Artykuł metodologiczny

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 marca 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy molekularne wywołane kwasem ściśle kontrolują wnikanie do komórek wielu wirusów, które dostają się przez system endocytarny. W przypadku wirusa grypy A (IAV) fuzja wirusa z błoną endosomalną, a następnie demontaż kapsydu wirusa, zwany odwarstwieniem, jest regulowany warunkami jonowymi wewnątrz pęcherzyków endocytarnych. Wczesne etapy cyklu życiowego wirusa są trudne do zbadania, ponieważ nie można uzyskać bezpośredniego dostępu do endosomów eksperymentalnie, co stwarza potrzebę podejścia in vitro. W tym miejscu opisano metodę opartą na wirowaniu w gradiencie prędkości oczyszczonych wirionów za pomocą dwuwarstwowego gradientu glicerolu, który umożliwia analizę rdzenia IAV i jego stabilności. Gradient zawiera niejonowy detergent (NP-40) w dolnej warstwie, który usuwa błonę wirusową przez solubilizację, gdy wirus osadza się w kierunku dna. Przy neutralnym pH rdzenie wirusów są granulowane jako stabilne struktury. Główne składniki rdzenia, białko macierzy (M1) i rybonukleoproteiny wirusa (vRNP), można wyraźnie zidentyfikować we frakcji osadu za pomocą SDS-PAGE. Obniżenie pH do 6,0 lub mniej w dolnej warstwie selektywnie usuwa M1 z osadu, a następnie uwalnia vRNP w bardziej kwaśnych warunkach. Prążki białek wirusowych na żelach barwionych Coomassie można poddać kwantyfikacji densytometrycznej w celu monitorowania pośrednich stanów rozkładu IAV. Oprócz pH można ocenić inne czynniki wpływające na stabilność rdzenia wirusa, takie jak stężenie soli i przypuszczalne czynniki powodujące powstawanie powłok wirusowych, po prostu odpowiednio modyfikując warstwę glicerolu zawierającą detergent. Reasumując, prezentowana technika pozwala na wysoce powtarzalną i ilościową analizę odsłaniania wirusa in vitro. Może być stosowany do innych wirusów otoczkowych, które przechodzą złożone procesy odwarstwiania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus grypy A (IAV) jest wirusem otoczkowym i należy do rodziny Orthomyxoviridae. Jego geny są zakodowane w segmentowanym, jednoniciowym genomie RNA o ujemnym sensie. U ludzi IAV powoduje infekcje dróg oddechowych, które występują w sezonowych epidemiach i mogą prowadzić do globalnych pandemii1. Po związaniu się z resztami kwasu sjalowego na powierzchni komórki gospodarza2, IAV jest internalizowany przez endocytozę zależną od klatryny i szlaki niezależne od klatryny3-8. Środowisko kwaśne (pH < 5,5) w wakuolach endocytarnych wywołuje poważną zmianę konformacyjną w hemaglutyninie (HA) glikoproteiny kolca IAV, co powoduje fuzję wirusa i późnej błony endosomalnej9. Gdy kapsyd IAV (określany również jako "rdzeń" wirusa) ucieknie z późnych endosomów (LE), jest on odsłaniany w cytozolu, a następnie transportowany przez rybonukleoproteiny wirusa (vRNP) do jądra - miejsca replikacji i transkrypcji wirusa10-13. Przed kwasową aktywacją kwasu hialuronowego wirus doświadcza stopniowego spadku pH w układzie endocytarnym, co przygotowuje rdzeń do jego późniejszego rozkładu14-16. W tym etapie "torowania" kanały jonowe M2 w błonie wirusowej pośredniczą w napływie protonów i K+10,14,16. Zmiana stężenia jonów we wnętrzu wirusa zaburza interakcje budowane przez białko macierzy wirusa M1 i osiem wiązek vRNP oraz ułatwia odwarstwianie się IAV w cytoplazmie po fuzji błonowej10,14-17.

Bezpośrednia i ilościowa analiza etapu primingu została utrudniona przez fakt, że endosomy są trudno dostępne eksperymentalnie. Co więcej, proces wejścia jest wysoce niesynchroniczny. Ponadto testy punktu końcowego, takie jak qRT-PCR uwolnionego wirusowego RNA lub pomiary zakaźności, nie dają szczegółowego obrazu stanu biochemicznego kapsydu wirusa na żadnym etapie wprowadzenia. Podczas gdy zaburzenia endosomów przez siRNA lub leczenie farmakologiczne znacząco przyczyniły się do zrozumienia wejścia IAV18-20, dostrojenie jest trudne i podatne na niespecyficzne skutki uboczne w ściśle kontrolowanym programie dojrzewania endosomów.

Aby uniknąć tych problemów, dostosowaliśmy wcześniej opracowany protokół in vitro oparty na wykorzystaniu wirowania w gradiacji prędkości17. W przeciwieństwie do innych prób 21,22,23,24, które w większości opierały się na kombinacjach rozszczepienia proteolitycznego i obróbki detergentem, a następnie analizie EM, podejście to umożliwiło łatwo wymierny wynik. Wirowanie przez różne warstwy gradientu pozwala na wystawienie cząstek sedymentacyjnych na działanie zmieniających się warunków i reagowanie z nimi w kontrolowany sposób. W przedstawionym protokole IAV pochodzący z oczyszczonego płynu omoczniowego lub oczyszczonych cząstek wirusa jest sedymentowany do dwuwarstwowego gradientu glicerolu, w którym dolna warstwa zawiera niejonowy detergent NP-40 (ryc. 1). Gdy wirus dostaje się do drugiej, zawierającej detergent warstwy, wirusowa otoczka lipidowa i glikoproteiny otoczki są delikatnie rozpuszczane i pozostawiane. Rdzeń, złożony z ośmiu wiązek vRNP i otoczony warstwą matrycy, osadza się jako stabilna struktura we frakcji osadów. Białka rdzenia wirusa, takie jak nukleoproteina (NP) związana z M1 i vRNP, można zidentyfikować w osadzie za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie. W szczególności, wykorzystanie dostępnych na rynku żeli gradientowych i barwienie bardzo czułym koloidalnym Coomassie25, umożliwia wysoką precyzję i wykrywanie nawet niewielkich ilości białek związanych z rdzeniem wirusa.

To stanowi podstawę do testowania, czy różne warunki, takie jak pH, stężenie soli i przypuszczalne czynniki niepowlekania, mają wpływ na zachowanie sedymentacji składników rdzenia i stabilność rdzenia. W tym celu tylko dolna, zawierająca detergent warstwa w gradieniu glicerolu jest modyfikowana poprzez wprowadzenie czynnika lub warunku będącego przedmiotem zainteresowania. Technika ta okazała się szczególnie cenna w badaniu wpływu różnych wartości pH i stężeń soli na integralność rdzeniaIAV 16. Można monitorować pośrednie etapy odwarstwiania IAV, w tym dysocjację warstwy matrycy przy lekko kwaśnym pH (<6,5), a następnie dysocjację vRNP przy pH 5,5 i niższym16,17 (ryc. 1). Ten ostatni etap został dodatkowo wzmocniony przez obecność wysokiego stężenia K+ w warstwie glicerolu, odzwierciedlającego późne środowisko endocytarne16. W ten sposób, gdy wirus i rdzeń sedymentowały przez gradient, doświadczyły zmieniającego się środowiska, które naśladuje warunki panujące w endosomach. Rezultatem był stopniowy demontaż rdzenia wirusa in vitro, uzupełniający wyniki uzyskane z testów biologii komórki.

Przedstawiona tutaj metoda umożliwiła szybką i wysoce powtarzalną analizę IAV (X31 i A/WSN/33) oraz IBV (B/Lee/40) wywołaną kwaśnym pH i wzrostem K+16,17, a także demontaż rdzeni paramyksowirusa po ekspozycji na zasadowe pH17. Niewykluczone, że podejście to można dostosować do innych wirusów otoczkowych, aby uzyskać wgląd w właściwości biochemiczne struktury kapsydu wirusa i rozkładu kapsydu podczas wnikania do komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i roztworów podstawowych

  1. Przygotować bufor MNT (20 mM MES, 30 mM Tris i 100 mM NaCl) rozpuszczając 470 mg chlorowodorku Tris, 390 mg hydratu MES i 580 mg NaCl w 80 ml ddH2O. Dostosować bufor do pH 7,4 i doprowadzić go do końcowej objętości 100 ml za pomocą ddH2O.
  2. Przygotować trzy identyczne roztwory 500 mM buforu MES, rozpuszczając 9,76 g hydratu MES w 80 ml dH2O każdy. Dostosować odpowiednio do pH 5,8, 5,4 i 5,0, miareczkując stężonym NaOH. Doprowadzić każdy bufor do końcowej objętości 100 ml zdH2O.
  3. Przygotować dwa identyczne roztwory 500 mM buforu Tris, rozpuszczając 7,88 g chlorowodorku Tris w 80 ml dH2O każdy i dostosować pH odpowiednio do 7,4 i 6,4 przez miareczkowanie stężonym HCI. Doprowadzić bufor do końcowej objętości 100 ml zdH2O.
  4. Przygotować 50% roztwór glicerolu w dH2O i dobrze wymieszać, aż glicerol zostanie jednorodnie wymieszany. Przefiltruj roztwór przez jednostkę filtrującą Steritop (wielkość porów 0,22 μm) do szklanej butelki.
  5. Przygotować 10% roztwór NP-40 i 1 M NaCl w dH2O.
  6. Przygotuj 25x skoncentrowany inhibitor proteazy, rozpuszczając dwie tabletki w 4 ml ddH2O.

2. Przygotowanie gradientów glicerolu

  1. Przygotować 5 ml głównego roztworu buforu detergentu (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x skoncentrowany inhibitor proteazy) dla każdego warunku pH do badania (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 i 5,0). W tym celu zmieszać 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml 25-krotnego inhibitora proteazy i 9 ml ddH20.
  2. Dla każdego warunku pH odpipetować 4,4 ml mieszanki wzorcowej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  3. W przypadku wartości pH powyżej 5,8 dodać do probówki 0,6 ml odpowiedniego roztworu podstawowego Tris o dostosowanym pH 500 mM do probówki. Aby uzyskać pH 5,8 i niższe, dodaj 0,6 ml odpowiedniego roztworu podstawowego MES o dostosowanym pH 500 mM.
  4. Przygotować 5 ml roztworu buforowego zawierającego 300 mM NaCl, 2x inhibitor proteazy, 60 mM Tris dostosowanych do pH 7,4 i ddH2O. Będzie on służył jako bezdetergentowy bufor gradientu sterowania.
  5. W razie potrzeby dokładnie dostosować pH roztworów do pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 i 5,0, dodając odpowiednio stężone roztwory HCI lub NaOH.
  6. Dodać 5 ml 50% glicerolu do 5 ml mieszanin buforowych zawierających detergenty i niezawierających detergentów, otrzymując sześć różnych 25% roztworów glicerolu. Sprawdź wartości pH za pomocą pasków wskaźnika pH.
    UWAGA: W przypadku, gdy zmierzone pH znacznie różni się od pożądanej wartości, odpowiednie roztwory należy ponownie przygotować.
  7. Przygotować 15% roztwór glicerolu, mieszając 50% glicerolu zdH2Ow stosunku 3:7.

3. Ultrawirowanie IAV

  1. Dodać 3 ml 15% roztworu glicerolu do bardzo przezroczystych probówek wirówkowych (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły (21 G, 9 cm długości). Nie pozostawiaj kropli na wewnętrznej ściance rury, ponieważ może to zakłócić integralność gradientu. Powtórzyć tę czynność dla łącznie sześciu probówek wirówkowych, po jednej dla każdego z pięciu warunków pH do zbadania i jednej dla próbki kontrolnej.
  2. Ostrożnie umieścić 3,4 ml 25% roztworu glicerolu pod warstwą 15% glicerolu za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i długiej igły. Uważaj, aby nie mieszać dwóch warstw. Powtórz tę czynność we wszystkich sześciu warunkach, aby przeprowadzić test z odpowiednimi roztworami glicerolu o dostosowanym pH.
    UWAGA: Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby wykonać następujące kroki.
  3. Delikatnie nałożyć gradienty glicerolu na 30 μl klarowanego płynu omoczniowego zawierającego IAV (X31, H3N2) rozcieńczonego w 1 ml buforu MNT (odpowiada około 20-30 μg całkowitego białka wirusowego) dla każdego gradientu.
  4. Zrównoważ przeciwległe rurki i umieść je w wirniku ultrawirówkowym SW41. Wirować przez 150 minut, przy 55 000 x g i w temperaturze 12 °C.
  5. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, tj. obie warstwy glicerolu za pomocą czystej pipety Pasteura i aspiratora. Zawiesić osad w 40 μl (1x) nieredukującym buforze do próbek LDS. Ważne jest, aby kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić osad. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.

4. SDS-PAGE z frakcjami granulek i barwieniem Coomassie

  1. Ogrzewać wszystkie próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut. W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu ich analizy przez SDS-PAGE.
  2. Załaduj 20 μl rozpuszczonych granulek na wstępnie odlany gradient (4-12%) mini żel Bis-Tris i uruchom przez 1 godzinę przy 200 V w buforze 1x MOPS SDS running buffer.
  3. Sporządzić roztwór utrwalający z 40% metanolem i 10% lodowatym kwasem octowym w ddH2O.
  4. Inkubować żel w roztworze utrwalającym przez 1 godzinę i barwić przez noc w 15 cm naczyniu do hodowli komórkowych z wystarczającą ilością koloidalnego roztworu Coomassie, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ważne jest, aby zamknąć naczynie, aby uniknąć odparowania roztworu barwiącego.
  5. Odbarwić żel w ddH2O. Wymieniaj ddH2O co 15-20 minut, aż tło żelu stanie się czyste. Przechowywać żel w ddH2O w temperaturze 4 °C do czasu zeskanowania w celu określenia ilościowego pasma.
  6. Zeskanuj żel w wysokiej rozdzielczości i użyj dostępnego na rynku lub dostosowanego do potrzeb klienta oprogramowania do ilościowego określania intensywności pasm białkowych. Odjąć sygnał tła z obszaru znajdującego się w pobliżu odpowiednich pasm i znormalizować te wartości do próbek kontrolnych niezawierających detergentów (przy pH 7,4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak już wspomniano, gruntowanie w endosomach jest wymagane, aby rdzeń IAV był kompetentny do odkrycia. Protonowanie rdzenia osłabia oddziaływanie M1 i vRNP (złożonych z wirusowego RNA, NP i kompleksu polimerazy PB1/PB2/PA). Proces ten jest inicjowany, gdy przychodzący wirus jest wystawiony na działanie pH 6,5 (lub niższego) we wczesnych endosomach (EE) i trwa do momentu, gdy wirus połączy się przy pH około 5,0 w LE.

Aby naśladow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsydy wirusowe są metastabilnymi kompleksami makromolekularnymi. Podczas gdy składanie wirionów wymaga enkapsydacji i kondensacji genomu wirusa, rozpoczęcie kolejnej rundy infekcji zależy od demontażu tej zwartej struktury kapsydu. Wirusy ewoluowały, aby wykorzystywać różne mechanizmy komórkowe do kontrolowania cyklu powlekania-odsłaniania, w tym receptory komórkowe, białka opiekuńcze, enzymy proteolityczne, siły fizyczne dostarczane przez białka motoryczne lub helikazy, a także pH i przełączniki jonowe26,27...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Yohei Yamauchi i Robercie Mancini za dostarczenie nam odczynników. Laboratorium A. H. było wspierane przez Sieci Szkolenia Początkowego Marie Curie (ITN), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (Sinergia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
cOmplete™, Tabletki inhibitora proteazy bez EDTASigma-Aldrich11873580001Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze od 2 do 8 stopni; C przez 1 do 2 tygodni
Lodowaty kwas octowyMerck Millipore100063
Glicerol bezwodny BioChemicaAppliChemA1123
Kwas solnyMerck Millipore100317
Igła do wstrzykiwań długich (21  G, 9 cm, skośny lub koniec)
Hydrat MESSigma-AldrichM8250
MetanolMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Teraz dostępny w sprzedaży jako IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini żele, 10  studzienki, 1,0 mmLife TechnologiesNP0321
Bufor do próbek NuPAGE LDS (4x)Life TechnologiesNP0008
Bufor do biegania NuPAGE MOPS SDS (20x)Life TechnologiesNP0001
Paski wskaźnikowe pH, pH 4,0-7,0Merck Millipore109542
QC Koloidalna plama CoomassieBIO RAD1610803
sodu chlorekMerck Millipore106406
Wodorotlenek soduMerck Millipore106498
Jednostka filtrująca SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, zestaw wirników ultrawirówekBeckman Coulter331336
Cienkościenny, Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe, 13.2  ml, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
Tris chlorowodorek AppliChemA1087
X31 Wirus grypy A (H3N2), wyhodowany w jajach, klarowany płyn omoczniowyVirapurŚwieżo rozmrożony na 4 & stopni; Z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Centryfugacja w gradiencie g sto cirozpad kapsydu wirusowegogradient glicerolusolubilizacja NP 40odnowienie zale ne od pHanaliza SDS PAGEstabilno rdzenia wirusowegobia ko macierzy M1wirusowe rybonukleoproteiny

Powiązane artykuły