Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) jest ważną metodą w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej, adipogenezy i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). In vivo, bogate w ECM środowisko składające się z kolagenów fibrylarnych zapewnia strukturalne wsparcie dla tkanki tłuszczowej podczas progresji i regresji otyłości. Fizjologiczna przebudowa ECM, w której pośredniczą metaloproteinazy macierzy (MMP), odgrywa główną rolę w regulacji wielkości i funkcji tkanki tłuszczowej1,2. Utrata fizjologicznej kolagenolitycznej remodelingu ECM może prowadzić do nadmiernej akumulacji kolagenu (zwłóknienie tkanek), infiltracji makrofagów, a ostatecznie do utraty homeostazy metabolicznej, w tym insulinooporności3,4. Gdy w modelach mysich ukierunkowanych na gen obserwuje się zmianę fenotypową tkanki tłuszczowej, wyizolowanie pierwotnych ASC z magazynów tłuszczu do badań in vitro jest skutecznym podejściem do określenia roli określonego genu w regulacji funkcji ASC. Poniżej definiujemy immunomagnetyczną separację ASCo wysokim poziomie Sca1.
Wprowadzenie
Antygen komórek macierzystych 1 (Sca1 lub Ly6A/E) został po raz pierwszy zidentyfikowany jako marker powierzchni komórki wyrażany przez hematopoetyczne i mezenchymalne komórki macierzyste5,6. Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) tkanki tłuszczowej uzyskana z magazynów tłuszczu myszy to niejednorodna populacja komórek składająca się z fibroblastów, makrofagów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, komórek neuronalnych i komórek progenitorowych adipocytów7. Komórki progenitorowe adipocytów lub komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) to komórki nieobciążone lipidami, które znajdują się w bogatej w kolagen okołonaczyniowej macierzy zewn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Komitet Uniwersytetu Michigan ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (UCUCA) zatwierdził wszystkie metody i protokoły zgodnie z Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych (Instytut Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, Krajowa Rada ds. Badań). Myszy są trzymane w wiwarium Uniwersytetu Michigan i mają swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu ciemności / światła.
1. Przygotowania
- Przygotuj podstawowe pożywki hodowlane z DMEM, 10% FBS, 1x P/S/G i 1x antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi. Zostanie to wykorzystane do utrzymania tkanek przed trawieniem....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wzbogacanie ASCs Sca1high z różnych poduszek tłuszczowych.
Komórki z gleby naczyniowej wyizolowane z tkanki tłuszczowej podskórnej (SQ) wykazują wydłużony kształt przypominający fibroblasty, niezależnie od poziomu ekspresji Sca1 (Rycina 1A). Z kolei komórki Sca1high i Sca1low z tkanki tłuszczowej trzewnej (VIS, pochodne eWAT) wykazują wyraźną różnicę w kształcie komórek. Podobnie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym artykule demonstrujemy izolację i immunomagnetyczną separację komórek mysich ASC z różnych poduszek tłuszczowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach in vitro . Przedstawiona metoda jest skuteczna w szybkiej izolacji dużej liczby Sca1-dodatnich ASC, co jest korzystne w porównaniu z technicznie skomplikowaną i kosztowną izolacją ASCs za pośrednictwem FACS9,14. W przeciwieństwie do FACS, immunomagnetyczna separacja komórek nie pozwala na użycie wielu antygenów do identyfikacji docelowej p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez NIH DK095137 (do THC). Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium, którzy przyczynili się do rozwoju i udoskonalenia opisanych metod.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Typ 3 Kolagenaza | Worthington Biochemiczna | LS004182 | Trawienie tkankowe |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Pożywka hodowlana o wysokiej zawartości glukozy |
| Pióro/Paciorkowiec/Glutamina (100x) | Gibco | 10378-016 | Podłoże antybiotykowe |
| Anty-anty (100x) | Gibco | 15240-062 | Pożywka przeciwgrzybicza |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7,4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsyna (0,05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Sitko komórkowe | BD Bioscience | 352360 | 100-μ m Sitko komórkowe |
| Płytki 60 mm | BD Falcon | 353004 | |
| Nożyczki | FST | 14001-12 | Duże |
| nożyczki | FST | 14091-11 | Drobna, zakrzywiona końcówka |
| Kleszcze duże | FST | 11000-12 | |
| Kleszcze drobne | Dowolny dostawca | ||
| Igły 25G 5/8" | BD | 305122 | |
| Igły 22G 1,5" | BD | 305159 | |
| Probówki stożkowe 15 ml | BD Falcon | 352097 | |
| Probówki stożkowe 50 ml | Kolumny | 352098 | |
| MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Zestaw mikrokulek anty-Sca1 (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anty-Sca1 1º Mikrokulki Ab i anty-FITC 2º |
| Bufor biegowy Ab AutoMACS | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Separator MiniMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Niebieskie podkładki chux | Fisher | 276-12424 | |
| Podkładki chłonne | Fisher | 19-165-621 | |
| Płyta styropianowa | Stosować z probówek o pojemności 50 ml | ||
| 70% etanolu | |||
| Izofluran | Dowolny sprzedawca | ||
| Szczur IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Szczur IgG2a anty-mysi Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Szczur IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Szczur IgG2a anty-mysz F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Rura okrągłodenna | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (– Ca, – Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | Do roztworu kolagenazy |
| Kolagen typu I (2,7 mg/ml w 37 mm kwasie octowym | Przygotuj w domu12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0,34 N NaOH | Przygotuj we własnym zakresie | ||
| Szkiełka nakrywkowe | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy, mieszane izomery | Invitrogen | A-20004 | |
| 0,89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
Bibliografia
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
