Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Podsumowanie

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych o^wysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Streszczenie

Izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) jest ważną metodą w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej, adipogenezy i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). In vivo, bogate w ECM środowisko składające się z kolagenów fibrylarnych zapewnia strukturalne wsparcie dla tkanki tłuszczowej podczas progresji i regresji otyłości. Fizjologiczna przebudowa ECM, w której pośredniczą metaloproteinazy macierzy (MMP), odgrywa główną rolę w regulacji wielkości i funkcji tkanki tłuszczowej^1,2. Utrata fizjologicznej kolagenolitycznej remodelingu ECM może prowadzić do nadmiernej akumulacji kolagenu (zwłóknienie tkanek), infiltracji makrofagów, a ostatecznie do utraty homeostazy metabolicznej, w tym insulinooporności^3,4. Gdy w modelach mysich ukierunkowanych na gen obserwuje się zmianę fenotypową tkanki tłuszczowej, wyizolowanie pierwotnych ASC z magazynów tłuszczu do badań in vitro jest skutecznym podejściem do określenia roli określonego genu w regulacji funkcji ASC. Poniżej definiujemy immunomagnetyczną separację ASC^{o wysokim poziomie} Sca1.

Wprowadzenie

Antygen komórek macierzystych 1 (Sca1 lub Ly6A/E) został po raz pierwszy zidentyfikowany jako marker powierzchni komórki wyrażany przez hematopoetyczne i mezenchymalne komórki macierzyste^5,6. Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) tkanki tłuszczowej uzyskana z magazynów tłuszczu myszy to niejednorodna populacja komórek składająca się z fibroblastów, makrofagów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, komórek neuronalnych i komórek progenitorowych adipocytów⁷. Komórki progenitorowe adipocytów lub komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) to komórki nieobciążone lipidami, które znajdują się w bogatej w kolagen okołonaczyniowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁸. Około 50% SVF składa się z ASC, które są scharakteryzowane jako lineage-ujemne (Lin^-) i CD29⁺: CD34⁺: Sca1^{+ 9}. Większość z tych komórek to Sca1⁺: CD24^- progenitory adipocytów, które są zdolne do różnicowania adipocytów in vitro; jednak tylko frakcja komórek (0,08% SVF) stanowi Sca1⁺: komórki CD24⁺, które są w pełni zdolne do proliferacji i różnicowania się w adipocyty w warunkach in vivo ⁹. Pomimo potencjalnego zastrzeżenia dotyczącego stosowania Sca1 ⁺ SVF bez rozróżniania komórek CD24 ⁺ od komórek CD24^-, izolowanie Sca1 ⁺ ASC z magazynów tłuszczu za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek jest skutecznym i praktycznym podejściem do określenia autonomicznego fenotypu komórek progenitorowych pierwotnych adipocytów.

W dziedzinie otyłości i cukrzycy, zwłóknienie tkanek i stan zapalny odgrywają kluczową rolę w rozwoju i utrzymaniu cukrzycy typu 2³. Ostatnio Tokunaga i wsp. wykazały, że komórki^{o wysokim poziomie} Sca1 wyizolowane z pachwinowych (lub podskórnych, SQ) i okołogoadalnych (lub trzewnych, VIS) magazynów tłuszczu C57BL6 / J wykazują różne sygnatury genów i przebudowę ECM in vitro¹⁰. MMP14 (MT1-MMP), prototypowy członek rodziny metaloproteinaz macierzy błonowych (MMP), pośredniczy w rozwoju białej tkanki tłuszczowej (WAT) poprzez swoją aktywność kolagenolityczną¹.

Przykłady eksperymentów, które mogą być przeprowadzone na komórkach wyizolowanych i wzbogaconych za pomocą następującego protokołu, obejmują hodowlę trójwymiarową, badania różnicowania, testy degradacji kolagenu i sekwencjonowanie RNA^10,11. Testy degradacji należy przeprowadzać z kolagenem ekstrahowanym kwasem, aby zapewnić zachowanie telopeptydu^11,12. Poniższy protokół zademonstruje metody izolowania pierwotnych komórek zrębu naczyniowego z różnych magazynów tłuszczu i wzbogacania komórek progenitorowych adipocytów za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek. Ważność sortowania komórek zostanie oceniona za pomocą cytometrii przepływowej i przy użyciu myszy Sca1-GFP, które wyrażają GFP w komórkach Sca1 ⁺, napędzanych przez promotor Sca1 ¹³.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Komitet Uniwersytetu Michigan ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (UCUCA) zatwierdził wszystkie metody i protokoły zgodnie z Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych (Instytut Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, Krajowa Rada ds. Badań). Myszy są trzymane w wiwarium Uniwersytetu Michigan i mają swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu ciemności / światła.

1. Przygotowania

1. Przygotuj podstawowe pożywki hodowlane z DMEM, 10% FBS, 1x P/S/G i 1x antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi. Zostanie to wykorzystane do utrzymania tkanek przed trawieniem. Umieścić bulion i podwielokrotność w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Przygotować pięć mililitrów roztworu kolagenazy typu III o stężeniu 5 mg/ml rozpuszczonego w HBSS (+Ca, +Mg) dla każdego rodzaju izolowanej poduszeczki tłuszczowej, do pięciu myszy. Na przykład, izolując SQ i VIS z jednego genotypu, należy przygotować 10 ml, a w przypadku typu dzikiego i zmutowanego SQ i VIS należy zrobić 20 ml. Dostosuj pH do 7,4 i sterylny filtr. Podwielokrotność rozlać na probówki o pojemności 50 ml. Odstawić z dala od światła.
3. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji pola operacyjnego. Wytrzyj i przykryj niebieską podkładką. Spryskaj niebieską podkładkę odrobiną etanolu.
4. Za pomocą igieł 22 G przymocuj chłonną podkładkę do płyty styropianowej i przytnij nożyczkami. Spryskaj podkładkę etanolem, a następnie połóż deskę na niebieskiej podkładce i przykryj inną niebieską podkładką, aż do rozpoczęcia sekcji.
5. Napełnij dwie probówki o pojemności 50 ml etanolem i umieść na stojaku przylegającym do pola operacyjnego. Umieść nożyczki i kleszcze w etanolu.
6. Napełnij kolejną probówkę o pojemności 50 ml PBS plus 1x anty-anti do spłukiwania etanolu z narzędzi chirurgicznych.
7. W kapturze oznacz szalki o średnicy 60 mm dla każdego rodzaju tkanki i napełnij je pożywką hodowlaną ogrzaną do 37 °C. Umieść płytki w pobliżu pola operacyjnego.

2. Izolacja podskórnych (SQ) poduszek tłuszczowych

1. Poddaj mysz eutanazji przez przedawkowanie izofluranu i odmy opłucnowej.
2. Delikatnie spryskaj mysz 70% etanolem i połóż się na wznak. Przypnij łapy do piankowej tablicy za pomocą igieł 22 G.
3. Wykonaj małe nacięcie w skórze dolnej części brzucha. Trzymając górną część nacięcia kleszczami, weź nożyczki i oddziel skórę od otrzewnej.
4. Po oddzieleniu skóry od otrzewnej od brzucha do klatki piersiowej, odbij skórę od otrzewnej w kierunku głowy, wykonując boczne nacięcia w skórze wzdłuż boku ciała.
5. Odbij pozostałą skórę trzymającą tłuszcz pachwinowy z dala od ciała i przypnij do deski za pomocą igieł 22 G.
6. Przełącz się na cienkie nożyczki i kleszcze. Chwyć pachwinową poduszeczkę tłuszczową kleszczami w miejscu początkowym w pobliżu otrzewnej i odetnij między skórą a tłuszczem pachwinowym postępującym w kierunku pachwiny, unikając zanieczyszczenia SQ skórą.
7. Umieść nasłonecznioną pachwinową poduszkę tłuszczową w oznaczonym naczyniu o średnicy 60 mm.

3. Izolacja poduszek tłuszczowych trzewnych (VIS)

1. W podobny sposób jak w kroku 2.5 rozetnij otrzewną, aby odsłonić trzewne poduszeczki tłuszczowe i jelita.
2. Odsuń jelito w kierunku klatki piersiowej.
3. Chwyć poduszkę tłuszczową VIS na dystalnym końcu i delikatnie pociągnij do góry. Wypreparuj poduszeczkę tłuszczową VIS, uważając, aby wykluczyć tkankę najądrza (lub macicy, jeśli używasz samic myszy).
4. Umieść w oznaczonym naczyniu i powtórz krok 3.3 dla pozostałej podkładki VIS.

4. Trawienie kolagenazy w poduszeczkach tłuszczowych

1. Przenieś szalki o średnicy 60 mm do okapu do hodowli tkankowej i odessaj pożywkę.
2. Zmiel poduszeczki tłuszczowe zakrzywionymi nożyczkami, a następnie dodaj do roztworu kolagenazy. Pamiętaj, aby opłukać nożyczki i kleszcze między typami tkanek etanolem i PBS.
3. Wstrząsać z prędkością 300 obr./min i w temperaturze 37 ºC przez 10-20 minut, aż tkanki zostaną strawione. Dopuszczalne jest, jeśli niektóre fragmenty SQ są nadal widoczne. Kwestia ta zostanie rozwiązana w późniejszym kroku.
4. Dodać 25 ml pożywki hodowlanej do roztworu kolagenazy, aby zatrzymać leczenie kolagenazą, a następnie 10 razy pipetować w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby rozproszyć strawione tkanki.
5. Odcedź komórki za pomocą sitka o wielkości 100 μm. Wirować przez 10 minut przy 300 x g.
6. Ostrożnie zdekantować pożywkę, aby nie naruszyć osadu i dodać 5 ml sterylnej wody do osadu i delikatnie pipetą, aby zawiesić komórki. Odczekaj 2 minuty na lizę erytrocytów.
7. Dodaj 25 ml pożywki z 10% FBS i przecedź komórki przez nowe sitko do komórek o średnicy 100 μm.
8. Wirować przez 10 minut przy 300 x g. Zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej.
9. Policz komórki za pomocą hemocytometru za pomocą błękitu trypanowego 1:1.
10. Płytka 1 x 10 6 komórek w jednym dołku na płytce 6-dołkowej.

5. Magnetyczna separacja komórek

1. Po około 4 do 6 godzinach adhezji komórek należy dwukrotnie przepłukać komórki HBSS (-Ca, -Mg). Dysocjuj przylegające komórki za pomocą 0,05% trypsyny. Rozcieńczyć zawiesinę komórek trypsyny w 1 ml buforu separacyjnego i wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g.
2. Aspirowany supernatant. Zawieś komórki w buforze 500 μl. Usunąć podwielokrotność 10 μl i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
3. Wiruj komórki przez 5 minut przy 300 x g.
4. Całkowicie odessać supernatant. Zawieś komórki w buforze 90 μl. Dodać 10 μl przeciwciała pierwszorzędowego anty-Sca1-FITC. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
5. Przemyć komórki 1 ml buforu i odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g. Całkowicie usunąć supernatant.
6. Zawieś komórki w buforze o objętości 80 μl. Dodaj 20 μl mikrogranulek anty-FITC. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
7. Przemyć komórki 1 ml buforu i odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g.
8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze o pojemności 500 μl.
9. Umieścić kolumnę w uchwycie magnetycznym i przepłukać kolumnę buforem o pojemności 500 μl.
10. Dodaj zawieszenie komórki do kolumny. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza.
11. Zebrać nieznakowane komórki Sca1 i przemyć kolumnę 3 razy buforem o pojemności 500 μl. Nowy bufor należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik jest pusty. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza.
12. Wyjmij kolumnę z uchwytu magnetycznego i umieść w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
13. Dodać 1 ml buforu do kolumny i wymyć Sca1⁺, przepychając dostarczony tłok przez zbiornik kolumny.
14. Odwirowywać frakcje komórkowe przez 5 minut przy 300 x g. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej.
15. Usunąć 10 μl podwielokrotności z oznakowanych i nieznakowanych frakcji i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
16. Umieść każdą frakcję komórkową w 1 dołku na płytce 6-dołkowej.

6. Weryfikacja immunomagnetycznej separacji ACS^{o wysokim} poziomie Sca1 za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przepłucz komórki dwukrotnie HBSS (-Ca, -Mg) i dysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny.
2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej i policzyć za pomocą hemocytometru.
3. Otrzymać >10⁶ komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 300 x g przez 5 min.
4. Usunąć supernatant i powtórzyć krok 6.3 jeszcze dwa razy.
5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml 2% surowicy koziej + 2% BSA i blokować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
7. Usuń roztwór blokujący.
8. Dodaj szczurzą IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 μg, 1:400) lub anty-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 μg, 1:400) w 100 μl PBS z 2% surowicą kozią i 2% BSA + PBS w temperaturze 4 °C przez 30 min w ciemności.
9. Dodaj 1 ml zimnego PBS do komórek. Wirować 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
10. Usunąć supernatant i powtórzyć krok 6.9 jeszcze dwa razy.
11. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Przepuścić zawiesiny komórek przez sitko do komórek o wielkości 100 μm w celu przygotowania do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wyniki

Wzbogacenie ASC^{o wysokim poziomie} Sca1 z różnych poduszek tłuszczowych.

Komórki zrębu naczyniowego wyizolowane z tłuszczu SQ wykazują podobny do fibroblastów, rozciągnięty kształt komórek, niezależnie od poziomu ekspresji Sca1 (Rysunek 1A). Z drugiej strony, komórki VIS (pochodzące z eWAT) Sca1^{o wysokim} i^niskim Sca1 wykazują wyraźną różnicę w kształcie komórki. Podobnie^{jak w...}

Dyskusja

W niniejszym artykule demonstrujemy izolację i immunomagnetyczną separację komórek mysich ASC z różnych poduszek tłuszczowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach in vitro . Przedstawiona metoda jest skuteczna w szybkiej izolacji dużej liczby Sca1-dodatnich ASC, co jest korzystne w porównaniu z technicznie skomplikowaną i kosztowną izolacją ASCs za pośrednictwem FACS^9,14. W przeciwieństwie do FACS, immunomagnetyczna separacja komórek nie pozwala na użycie wielu antygenów do identyfikacji docelowej p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Typ 3 Kolagenaza	Worthington Biochemiczna	LS004182	Trawienie tkankowe
DMEM	Gibco	11965-092	Pożywka hodowlana o wysokiej zawartości glukozy
Pióro/Paciorkowiec/Glutamina (100x)	Gibco	10378-016	Podłoże antybiotykowe
Anty-anty (100x)	Gibco	15240-062	Pożywka przeciwgrzybicza
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7,4)	Gibco	10010-023
Trypsyna (0,05%)	Gibco	25300-054
Sitko komórkowe	BD Bioscience	352360	100-μ m Sitko komórkowe
Płytki 60 mm	BD Falcon	353004
Nożyczki	FST	14001-12	Duże
nożyczki	FST	14091-11	Drobna, zakrzywiona końcówka
Kleszcze duże	FST	11000-12
Kleszcze drobne	Dowolny dostawca
Igły 25G 5/8"	BD	305122
Igły 22G 1,5"	BD	305159
Probówki stożkowe 15 ml	BD Falcon	352097
Probówki stożkowe 50 ml	Kolumny	352098
MACS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Zestaw mikrokulek anty-Sca1 (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anty-Sca1 1º Mikrokulki Ab i anty-FITC 2º
Bufor biegowy Ab AutoMACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Separator MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Niebieskie podkładki chux	Fisher	276-12424
Podkładki chłonne	Fisher	19-165-621
Płyta styropianowa			Stosować z probówek o pojemności 50 ml
70% etanolu
Izofluran	Dowolny sprzedawca
Szczur IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Szczur IgG2a anty-mysi Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Szczur IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Szczur IgG2a anty-mysz F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Rura okrągłodenna	BD Falcon	352058
HBSS (– Ca, – Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	Do roztworu kolagenazy
Kolagen typu I (2,7 mg/ml w 37 mm kwasie octowym	Przygotuj w domu12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0,34 N NaOH	Przygotuj we własnym zakresie
Szkiełka nakrywkowe	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy, mieszane izomery	Invitrogen	A-20004
0,89 M NaHCO3	Gibco	25080-094