem (rozdział 3) w 1–14 dniach hodowli, zgodnie z informacjami zawartymi w Rysunek 2Dodatkowo należy pobrać próbkę przed rozpoczęciem leczenia (T0).
    2. W warunkach hodowli statycznej pobrać 100 µl próbkę z wnętrza korony komórkowej. W warunkach hodowli dynamicznej należy przykręcić strzykawkę do urządzenia do pobierania próbek i odessać 1 ml medium z systemu bioreaktora. Wszystkie zebrane nadsączki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia testu ELISA.
  2. Test M30-ELISA do ilościowego oznaczania apoptozy
    1. Aby określić ilość apoptozy w supernatantach, należy przeprowadzić test śmierci komórkowej zgodnie z instrukcjami producenta. Przed wykonaniem testu należy doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
    2. Wymieszaj wszystkie odczynniki na wirówce typu vortex. Rozpuść tabletkę do mycia w 50 ml świeżej wody dejonizowanej. Rozcieńcz koniugat HRP, dodając 9,2 ml buforu do rozcieńczania koniugatu, i wymieszaj. Pipetuj 25 µl standardu lub próbki na dołek.
    3. Dodaj 75 µl rozcieńczonego roztworu koniugatu HRP na dołek. Przykryć płytkę i inkubować na wytrząsarce przez 4 h w temperaturze pokojowej. Przemyć płytkę ręcznie, 5 razy za pomocą 250 µl przygotowanego roztworu do płukania.
    4. Dodaj 200 µl podłoża 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min. Dodać 50 µl do każdej dołka. Wstrząśnij mikropłytkę przez 10 s i pozostaw ją na 5 min przed odczytem absorbancji. Wyznacz absorbancję przy 450 nm w czytniku mikropłytek. Oblicz krzywą wzorcową oraz stężenia w próbkach, korzystając z odpowiedniego programu do przetwarzania danych typu ELISA, takiego jak Origin.
  3. Barwienie próbek
    1. Fiksacja, zatapianie w parafinie i przygotowanie skrawków modelu 3D
      1. Utrwalić zasiane SISmuc, stosując 2,5 ml 4% paraformaldehydu (PFA) na jedną koronę komórkową przez 2 h, a następnie zatopić w parafinie.
      2. Przygotować 3 µm przekroje tkanek do barwienia, zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą 25.
    2. Utrwalanie komórek hodowanych w warunkach 2D
      1. Po osiągnięciu 70% konfluencji komórki hodowane na szkiełkach podstawkowych w płytce 24-dołkowej należy przemyć raz buforem PBS, a następnie utrwalić za pomocą 500 µl 4% PFA/do studzienki przez 10 min.
      2. Usunąć PFA i przechowywać szklane okładki w płytce wielodołkowej przykryte PBS w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia barwienia.
    3. H&Barwienie E
      1. Przebrać rehydratowane skrawki metodą hematoksyliny i eozyny w celu wykonania barwienia przekrojowego zgodnie ze standardowymi protokołami.
    4. Barwienie immunofluorescencyjne modelu 3D
      1. W celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego należy wykonać odmaskowanie antygenów, umieszczając odparafinizowane i rehydratyzowane preparaty na szkiełkach w urządzeniu do gotowania na parze z uprzednio podgrzanym buforem cytrynianowym (pH 6,0) na 20 min.
        UWAGA: Patrz w tabeli Materiały i Sprzęt w celu przygotowania buforu cytrynianowego.
      2. Przenieś preparaty do buforu płuczącego (bufor PBS 0,5 M + 0,5% Tween), obrysuj skrawki pisakiem PAP, aby zminimalizować objętość wymaganych roztworów barwiących, a następnie umieść preparaty w komorze wilgotnościowej.
      3. Zablokować skrawki tkanek, stosując 5% surowicę z gatunku gospodarza przeciwciał wtórnych użytych w podrozdziale 5.3.4.6, przez 20 min w temperaturze pokojowej.
      4. Usunąć serum blokujące, delikatnie dotykając preparatów ręcznikiem papierowym, a następnie nanieść przeciwciało pierwszorzędowe na obrysowane sekcje w rozcieńczeniu zgodnie z instrukcją producenta (królicze anty-Ki67 1:10, królicze anty-vimentyna 1:10, mysie anty-pan-cytokeratyna 1:10). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °CW przypadku podwójnego barwienia należy zastosować przeciwciała pierwszorzędowe pochodzące od różnych gatunków gospodarzy.
      5. Niezwiązane przeciwciała należy starannie wypłukać buforem do płukania trzykrotnie przez 5 min.
      6. W celu wykrycia specyficznych wiązań antygen-przeciwciało, należy nałożyć na skrawki przeciwciała wtórne w rozcieńczeniu 1:40 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
      7. Trzykrotnie przemyj próbkę buforem płuczącym przez 5 min, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
      8. Zamontuj preparaty na szkiełkach przy użyciu medium wodnego zawierającego DAPI do kontrastowania jąder komórkowych i pozostaw do wyschnięcia przez noc.
    5. Barwienie immunofluorescencyjne komórek hodowanych w 2D
      1. Usunąć PBS i przykryć zasiane szkiełka podstawkowe roztworem 0,2% Triton-X10 w PBS przez 5 min w celu permeabilizacji. Przemyć szkiełka podstawkowe buforem myjącym (bufor PBS 0,5 M + 0,5% Tween) przez 5 min.
      2. Wykonaj kroki od 5.3.4.3 do 5.3.4.7. Wszystkie etapy przeprowadź w płytce wielodołkowej na platformie kołyszącej, a odczynniki usuwaj poprzez odwrócenie płytki.
      3. W celu zamontowania preparatu, nanieść kroplę medium wodnego zawierającego DAPI do kontrastowania jąder na niepowlekaną szkiełko przedmiotowe, a następnie za pomocą pincety przenieść na nią szkiełko nakrywowe tak, aby komórki stykały się z medium montującym. Pozostawić do wyschnięcia przed obrazowaniem.
  4. Oznaczenie indeksu proliferacyjnego
    1. Przeprowadź barwienie immunofluorescencyjne przeciwko Ki67 zgodnie z sekcją 5.3.4. lub 5.3.5.
    2. Wykonaj obrazy fluorescencyjne przekrojów tkankowych lub komórek hodowanych w 2D za pomocą mikroskopu odwróconego. Do obrazowania barwień DAPI oraz barwień Ki67 zastosuj odpowiednio różne filtry. Do kwantyfikacji wykorzystaj 10 obrazów przekrojów 3D lub 5 obrazów kultur 2D (powiększenie 20X) dla każdego wariantu, pobranych z niepokrywających się obszarów preparatu.
    3. Wyznaczenie liczby jąder komórkowych oraz liczby jąder wykazujących pozytywną ekspresję Ki67 w 2D
      1. Ręczne przeliczanie jąder wykazujących ekspresję Ki67 z wykorzystaniem wtyczki Cell Counter w oprogramowaniu Fiji 26Należy zatem otworzyć obraz i przejść do menu „Plugins” → „Analyze” → „Cell Counter”. Następnie należy nacisnąć „Initialize” i wybrać typ licznika. Klikaj w każde jądro dodatnie pod kątem Ki67. Liczba kliknięć jest wyświetlana obok wybranego typu licznika.
      2. W celu automatycznego zliczania całkowitej liczby jąder komórkowych należy stworzyć makro w programie Fiji 27,28Dostosuj makro dla każdego barwienia i linii komórkowej. Następnie zapoznaj się z przykładem tworzenia makra.
        1. Uruchom rejestrator makr. Otwórz obraz DAPI i przekonwertuj go na format 8-bitowy, klikając „Image” → „Type” → „8-bit”. Kliknij „Enhance contrast”, ustaw wartość „saturated” na „1” i wybierz „normalize”.
        2. Ustaw funkcję „unsharp mask” (maska wyostrzająca), aby wyostrzyć obraz. Użyj wartości „radius” (promień) równej „1” oraz „mask” (maska) równej „0,60”. Kliknij „auto threshold” (automatyczny próg), wybierz metodę „RenyiEntropy” oraz opcję „white objects on black background” (białe obiekty na czarnym tle), aby zbinaryzować obraz.
        3. Kliknij „Plugins” → „BioVoxxel” → „watershed irregular features”, ustawiając promień erozji (erosion radius) na „5”, aby rozdzielić komórki. Kliknij „Analyze” → „Analyze Particles” i ustaw parametr wielkości (size) na „0.02-Infinity”.
          UWAGA: Liczba cząsteczek/komórek została przedstawiona w tabeli podsumowującej jako licznik.
        4. Kliknij „Create”, aby zapisać makro do analizy kolejnych obrazów.
    4. Ręcznie określ liczbę jąder oraz liczbę jąder wykazujących pozytywną ekspresję Ki67 w 3D, zgodnie z opisem w podrozdziale 5.4.3.1.
    5. Oblicz średni indeks proliferacji (PI) zgodnie z następującym wzorem:
      Wzór na indeks proliferacji Σ(liczba jąder dodatnich dla Ki67/DAPI), równanie matematyczne.
      n = liczba obrazów (3D: 10, 2D: 5)

6. Generowanie modelu guza in silico i symulacja terapii anty-EGFR w komórkach HCC827

  1. Generowanie sieci przy użyciu oprogramowania do analizy sieci
    1. Należy wykorzystać różne znane bazy danych do wygenerowania sieci nowotworowej w oparciu o istotne eksperymentalne parametry odczytu oraz tło mutacyjne linii komórkowej HCC827.
    2. Otwórz oprogramowanie do analizy sieci 21 w celu wizualizacji sieci.
      1. Kliknij „File” → „New” → wpisz „JoVE_tumor models” → kliknij „OK”, aby wygenerować nową sieć. Kliknij „Square Closeup North” → „OK”, aby zwizualizować receptor w podwójnej błonie. Kliknij „Generic Protein”, aby zwizualizować węzły (=białka) jako prostokąty → wpisz „EGFR” → kliknij „OK”; powtórz tę czynność dla każdego węzła w sieci.
      2. Oznacz węzły w sieci: Prawy przycisk myszy → „Zmień kolor” & Kształt…" → wybierz dla węzłów EGFR i (EGF-EGFR) kod koloru „25,0,0” (kolor czerwony); dla węzłów c-MET i (c-MET) kod koloru „0,25,0” (kolor zielony); dla gefitynibu kod koloru „25,25,0” (kolor żółty); dla PI3K-Inh kod koloru „204,204,204” (kolor jasnoszary); dla MEK-Inh kod koloru „102,102,102” (kolor ciemnoszary); dla wszystkich pozostałych węzłów w sieci wybierz kod koloru „25,25,25” (kolor biały).
      3. Kliknij „Phenotype”, aby zwizualizować parametry odczytu w formie sześciokątów → wpisz „proliferation” → kliknij „OK” → kliknij prawym przyciskiem myszy → „Change Color” & Kształt…” → wybierz kod koloru „25,204,204” (kolor łososowy); powtórz tę czynność dla parametru apoptoza → wybierz kod koloru „25,51,204” (kolor fioletowy).
      4. Wizualizacja krawędzi (= oddziaływań): kliknij „State Transition” dla aktywacji (strzałki), kliknij „Inhibition” dla inhibicji (strzałki zakończone prostopadną kreską); powtórz tę czynność dla każdego oddziaływania w sieci.
    3. Kliknij „Plik” → „Zapisz jako…” → wpisz „JoVE_tumor models.xml” → kliknij „Zapisz”, aby zapisać wygenerowaną sieć sygnalizacyjną w formacie .xml.
  2. In silico Symulacja z użyciem SQUAD
    UWAGA: SQUAD reprezentuje topologię sieci jako dyskretny logiczny system boolowski (AND, OR, NOT) i przeprowadza analizę stanu stacjonarnego. Analiza stanu stacjonarnego odzwierciedla równowagę systemu oraz odpowiedź na bodźce sygnałowe (np.., podania leku lub mutacji).
    1. Otwórz SQUAD 17 oprogramowanie, kliknij „Load Network” → prześlij plik „JoVE_tumor models.xml”. Kliknij „Run analysis”:
      UWAGA: Następnie SQUAD stosuje funkcję wykładniczą do interpolacji łączności sieci Booleanowskiej, co umożliwia dynamiczną symulację zachowania sieci w czasie (kolorowe krzywe aktywności sigmoidalnej).
    2. Kliknij „Advanced” → „Perturbator”, aby napisać protokół symulacji. Symuluj anty-EGFR oporność: Kliknij „Edytuj protokół”
      1. Kliknij „perturbation” → użyj standardowego „initialstate=SS-4” (stan stacjonarny 4) → kliknij „Add”, aby dodać „new Constant Pulse” → wybierz parametr „state” → wybierz cel „FLIP” → wybierz czas „0” → wybierz wartość „0,4” → kliknij „OK”.
      2. Powtórz to: kliknij „Add” → wybierz parametr „state” → wybierz cel „c-MET” → wybierz czas „0” → wybierz wartość „0.4” → kliknij „OK”; kliknij „Add” → wybierz parametr „state” → wybierz cel „gefitinib” → wybierz czas „0” → wybierz wartość „1” → kliknij „OK”.
      3. Ustaw wartość stanu dla węzła aktywnego (EGF-EGFR): kliknij „activenode” → kliknij „Edit” → wybierz stan „0,8” → kliknij „OK”; dla wszystkich pozostałych węzłów: kliknij „Edit” → wybierz stan „0” → kliknij „OK”. Kliknij „OK”, aby zapisać protokół.
      4. Wyświetlanie wybranych krzywych: Przejdź do panelu „Options” → wybierz „(EGF-EGFR)”, „*(EGF-EGFR)”, „*MEK”, „caspases”, „(c-MET)”, „PI3K”, „gefitinib”, „apoptosis”, „proliferation”, „MEK-Inh” oraz „PI3K-Inh” w celu ich reprezentacji graficznej. Kliknij „Initialize” → „Run”, aby rozpocząć pełną symulację odpowiedzi systemu. Kliknij „Reset”, aby rozpocząć nową symulację.
    3. Symulacja leczenia z zastosowaniem połączonego inhibitora PI3K i MEK: kliknij „Edytuj protokół”
      1. Użyj tych samych parametrów węzła, które opisano w punktach 6.2.2.1 – 6.2.2.3. Kliknij „perturbation” → kliknij „Add”, aby dodać „new Constant Pulse” → wybierz parametr „state” → wybierz cel „PI3K-Inh” → wybierz czas „0” → wybierz wartość „1” → kliknij „OK”; kliknij „Add”, aby dodać „new Constant Pulse” → wybierz parametr „state” → wybierz cel „MEK-Inh” → wybierz czas „0” → wybierz wartość „1” → kliknij „OK”.
      2. Kliknij „OK”, aby zapisać protokół. Przejdź do panelu „Options” (Opcje): Użyj tych samych węzłów do reprezentacji graficznej, co opisano w punkcie 6.2.2.4. Kliknij „Initialize” (Inicjuj) → „Run” (Uruchom), aby rozpocząć pełną symulację odpowiedzi systemu. Kliknij „Reset” (Resetuj), aby zakończyć symulację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W oparciu o rusztowanie SISmuc (Rysunek 2A do C) opracowaliśmy znormalizowany protokół operacyjny dla generowania, stymulacji i leczenia trójwymiarowego systemu testowego guza (Rysunek 2D). Model ten umożliwia wyznaczenie indeksu proliferacji oraz kwantyfikację apoptozy za pomocą testu M30-ELISA, jak pokazano odpowiednio na Rysunku 1 oraz Rysunku 3. Rysunek 3 przedstawia reprezentacyjne barwienie H&E ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy połączony system badań nowotworów in vitro/in silico do przewidywania leczenia na podstawie biomarkerów. Model in vitro ocenia różne ważne aspekty działania związków, takie jak zmiany proliferacji komórek nowotworowych i apoptoza, na określonym tle mutacyjnym, które można również symulować in silico17. W tym miejscu przedstawiamy ustandaryzowany protokół generowania modelu guza 3D i testowania związków, w tym kwantyfikację proliferacji i apoptozy oraz ustanowienie predy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było sponsorowane przez Centrum Interdyscyplinarnych Badań Klinicznych (IZKF, grant BD247) Szpitala Uniwersyteckiego w Würzburgu oraz program Bayern Fit (przyznany Heike Walles).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Katedra Bioreaktorów Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Wü rzburg (GER)Konfiguracja bioreaktora
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fidżi)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Korony komórkoweKatedra Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Wü rzburg (GER)do statycznej hodowli 3D
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-To oprogramowanie zostało użyte do rysowania sieci.
Podstawowy roztwór buforowy cytrynianu (10x)produkcji własnej 42g/L Kwas cytrynowy jednowodny, 17,6 g/l Granulki wodorotlenku sodu w wodzie dejonizowanej, pH 6,0, przechowywany w temperaturze RT.
Bufor cytrynianowy roztwór roboczyw produkcji10% Bufor Budonowy roztwór podstawowy w wodzie demineralizowanej, przechowywany w temperaturze pokojowej.
Kwas cytrynowy jednowodnyVWR, Darmstadt (GER)1002441000stosowany jako bufor cytrynianowy
Szkiełka nakrywkoweVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (USA)SBA-0100-20
Bazy danych, takie jak KEGG, HPRD i QIAGEN (Genes & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ -Do wygenerowania topologii sieci wykorzystano różne znane bazy danych literatury.
Damska koszulka Luer Lug StyleMednet, Mü nster (GER)FTLT-1Konfiguracja bioreaktora
Gwint wewnętrzny Luer z gwintem sześciokątnym 5/16" do 1/4-28 UNFMednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A Konfiguracja bioreaktora
Surowica cielęca płoduBio& SPRZEDAM, Feucht (GER)FCS. ADD.0500nieinaktywowany termicznie
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 mg100 mM roztwór podstawowy z kolbą DMSO
Glas (Schott, GER) dostarczaną z przyłączem węża szklanegoWeckert, Kitzingen (GER)na
Histofix 4% (paraformaldehyd)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Złączka do wężaMednet, Mü nster (GER)CC-9Konfiguracja bioreaktora
Inkubator do bioreaktorówKatedra Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Wü Rzburg (GER)Konfiguracja bioreaktora
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Męski integralny pierścień blokujący LuerMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1AKonfiguracja bioreaktora
Komora wilgotnościowawykonana
Mysz anty Pan-CytokeratinSigma-Aldrich, Monachium (GER)   C2562-2MLKlon C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 +M20 + A53-B / A2, używany 1/100 do immunofluorescencji
Bezigłowy zawór wabowalny żeński LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCKonfiguracja bioreaktora, do pobierania próbek, O-ring sterylizowany promieniami gamma
MVQ 10 czerwony 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444O-ring duży, Konfiguracja bioreaktora
O-ring MVQ 70 czerwony 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170O-ring mały, Konfiguracja bioreaktora
Długopis PAP Dako, Hamburg (GER)S002
ParafinaCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Pompa perystaltycznaIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Konfiguracja bioreaktora
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-Aldrich, Monachium (GER)   D8537-6x500ml
Kaseta na rurki pompyIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Konfiguracja bioreaktora
Królik anty Ki67Abcam, Cambridge (Wielka Brytania)ab16667Klon SP6, używany do 1/100 dla IF
Królik anty VimentinAbcam, Cambridge (Wielka Brytania)ab92547używany 1/100 dla IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044Ciepły w 37 & C kąpiel wodna przed użyciem
Rurka silikonowaCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Konfiguracja bioreaktora
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich, Mü nchen (GER)30620-1KG-Rużywany do buforu cytrynianowego
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Tooprogramowanie zostało użyte do przeprowadzenia symulacji półilościowych.
Sterylny filtr powietrza, wielkość porów 0,2 i mikro; mSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYKKonfiguracja bioreaktora
Strzykawka Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649do pobierania próbek z bioreaktora
Płytki testowe do hodowli tkankowych: 6-,          12-, 24-, 96-dołkoweTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
Transformujący czynnik wzrostu-beta 1 (TGF-β 1) z sygnalizacją komórkową nośnika, Frankfurt (GER)8915LCroztwór podstawowy w sterylnym buforze cytrynianowym pH 3,0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mldo płukania buforu barwienia immunofluorescencyjnego
własnej zamówieniena zamówienie

Bibliografia

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowy model guza p ucaprzewidywanie odpowiedzi na lekkom rki z mutacj EGFRleczenie gefitynibemindeks proliferacji Ki67test ELISA M30 na apoptozprzej cie epitelialno mezenchymalnehodowla w bioreaktorze przep ywowymbooleowski model in silico

Powiązane artykuły