Artykuł metodologiczny

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

31K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53886

⸱

31 marca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 2Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, 3Department of Surgery, National Taiwan University Hospital and College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Streszczenie

Otyłość to nieograniczona epidemia na całym świecie. Odkrycie kontroli molekularnej w rozwoju tkanki tłuszczowej daje nadzieję na leczenie otyłości lub cukrzycy. Chociaż powstało wiele unieśmiertelnionych linii komórek adipogennych, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej z frakcji zrębowej naczyniowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej zapewniają niezawodny system komórkowy ex vivo znacznie bliższy rozwojowi tkanki tłuszczowej in vivo. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) są izolowane od prosiąt w wieku od 7 do 9 dni. Grzbietowy magazyn białego tłuszczu podskórnej tkanki tłuszczowej świń jest krojony, mielony i trawiony kolagenazą. Te pADSC wykazują duży potencjał różnicowania się w adipocyty. Co więcej, pADSC posiada również multipotencję, ocenianą za pomocą selektywnych markerów komórek macierzystych, w celu różnicowania się w różne typy komórek mezenchymalnych, w tym adipocyty, osteocyty i chondrocyty. Te pADSC mogą być używane do wyjaśniania przełączników molekularnych w regulacji klasycznego różnicowania adipocytów lub w kierunku innych typów komórek mezenchymalnych pochodzenia mezodermalnego. Co więcej, niedawno uzyskano rozszerzone linie do komórek pochodzenia ektodermalnego i endodermalnego. W związku z tym pADSC uzyskane w tym protokole stanowią obfite i możliwe do oceny źródło dorosłych mezenchymalnych komórek macierzystych o pełnej multipotencji do badania rozwoju tkanki tłuszczowej i zastosowania w inżynierii tkankowej medycyny regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Otyłość, obecna u około 30% populacji w USA, o wskaźniku masy ciała powyżej 30, stała się powszechnym zjawiskiem na całym świecie1. Otyłość ma tendencję do prowadzenia do powiązanych powikłań, w tym chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2 i raka2-4. Dlatego radzenie sobie z otyłością jest ważnym priorytetem. Otyłość objawia się masową ekspansją tkanki tłuszczowej i przypisuje się ją nadmiernemu spożyciu pokarmu i siedzącemu trybowi życia we współczesnym społeczeństwie. W związku z tym rozszyfrowanie transkrypcyjnej regulacji adipogenezy i lipogenezy może być obiecujące w leczeniu otyłości lub cukrzycy5.

3T3-L1, 3T3-F442A i inne linie komórek adipogennych myszy zostały zastosowane do badania adipogenezy lub lipogenezy podczas rozwoju tkanki tłuszczowej. Istnieją jednak pewne rozbieżności w mechanizmach regulacyjnych między liniami komórkowymi in vitro a zwierzętami in vivo6. Pierwotne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) we frakcji komórek zrębowo-naczyniowych mogą być izolowane bezpośrednio z białych tkanek tłuszczowych i indukowane do różnicowania. Różnicowanie ADSC w adipocyty najprawdopodobniej podsumowuje proces adipogenezy i lipogenezy w rozwoju tkanki tłuszczowej in vivo7.

Świnie są odpowiednim modelem zwierzęcym do badania adipogenezy i lipogenezy w rozwoju tkanki tłuszczowej. Nasze poprzednie badania na świniach8-10 pokazują, że ekspresja czynnika transkrypcyjnego wiążącego element regulatorowy steroli 1c (SREBP1c), ważnego czynnika transkrypcyjnego, o którym wiadomo, że moduluje transkrypcję syntazy lipogennych kwasów tłuszczowych, jest hamowana przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) w wątrobie i tkance tłuszczowej świni. Ekspresja SREBP1c świń zmniejszona przez PUFA in vivo i in vitro jest podobna do innych gatunków, takich jak ludzie i myszy11-13. Te badania in vitro na świniach dotyczą głównie zróżnicowanych adipocytów pochodzących od ADSC świń (pADSC). Dlatego ta pierwotna hodowla komórkowa pADSC może być wykorzystana jako niezawodny system komórkowy do badania rozwoju tkanki tłuszczowej lub innych zastosowań komórek macierzystych.

Protokół

Uwaga: Metoda ta została opracowana i wykorzystana w badaniach zgłoszonych wcześniej14-17 przez to laboratorium; z biegiem czasu metodologia została zmodyfikowana. Obecna procedura została przeprowadzona przy użyciu średnio 60 g tkanki tłuszczowej podskórnej świni pochodzącej od jednego prosięcia (w wieku od 7 do 9 dni) z wysiewem na 6-dołkowe płytki hodowlane. Wszystkie procedury przeprowadzano w RT, chyba że wskazano inaczej. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Narodowym Uniwersytecie Tajwańskim.

1. Przygotowanie pożywki do trawienia

  1. Pobrać podskórną tkankę tłuszczową z okolic szyi i grzbietu; od 40 do 80 g na prosię (w wieku 7 do 9 dni), w zależności od wielkości zwierząt. W tym protokole należy użyć 60 g tkanki tłuszczowej podskórnej pobranej od jednego prosięcia.
  2. Przygotować medium do trawienia: odważyć proszek kolagenazy II w ilości łącznie 54 000 jednostek i rozpuścić go w 90 ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, dla 60 g tłuszczu) w 100 ml butelce serologicznej (900 jednostek kolagenazy/1,5 ml DMEM/g tłuszczu).
  3. Delikatnie mieszać medium do trawienia na stołach wstrząsowych (100 rpm) przez co najmniej 15 min w celu rozpuszczenia, a następnie przefiltrować medium przez filtr 0,22 µm w celu sterylizacji. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Wyizolowanie podskórnej tkanki tłuszczowej u świń

  1. Przed użyciem wysterylizować wszystkie instrumenty, szkło oraz elementy plastikowe i ogrzać wszystkie pożywki do 37 °C.
  2. Uśmiercić prosię poprzez ogłuszenie elektryczne i upuszczenie krwi lub stosując metodę zgodną z lokalnymi przepisami IACUC. Przeprowadzić sekcję ostrożnie i niezwłocznie po uśmierceniu prosięcia.
  3. Położyć prosię na czystym stole operacyjnym (grzbietem do góry, brzuchem do dołu). Ogolić włosy z grzbietu prosięcia, usuwając wszystkie włosy od szyi do ogona oraz po obu stronach do linii środkowej.
  4. Trzykrotnie przemyć skórę grzbietową świni 7,5% powidonem jodowym (wykonując trzy nowe, niezależne mycia), a następnie pozostawić jod na powierzchni skóry na około 10 min.
  5. Usunąć powidon jodowy za pomocą wielokrotnych oprysków 70% etanolem. Użyć gazików lub ręczników papierowych nasączonych 70% etanolem, aby przetrzeć skórę w jednym kierunku, powtarzając czynność do czasu całkowitego usunięcia koloru powidonu jodowego.
  6. Za pomocą skalpela oddzielić grzbietową warstwę tłuszczu z tkanki tłuszczowej podskórnej wraz z przylegającą warstwą skóry od mięśni, podtrzymując tłuszcz i skórę pęsetą.
  7. Niezwłocznie zanurzyć warstwę tkanki tłuszczowej podskórnej z przylegającą skórą w wysterylizowanym zlewce (200 ml) zawierającym bezsurowicze DMEM.
  8. Spryskać zewnętrzną stronę zlewki z warstwą tłuszczu 70% etanolem i umieścić ją w laminarnym dygestorium do hodowli komórkowych. W dygestorium położyć dużą (40 cm x 30 cm) wysterylizowaną trójwarstwową folię ochronną. [Zastosowanie trzech warstw zapewnia ciągłą integralność.]
  9. Położyć tkankę skórą do dołu na folii ochronnej.
  10. Usunąć pozostałą tkankę mięśniową z tkanki tłuszczowej za pomocą pęsety i nożyczek, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanką mięśniową.
  11. Pokroić tłuszcz na kwadratowe kawałki (~7 cm X 7 cm) za pomocą skalpela lub nożyczek. Umieścić te fragmenty warstwy tłuszczu w nowym wysterylizowanym zlewce (200 ml) zawierającym bezsurowicze DMEM.
  12. Umieścić na folii ochronnej dostosowany uchwyt do plastrów z zamontowanym ostrzem tnącym ze stali węglowej (Rysunek 1). Wyjąć jeden kawałek tłuszczu ze zlewki i położyć go na tarczycą tnącej (warstwa skóry na górze, warstwa tłuszczu na dole).
  13. Pokroić warstwę tkanki tłuszczowej podskórnej na plastry o grubości około 1 mm. Odcinać warstwę tłuszczu od skóry jak najbliżej, unikając jednak nacięcia skóry.
  14. Posiekać pokrojoną tkankę tłuszczową nożyczkami tak drobno, jak to możliwe.
  15. Do kolby Erlenmeyera 250 ml lub butelki serologicznej z posiekaną tkanką tłuszczową dodać przefiltrowane medium do trawienia zawierające kolagenazę (54 000 jednostek kolagenazy/90 ml DMEM/60 g tłuszczu).
  16. Inkubować i mieszać kolbę Erlenmeyera przy 45 rpm w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przez 90 min w 37 °C, aby umożliwić trawienie tkanek przez kolagenazę.
    Uwaga: Kontrolować proces co 15–30 min, aby uniknąć nadmiernego trawienia. Proces trawienia jest zakończony, gdy medium do trawienia przyjmie formę zawiesiny bez znaczących grudek tkankowych.
  17. Dodać objętość medium hodowlanego (równą objętości medium do trawienia) zawierającego DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aby zatrzymać trawienie kolagenazą.

Rozłożone komponenty zespołu przyrządu; metalowe części ze śrubami, wskazujące proces montażu.
Rysunek 1. Dostosowany krojnik wykorzystywany do izolacji pADSC. Wypreparowane tkanki tłuszczowe z podskórnej tkanki tłuszczowej grzbietu świni składają się z warstwy tłuszczu z przytwierdzonymi warstwami skóry. Krojnik jest niezbędny do krojenia warstwy tłuszczu na plastry o grubości około 1 mm, unikając zbyt głębokiego nacięcia warstw skóry. Od lewej do prawej: uchwyt do plastrów, podkładka krojnika, ostrze krojnika ze stali węglowej oraz śruby. Po zmontowaniu ostrze krojnika jest wkładane pomiędzy uchwyt do plastrów a podkładkę krojnika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Izolacja pADSC z frakcji naczyniowo-stromalnej

  1. Przesiącz medium do trawienia zawierające strawione tkanki tłuszczowe przez pojedynczą warstwę szyfonu do czystej, wysterylizowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml lub serologicznej butelki 250 ml. Użyj pęsety, aby docisnąć środek szyfonu, co ułatwi i przyspieszy przepływ zawiesiny.
  2. Odciśnij i wykręć szyfon pęsetą, aby całkowicie przelać zawartość.
  3. Rozdziel medium do trawienia do czterech stożkowych probówek wirówkowych 50 ml (~40 ml medium na probówkę).
  4. Wiruj przy 700 x g przez 10 min, aby zebrać pellet komórek frakcji naczyniowo-stromo-tkankowej.
  5. Odlej nadsącz, nie naruszając pelletu, aby usunąć większość górnej warstwy tłuszczu zawierającej dojrzałe adipocyty. Przemyj pellet, dodając do każdej probówki 10 ml DMEM, a następnie resuspenduj pellet poprzez pipetowanie i delikatne wstrząsanie probówką.
  6. Wiruj przy 700 x g przez 6 min. Odlej nadsącz.
  7. Dodaj 10 ml buforu lizującego ACK, a następnie resuspenduj pellet poprzez pipetowanie. Pozostaw na 7 min (od 5 do 10 min) w RT w celu lizy erytrocytów we frakcji naczyniowo-stromo-tkankowej.
  8. Dodaj równą ilość DMEM (10 ml), aby zatrzymać reakcję, delikatnie wstrząsając probówką, a następnie wiruj przy 700 x g przez 10 min.
  9. Odlej nadsącz, dodaj do każdej probówki 10 ml DMEM, resuspenduj pellet poprzez wielokrotne pipetowanie i wiruj przy 700 x g przez 6 min. Powtórz czynność dwukrotnie.
  10. Zbierz i przefiltruj DMEM (łącznie 40 ml DMEM z 4 probówek odpowiadających 60 g tłuszczu) z zawiesiną komórek przez sito 100 µm do nowej stożkowej probówki 50 ml.
  11. Delikatnie pipetuj medium kilka razy, aby dobrze wymieszać, a następnie odmień 20 µl medium z komórkami i wymieszaj z 180 µl 0,4% roztworu błękitu trypanu (rozcieńczenie 1:10) w nowej probówce Eppendorfa 1,5 ml.
  12. Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie wysiej pADSC z gęstością 60 000 komórek/cm2 na naczynie hodowlane lub płytkę o pożądanej wielkości, używając medium hodowlanego zawierającego DMEM/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu antybiotyków penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B (P/S/A). Zazwyczaj pADSC wysiewa się na 6-dołkowe płytki do hodowli tkanek w celu różnicowania w adipocyty lub osteocyty. pADSC wysiewa się na szalki 10-cm w celu barwienia markerów powierzchniowych komórek macierzystych lub różnicowania w chondrocyty.
  13. Inkubuj płytki lub szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze z 5% CO2, aby umożliwić przywieranie komórek do podłoża.

4. Identyfikacja markerów powierzchniowych komórek macierzystych pADSC za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Po 24 h całkowicie usunąć pożywkę, dwukrotnie przemyć szalkę 10-cm roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zebrać komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując przez 5 min w 37 °C.
  2. Zneutralizować trypsynę-EDTA równą ilością pożywki hodowlanej (1 ml), zebrać komórki do nowej probówki stożkowej 15-ml, a następnie odwirować przy 400 × g przez 7 min.
  3. Odlać nadsącz. Osad dwukrotnie przemyć w 3 ml lodowatego buforu do mycia FCS (PBS zawierający 10% FBS), resuspensując komórki poprzez pipetowanie, a następnie wirując przy 400 x g przez 7 min.
  4. Resuspensować, policzyć i dostosować zagęszczenie pADSC do 106 komórek/ml w lodowatym buforze do mycia FCS. Przenieść komórki (100 µl do każdej probówki) do kilku nowych probówek stożkowych 15-ml i inkubować probówki zawierające pADSC w 4 °C przez 30 min z przeciwciałami sprzężonymi z fykoerytryną przeciwko CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE, CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE lub MHC II-PE w celu bezpośredniego barwienia. Zzatrzymać reakcję, przemywając komórki dwukrotnie w 10 ml buforu do mycia FCS i wirując przy 400 × g przez 7 min.
  5. Utrwalić i resuspensować komórki w buforze do utrwalania (PBS z 0,01% FBS i 1% formaldehydu) do cytometrii przepływowej zgodnie z instrukcjami producenta oraz naszą poprzednią publikacją18.

5. Różnicowanie pADSC w adipocyty, osteocyty i chondrocyty

  1. Różnicowanie pADSC w kierunku adipocytów
    1. Przygotowanie medium indukującego adipogenezę oraz medium do utrzymania adipocytów
      1. W celu przygotowania medium indukującego adipogenezę, należy przygotować 1 L bezsurowiczego DMEM/F12 (z antybiotykami 1% P/S/A) zawierającego następujące składniki: 1 ml roztworu inkubacyjnego insuliny (10 mg/ml bufor HEPES, pH 8), stężenie końcowe = 10 µg/ml; 1 µl roztworu T3 (3,3',5-jodotyronina, 1 mM w DMSO), stężenie końcowe = 1 nM; 200 µl roztworu transferyny (50 mg/ml podwójnie destylowanej H2O), stężenie końcowe = 10 µg/ml; 100 µl roztworu deksametazonu (10 mM w etanolu), stężenie końcowe = 1 µM; 100 µl roztworu rozyglitazonu (10 mM w DMSO), stężenie końcowe = 1 µM.
      2. Przygotować medium do utrzymania adipocytów z takimi samymi dodatkami jak w medium indukującym, z pominięciem deksametazonu.
    2. Proces różnicowania adipocytów
      Uwaga: Po wysianiu pADSC na płytki 6-dołkowe, pADSC osiągną konfluencję w ciągu 72 h.
      1. Po 3 dniach całkowicie usunąć medium, a następnie dodać 3 ml medium indukującego adipogenezę do każdego dołka. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Jest to dzień zero różnicowania.
      2. Po 3 dniach całkowicie usunąć medium indukujące adipogenezę i wymieniać je na 3 ml medium do utrzymania adipocytów co trzy dni. Dojrzałe adipocyty będą terminalnie zróżnicowane po około 9 dniach. Z zastosowaniem tego protokołu ponad 90% adipocytów ulega prawidłowemu zróżnicowaniu. Adipocyty te są gotowe do barwienia Oil Red O.
  2. Różnicowanie pADSC w kierunku osteocytów
    1. Przygotowanie medium indukującego osteogenezę: kompletne medium hodowlane (DMEM/F12 z 10% FBS i 1% P/S/A) zawierające 1 µM deksametazonu, 10 mM β-glicerynofosforanu i 50 µg/ml askorbinianu-2-fosforanu.
    2. Proces różnicowania osteocytów
      Uwaga: Po wysianiu pADSC na płytki 6-dołkowe, pADSC osiągną konfluencję w ciągu 72 h.
      1. Po 3 dniach całkowicie usunąć medium i dodać 3 ml medium indukującego osteogenezę do każdego dołka. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jest to dzień zero różnicowania.
      2. Wymieniać medium indukujące osteogenezę co trzy dni. Dojrzałe osteocyty uformują się do 14. dnia różnicowania. Osteocyty te są gotowe do barwienia Alizarin Red S.
  3. Różnicowanie pADSC w kierunku chondrocytów
    1. Przygotowanie medium indukującego chondrogenezę: αMEM zawierające 1% FBS, 6,25 µg/ml insuliny, 50 µg/ml askorbinianu-2-fosforanu oraz 10 ng/ml czynnika wzrostu TGF-β1.
    2. Proces różnicowania chondrocytów
      1. Po wysianiu pADSC na 10-cm naczynia hodowlane i inkubacji przez 24 h, całkowicie usunąć medium hodowlane i dwukrotnie wypłukać naczynia PBS.
      2. Przeprowadzić trypsynizację pADSC za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 min, a następnie zneutralizować 1 ml medium hodowlanego. Zebrać, policzyć i dostosować liczbę pADSC w 15-ml probówkach stożkowych do gęstości 2,5 × 105 komórek na probówkę. Do liczenia komórek należy użyć hemocytometru.
      3. Po wirowaniu przy 400 × g przez 7 min, odlać nadsącz, nie naruszając osadu, i dodać 1 ml medium indukującego chondrogenezę do 15-ml probówki. Probówkę umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jest to dzień zero różnicowania.
      4. Wymieniać medium indukujące chondrogenezę co trzy dni, nie usuwając komórek z dna. Dojrzałe chondrocyty uformują się w ciągu około 14 dni. Chondrocyty te są gotowe do barwienia Toluidine Blue O.

6. Barwienie zróżnicowanych adipocytów, osteocytów i chondrocytów

  1. Barwienie Oil Red O dla zróżnicowanych adipocytów
    1. W 9. dniu usunąć pożywkę do utrzymania adipocytów z 6-dołkowych płytek hodowlanych zawierających zróżnicowane adipocyty, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę PBS. [W kolejnych krokach należy dodać odpowiednią ilość określonych odczynników, aby pokryły każdy dołek płytki 6-dołkowej.]
    2. Utrwalić adipocyty w 10% roztworze formaliny przez co najmniej 10 min.
    3. Usunąć 10% roztwór formaliny i dwukrotnie przemyć płytkę wodą dwukrotnie destylowaną.
    4. Po dwóch przemyciach dodać do płytki hodowlanej 100% glikol propylenowy i pozostawić na 1 min.
    5. Usunąć 100% glikol propylenowy, a następnie dodać do płytki hodowlanej roztwór Oil Red O (0,5% w glikolu propylenowym). Pozostawić przez co najmniej 10 min na wstrząsarce kołyskowej przy łagodnym mieszaniu (100 rpm).
    6. Usunąć roztwór Oil Red O, a następnie zastąpić go 60% glikolem propylenowym. Pozostawić na 1 min.
    7. Usunąć 60% glikol propylenowy, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę wodą dwukrotnie destylowaną.
    8. Zastąpić wodę 10% roztworem formaliny. Zbarwione krople lipidów wewnątrz adipocytów są gotowe do obserwacji pod mikroskopem świetlnym.
    9. Ilościowe oznaczenie wewnątrzkomórkowego Oil Red O (opcjonalne kroki poniżej): po obserwacji mikroskopowej usunąć 10% roztwór formaliny i dwukrotnie przemyć płytkę wodą dwukrotnie destylowaną.
    10. Całkowicie odlać płyn z płytki i dodać 500 µl izopropanolu do płytki 6-dołkowej.
    11. Pozostawić izopropanol w płytce 6-dołkowej na łagodnej wstrząsarce kołyskowej (100 rpm) przez co najmniej 10 min w celu rozpuszczenia barwnika Oil Red O.
    12. Odssać izopropanol zawierający Oil Red O i rozdzielić go na płytkę 96-dołkową. Ilość wyekstrahowanego Oil Red O oznaczyć spektrofotometrycznie przy 510 nm.
  2. Barwienie Alizarin Red S dla zróżnicowanych osteocytów
    1. W 14. dniu usunąć pożywkę do indukcji osteocytów z płytek 6-dołkowych zawierających zróżnicowane osteocyty i dwukrotnie przemyć płytki PBS. [W kolejnych krokach należy dodać odpowiednią ilość określonych odczynników, aby pokryły każdy dołek płytki 6-dołkowej.]
    2. Utrwalić osteocyty w 10% roztworze formaliny przez co najmniej 10 min.
    3. Usunąć 10% roztwór formaliny z każdego dołka i dwukrotnie przemyć płytkę wodą dwukrotnie destylowaną.
    4. Po dwóch przemyciach dodać do płytki 6-dołkowej 2% roztwór Alizarin Red S (pH = 4,1-4,3) i pozostawić przez co najmniej 15 min na łagodnej wstrząsarce kołyskowej (100 rpm).
    5. Usunąć roztwór Alizarin Red S, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę wodą dwukrotnie destylowaną.
    6. Zastąpić wodę 10% roztworem formaliny. Osteocyty są gotowe do obserwacji pod mikroskopem świetlnym.
  3. Barwienie Toluidine Blue O dla zróżnicowanych chondrocytów
    1. W 14. dniu odessać pożywkę do indukcji chondrocytów z 15 ml probówki stożkowej, nie usuwając osadu zróżnicowanych chondrocytów z dna probówki, i dwukrotnie przemyć probówkę PBS. [W kolejnych krokach należy dodać odpowiednią ilość określonych odczynników, aby pokryły chondrocyty na dnie probówki lub na szkiełku z przekrojem.]
    2. Utrwalić chondrocyty w 10% roztworze formaliny przez co najmniej 10 min.
    3. Usunąć 10% roztwór formaliny z każdej probówki i dwukrotnie przemyć probówkę wodą dwukrotnie destylowaną.
    4. Po dwóch przemyciach zatopić pellety w związku OCT i wykonać przekroje kriostatem o grubości 5 µm.
    5. Zbarwić szkiełko z przekrojami z kriostatu roztworem Toluidine Blue O (0,1% o pH 4,1).
    6. Usunąć roztwór Toluidine Blue O, a następnie dwukrotnie przemyć przekrój wodą dwukrotnie destylowaną.
      Uwaga: Chondrocyty na szkiełkach są gotowe do obserwacji pod mikroskopem świetlnym.

Wyniki

Komórki pADSC pochodzące z grzbietowej tkanki tłuszczowej podskórnej świni zostały wysiane na płytki lub naczynia hodowlane, co przedstawiono na Ryc. 2. Morfologia pADSC pochodzących z frakcji naczyniowo-stromalnej jest podobna do ADSC myszy lub człowieka. Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu subkonfluentne pADSC przylegają do podłoża i wykazują rozszerzoną morfologię fibroblastopodobną (Ryc. 2A). Komórki pADSC osiągają konfluencję w ciągu 72 h i są gotowe do różnicowania w adipocyty lub inne komórki typu mezenchymalnego (Ryc. 2B). pADSC wykazują silny potencjał adipogenny po indukcji chemicznej, a dojrzałe adipocyty można zaobserwować po 9 dniach różnicowania, przy czym ponad 90 % pADSC ulega różnicowaniu adipogennemu (Ryc. 2C).

Aby określić charakterystykę pADSC uzyskanych zgodnie z niniejszym protokołem, markerów powierzchniowych pADSC poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Rysunku 3, wykazano wysoką ekspresję markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych, w tym CD29, CD44, CD90 i MHC I (lub HLA I). Negatywne markery powierzchniowe, takie jak CD4a, CD31, CD45 i MHC II (lub HLA II), były ledwo wykrywalne w pADSC uzyskanych w tym protokole (Rysunek 3). Wyniki te dowodzą, że pADSC wykazują charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych bez istotnej kontaminacji endotelialnymi lub krwiotwórczymi komórkami macierzystymi, w tym progenitorami mieloidalnymi lub limfoidalnymi.

Aby dodatkowo potwierdzić, że pADSC reprezentują mezenchymalne komórki macierzyste, zbadano ich wielopotencjalność poprzez różnicowanie w adipocyty, osteocyty i chondrocyty. Adipocyty, osteocyty i chondrocyty te zostały zabarwione odpowiednio specyficznymi barwnikami: Oil Red O, Alizarin Red S i Toluidine Blue O (Rysunek 4). Dane te wskazują, że opisany protokół pozwolił na uzyskanie pADSC, które zachowały wielopotencjalność z pełnymi cechami przypominającymi progenitorów typu mezenchymalnego.

Morfologia hodowli komórkowej pod mikroskopem świetlnym; komórki fibroblastyczne; wyniki analizy mikroskopowej.
Rycina 2. Morfologia pADSC z regionu tkanki tłuszczowej grzbietu świni. (A) Subkonfluentne pADSC przylegające i rozrastające się po 24 h od wysiania na 6-dołkową płytkę hodowlaną. (B) pADSC osiągające konfluencję po 72 h od wysiania na 6-dołkową płytkę hodowlaną. (C) Dojrzałe adipocyty zaobserwowane po 9 dniach różnicowania adipogennego pADSC. Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 100 x przy użyciu mikroskopii fazowo-kontrastowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histogramy cytometrii przepływowej dla markerów pozytywnych (CD29, CD44, CD90, MHC I) i negatywnych (CD4a, CD31).
Rysunek 3. Identyfikacja powierzchniowych markerów komórek macierzystych pADSC. 1 x 105 pADSC inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami, a następnie poddano analizie markerów komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej. Liczby wskazują procent zabarwionych komórek w populacji (kolor czerwony) w porównaniu z kontrolą niezabarwioną. Oś x reprezentuje względną intensywność fluorescencji. Oś y reprezentuje populację komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Różnicowanie komórek; obrazy mikroskopowe; adipogeneza, kalcyfikacja, barwienie proteoglikanów; skala 200µm.
Rycina 4. Wielopotencjalne różnicowanie pADSC. Wielopotencjalność pADSC określono poprzez różnicowanie pADSC w (A) adipocyty, (B) osteocyty i (C) chondrocyty, a następnie barwienie odpowiednio reprezentatywnymi barwnikami: Oil Red O, Alizarin Red S oraz Toluidine Blue O. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopii kontrastowej w powiększeniach odpowiednio (A) 100 x, (B) 200 x oraz (C) 100 x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiamy niezawodny system komórkowy do badania rozwoju tkanki tłuszczowej w pierwotnej hodowli komórkowej pADSC. W porównaniu z innymi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi, metoda ta zapewnia wygodny sposób izolowania dużych ilości wysokiej jakości dorosłych mezenchymalnych komórek macierzystych, które można zastosować do badania procesów różnicowania adipocytów lub innych linii mezenchymalnych związanych z rozwojem zwierząt in vivo. Krytycznym zmodyfikowanym krokiem w tym protokole jest to, że wyprowadzamy pADSC przy użyciu prosięcia w wieku od 7 do 9 dni, ponieważ jest on łatwy w obsłudze dla małego prosięcia w porównaniu ze starszymi świniami i podobnie jak w przypadku innych gatunków19,20, wydajność i wielomoc pADSC zmniejsza się wraz z wiekiemświni 21 lat.

Potencjalne źródła komórek macierzystych obejmują embrionalne komórki macierzyste (ESC), indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) oraz dorosłe komórki macierzyste po urodzeniu. Ograniczeniem ADSC, klasyfikowanych jako dorosłe multipotencjalne komórki macierzyste, jest to, że multipotencja dorosłych komórek macierzystych w różnicujących się rozbieżnych liniach jest stosunkowo ograniczona w porównaniu z ESC lub iPSC. Jednak kwestie etyczne dotyczące wyprowadzania ESC i onkogennych właściwości iPSC ograniczają stosowanie ESC i iPSC22,23. Dlatego wielu badaczy skupiło się na dorosłych komórkach macierzystych, starając się zwiększyć pluripotencję. Najczęstszym źródłem dorosłych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), które jest od dawna badane, są mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego24. Jednak pobieranie szpiku kostnego jest uważane za stosunkowo bolesną procedurę. Innym problemem jest to, że wydajność komórek macierzystych ze szpiku kostnego jest skończona. Aspiraty szpiku kostnego dają średnio 6 × 106 komórek jądrzastych na ml, a MSC stanowią tylko 0,001 do 0,01% wszystkich komórek jądrzastych. Po rozważeniu tych wad sugeruje się, że ADSC jest mniej natrętnym źródłem pozyskiwania multipotencjalnych komórek macierzystych25,26.

Ograniczenia w stosowaniu ADSC w medycynie regeneracyjnej są zależne w dużej mierze od wydajności i jakości komórek. W związku z tym znaczenie zatrudnienia świń do izolacji ADSC w tym protokole polega na uzyskaniu dużej ilości wysokiej jakości dorosłych komórek macierzystych. Świnia jest użytecznym modelem zwierzęcym reprezentującym ludzi ze względu na porównywalną wielkość narządów oraz wiele fizjologicznych i biochemicznych podobieństw między gatunkami27-30. Pozyskiwanie hADSC od firm komercyjnych jest kosztowne i w wielu przypadkach komórki zostały zmanipulowane, pasażowane lub kriokonserwowane. Pozyskiwanie ludzkich próbek klinicznych jest stosunkowo trudne ze względu na kwestie etyczne, a produkcja ADSC jest ograniczona. Otrzymujemy około 6 x 105 hADSC na g tłuszczu po trawieniu kolagenazą. Ze 100 g tkanki tłuszczowej kobiecej piersi (średnia próbka) można pobrać łącznie 6 x 107 komórek. Używając pojedynczej myszy, wydajność jest jeszcze bardziej ograniczona. W sumie 1 x 106 komórek można pobrać z 0,4 g podskórnej pachwinowej tkanki tłuszczowej myszy z obu nóg dorosłej myszy FVB (6-8 tygodni). Jednak u jednej świni (w wieku od 7 do 9 dni) można łatwo pobrać łącznie 2 x 108 komórek z 60 g podskórnej tkanki tłuszczowej uzyskanej z grzbietowego magazynu tłuszczu. PADSC wyprowadzone w tym protokole mają pełną multipotencję typu mezenchymalnego i odpowiednie markery mezenchymalnych komórek macierzystych. Dlatego pADSC są korzystnym źródłem do pozyskiwania dużych ilości dorosłych komórek macierzystych bez uszczerbku dla jakości komórek macierzystych.

Zastosowanie pADSC nie ogranicza się do rozszyfrowania różnicowania adipocytów, w tym adipogenezy i lipogenezy. W ostatnim czasie ADSC stały się popularnym źródłem komórek macierzystych w dziedzinie medycyny regeneracyjnej22,31,32. W porównaniu z innymi źródłami komórek macierzystych, ADSC zachowują wyjątkową zaletę polegającą na tym, że są łatwo dostępne i obfite, a ich solidna multipotencja okazała się obiecującym źródłem terapii komórkami macierzystymi i inżynierii tkankowej22,33,34. Łatwy dostęp do tkanki tłuszczowej sprawia, że ADSC jest jednym z najmniej inwazyjnych sposobów na uzyskanie multipotencjalnych komórek progenitorowych. Ostatnio zróżnicowaliśmy pADSC w klastry wydzielające insulinę reagujące na glukozę, co wskazuje, że pADSC nie ogranicza się do różnicowania mezenchymalnego (dane niepublikowane). Inne wykazano również, że ADSC może być różnicowany w wiele typów komórek pochodzących z innych listków rozrodczych, takich jak hepatocyty endodermalne (z hADSC35 lub pADSC36) lub neurony ektodermalne (z hADSC37 lub pADSC38). W związku z tym pADSC może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków lub biomateriałów poprzez kierowanie komórek do rozbieżnych procesów różnicowania w celu uzyskania pożądanych linii. W związku z tym pADSC wyprowadzone w tym protokole mają potencjalne zastosowanie w terapii komórkami macierzystymi i transplantacji tkanek w badaniach medycyny regeneracyjnej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby wyrazić wdzięczność wszystkim członkom laboratorium za obszerną dyskusję i wsparcie techniczne w tym protokole. Badania prowadzone w laboratorium były wspierane przez granty Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 103-2314-B-002-126 i MOST 102-2313-B-002-026-MY3) oraz przez granty z Aim for the Top University Plan (104R350144) National University, Taiwan.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Collagenase, Type IISigma-AldrichC6885
DMEM, wysoka glukoza, pirogronianLife Technologies11995-040
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032
Płodowa surowica bydlęca (FBS) Przemysł biologiczny04-001-1   
Roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B (P / S / A)Przemysł biologiczny03-033-1Do stosowania antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych
&alfa; MEM, bez nukleozydów Life Technologies12561-049
Bufor do lizy ACK Life TechnologiesA10492-01
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaLife Technologies25200072
CD4a-PESigma-AldrichSAB4700063
CD29-PESigma-AldrichSAB4700398
CD31-PESigma-AldrichSAB4700467
CD44-PESigma-AldrichSAB4700183
CD45-PESigma-AldrichSAB4700483
CD90-PESigma-AldrichSAB4700686
HLA Klasa I-PE (MHC I) Sigma-AldrichSAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II) Sigma-AldrichSAB4700662
Insulina Sigma-AldrichI9278
3,3',5-trijodo-L-tyronina (T3)Sigma-AldrichT6397
Transferyna Sigma-AldrichT2036
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)Sigma-AldrichI7018
Deksametazon Sigma-AldrichD4902
RozyglitazonCayman71740
β-Glicerofosforan Sigma-AldrichG9422
Kwas 2-fosfo-L-askorbinowy Sigma-Aldrich49752
TGFB1 Rekombinowane białko ludzkie R& D Systems 240-B-002
Olej czerwony O Sigma-AldrichO0625
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
Toluidine Blue OSigma-Aldrich198161
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
Ostrza ze stali węglowejThomas Scientific6727C18
Falcon 100 µ m sitko komórkoweCorning 352360
Płytka 6-dołkowa FalconCorning 
Falcon 100 mm  talerzCorning 
353046353003

Bibliografia

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podsk rna tkanka t uszczowa wiizolacja frakcji naczyniowo stromo tkankowejprotok trawienia kolagenaztest r nicowania adypocyt wmarkery mezenchymalnych kom rek macierzystychzliczanie metod wykluczania b kitu trypanowegog sto zasiewu hodowli kom rkowejpotencja r nicowania wielopotencjalnegoprocedura techniki aseptycznej

Powiązane artykuły