Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53910

⸱

16 października 2016

 ,  , 
1Neonatology and Pulmonary Biology-Perinatal Institute, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati, College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Użycie myszy reporterowych w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca i sekcji, mikroskopią i testami in vivo ułatwia analizę mechanizmów leżących u podstaw normalnego wzorca dróg oddechowych. Tutaj opisujemy, w jaki sposób techniki te przyczyniły się do analizy sygnalizacji Wnt podczas rozwoju tchawicy.

Streszczenie

Szlaki sygnałowe Wnt odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju dróg oddechowych. Zdefiniowanie precyzyjnych mechanizmów różnicowania i morfogenezy kontrolowanych przez sygnalizację Wnt jest konieczne, aby zrozumieć, w jaki sposób tkanki są wzorcowane podczas normalnego rozwoju. Wiedza ta jest również kluczowa dla określenia etiologii wad wrodzonych, takich jak hipoplazja płuc i tchawica i oskrzelomalia. Analiza najwcześniejszych etapów rozwoju dróg oddechowych stanowi wyzwanie, ponieważ ograniczona ilość tkanki uniemożliwia wykonanie standardowych protokołów, które lepiej nadają się do badań poporodowych. W tym artykule omówiono metodologie badania różnicowania i proliferacji komórek w drogach oddechowych. Opisujemy takie techniki, jak barwienie całego wierzchowca, przetwarzanie tkanki do mikroskopii konfokalnej oraz immunofluorescencja w skrawkach parafinowych stosowana do rozwoju tchawicy płuca. Omówiono również metodyki badania różnicowania mezenchymy tchawicy, w szczególności tworzenia się chrząstek. Podejścia i techniki omówione w niniejszej pracy pozwalają obejść ograniczenia materiału podczas pracy z tkanką embrionalną, co pozwala na lepsze zrozumienie procesu tworzenia się przewodzących dróg oddechowych.

Wprowadzenie

Rozwój dróg oddechowych jest inicjowany przez 9 dzień embrionalny (E9) wraz z pojawieniem się komórek Nkx2.1 dodatnich w brzusznym endodermalnym jelicie przednim1,2. Separacja rurki przełykowo-tchawiczej ustąpi przez E11.5, gdy rurki można rozróżnić jako odrębne jednostki, z których każda jest otoczona tkanką mezenchymalną3. Sygnalizacja Wnt odgrywa kluczową rolę w specyfikacji dróg oddechowych, ponieważ delecja Wnt2 i Wnt2b, wyrażona przez mezenchymę splanchniczną, a delecja β-kateniny z endodermalnego nabłonka oddechowego spowoduje agenezję płuc4,5. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że delecja Wls, receptora ładunkowego pośredniczącego w wydzielaniu wszystkich ligandów Wnt, z endodermalnych dróg oddechowych powoduje hipoplazję płuc, defekty w rozwoju naczyń płucnych i nieprawidłowy wzorzec mezenchymii tchawicy6,7. Dane te potwierdzają znaczenie wzajemnego oddziaływania nabłonkowo-mezenchymalnego w różnicowaniu i specyfikacji komórek, jak wykazano również w innych badaniach8,9.

Badanie najwcześniejszych etapów rozwoju płuc opiera się na technikach genetycznych, in vitro i ex vivo, które pozwoliły nam lepiej zrozumieć mechanizmy rządzące tożsamością oddechową10-16. Całe kultury eksplantatów płuc w interfazie cieczy powietrznej zostały szeroko wykorzystane do badania wpływu czynników wzrostu we wczesnych stadiach morfogenezy rozgałęzień płucnych10,17,18. Chociaż metoda ta jest stosowana do odczytywania zmian morfologicznych, takich jak morfogeneza rozgałęzień i modulacja ekspresji genów, ogranicza się ona do badania wczesnych etapów procesu rozwojowego, ponieważ sama hodowla nie wspomaga rozwoju układu naczyniowego17. Rozwój chrząstki tchawicy wymaga dłuższego czasu inkubacji, który może być niezgodny z tą techniką hodowli.

Aby przeanalizować rolę sygnalizacji Wnt podczas tworzenia dróg oddechowych, dostosowaliśmy standardowe techniki do potrzeb naszych badań embrionalnych. Zmodyfikowaliśmy objętości, czasy barwienia, cykle przetwarzania do zatapiania parafiny i czas oczyszczania tkanki tchawicy płucnej. Głównym celem optymalizacji technik opisanych w niniejszym badaniu była analiza najwcześniejszych etapów rozwoju tchawicy u myszy, które mają miejsce od E11 do E14.5. Korzystając z linii myszy reporterowych Axin2LacZ precyzyjnie określiliśmy miejsca aktywności Wnt/β-kateniny w rozwijającej się mezenchymie tchawicy. Dostosowaliśmy również procedurę barwienia lektyny do całej tkanki tchawicy wierzchowca. Dzięki temu byliśmy w stanie zwizualizować kondensacje mezenchymalne i przewidzieć miejsca, w których będzie zachodzić chondrogeneza. Barwienie całego wierzchowca i skrawków tkanki embrionalnej uzyskanej od myszy WlsShhCre, w połączeniu z zaawansowanymi technikami mikroskopowymi, pozwoliło nam odkryć rolę ligandów Wnt wytwarzanych przez nabłonek tchawicy w kształtowaniu tchawicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zwierzęta były trzymane w warunkach wolnych od patogenów. Myszy obchodzono się zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee (Cincinnati, OH USA). Myszy wykorzystywane w tych badaniach były utrzymywane w mieszanym tle.

1. Barwienie całego górnika X-galaktozydazy

  1. Poddać eutanazji ciężarną kobietę w wieku od E11,5 do E14,5 przez wdychanie CO2 . Umieść zwierzęta w komorze CO2, naładuj komorę CO2 . Trzymaj zwierzęta w komorze przez minimum 5 minut. Wykonać wtórną metodę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Oczyść okolice brzucha etanolem (EtOH) 70% i wykonaj laparotomię z pojedynczym nacięciem linii środkowej brzucha. Używaj nożyczek chirurgicznych i kleszczy o standardowym wzorze (prostym ząbkowanym).
  3. Odizoluj rogi macicy za pomocą kleszczy i cienkich nożyczek i natychmiast umieść tkankę na szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór PBS. Utrzymuj tkankę na lodzie do momentu przystąpienia do izolacji zarodków.
  4. Odizoluj zarodki z rogów macicy. Wypreparować embrionalną tkankę płucną tchawicy za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Użyj kleszczyków i nożyczek z cienką końcówką, aby przytrzymać i nakłuć tkankę macicy i poczęcie, uwalniając zarodki.
    1. Usuń pozostałe błony zarodkowe. Za pomocą ostrzy igieł odetnij głowę zarodków i dolną część ciała poniżej przepony. Zlokalizuj wątrobę jako punkt orientacyjny.
    2. Po wyizolowaniu okolicy piersiowej zarodka przystąp do usuwania bocznych stron ściany ciała, kręgosłupa i serca za pomocą ostrzy igieł. Zachowaj ostrożność podczas usuwania serca, aby uniknąć uszkodzenia tkanki tchawicy. Na koniec ostrożnie oddziel przełyk od tchawicy, ciągnąc przełyk za pomocą ostrzy igieł. Utrzymuj tkankę w roztworze PBS na lodzie.
  5. Umieścić tkankę w 4 ml fiolkach z zakrętką za pomocą pipet szklanych lub transferowych. Utrwalić tchawiczą tkankę płucną w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS przez 30 min. Po utrwaleniu spłucz tkankę PBS. Podczas płukania przygotować roztwór barwiący X-gal (dodać 5 mM K3Fe(CN)6, (100 μl 0,5 M zapasu) 5 mM K4Fe(CN)6 (100 μl 0,5 M zapasu) 2 mM MgCl2, (20 μl 1 M zapasu) 0,01% NaDOC (50 μl 2% zapasu), 0,02% NP4O (100 μl 2% zapasu), 1 mg/ml X-gal (500 μl z 20 mg/ml podstawy) i 9,13 ml wody destylowanej do uzyskania końcowej objętości 10 ml).
  6. Usunąć resztki PBS i dodać 2 ml roztworu barwiącego X-gal do szklanej fiolki. Umieścić fiolki na tacy na shakerze. Barwieć tkanki przez 1 do 2 godzin w roztworze barwiącym X-gal. Inkubować tkankę w roztworze X-gal przez 4 godziny w celu dalszego przetwarzania i zatopienia.
  7. Zatrzymać reakcję, przemywając tkanki w 3% dimetylosulfotlenku-PBS. Spłucz w PBS, 3 razy po 5 minut każde mycie i przechowuj w 70% etanolu.
  8. Napełnij szalki Petriego 1% roztworem agarozy/PBS. Pozwól agarozie stężać. Za pomocą szklanych pipet transferowych umieść tkankę na płytkach pokrytych agarozą wypełnionych roztworem PBS. Sfotografuj całe mocowania za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Wybierz odpowiedni filtr dla jasnego pola.
  9. Aby lepiej rozróżnić miejsca barwienia X-gal, należy pobrać próbki z procesu do zatapiania i cięcia parafiny. Umieść próbki w kasetach z drobnym sitem.
    1. Aby przetworzyć próbki do zatapiania w parafinie, użyj automatycznego procesora i ustaw krótki cykl w następujący sposób: sześć zmian alkoholu: 5 minut pierwszej zmiany i 3 minuty na każdą pozostałą zmianę. Trzy zmiany ksylenu: 5 min pierwsza zmiana i 3 min następne dwie zmiany. Poprzednie kroki są wykonywane w temperaturze 30 °C. Na koniec należy wykonać trzy zmiany parafiny w temperaturze 62 °C: 25 min, 8 min i 5 min.
  10. Ustawić próbki do zatopienia z tkanką leżącą płasko na dnie łodzi do zatapiania. Ostrożnie dodaj parafinę, aby wypełnić łódkę do zatapiania. Natychmiast schłodzić na zimnej płycie stacji zatapiania do momentu zestalenia się parafiny. Usuń blok z łodzi do osadzania. Za pomocą mikrotomu wygeneruj skrawki o wielkości 6 μm. Zamontuj sekcje na szkiełkach wstępnych i suchych szkiełkach na podgrzewaczu do szkiełków ustawionym na 42 °C na 1 godzinę.
  11. Piecz szkiełka przez noc w piekarniku w temperaturze 56 ºC. Umieść szkiełka w rusztach. Deparafinizuj szkiełka z trzema zmianami 100% ksylenu każda, 10 minut każda. Użyj naczyń barwiących wypełnionych 200 ml ksylenu.
  12. Ponownie uwodnić szkiełka za pomocą stopniowanej serii EtOH (100%, 70%, 50% i 30%, 1 minuta na krok) do PBS przed barwieniem przeciwstawnym za pomocą Nuclear Fast Red przez 10 do 30 sekund. Spłucz szkiełka wodą z kranu trzy razy przez 5 minut za każdym razem, aby usunąć nadmiar Nuclear Fast Red.
  13. Odwodnić szkiełka w stopniowanej serii EtOH (50%, 70% i 100% EtOH) przed umyciem trzema zmianami ksylenu (20 zanurzeń na każdą zmianę) i poślizgnięciem pokrywy za pomocą środków montażowych na bazie ksylenu.

2. Barwienie lektyny

  1. Rozciąć tkankę tchawicy płuc E13.5 i E14.5 zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.4. Za pomocą szklanych pipet transferowych umieść tkankę w fiolkach z zakrętką. Utrwalić tchawiczą tkankę płucną za pomocą 2 ml 2% roztworu PFA przez noc w temperaturze 4 °C. Po utrwaleniu próbki należy płukać w PBS trzy razy przez 10 minut przy każdym płukaniu.
  2. Przygotować bufor blokujący, zwykle końcową objętość 10 ml roztworu. Dodać 0,1 g BSA (1%) do 8 ml PBS. Poczekaj, aż BSA się rozpuści. Dodaj 0,2 ml koziej surowicy (2%), 0,03 ml Triton X-100 (0,3%). Doprowadzić końcową objętość do 10 ml za pomocą PBS. Próbki należy blokować przez 1 godzinę w 0,5 ml buforu blokującego w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety transferowej i zastąpić roztworem lektyny składającym się z 50 μg/μl lektyny, 10% surowicy koziej i PBS. Użyć 250 μl roztworu lektyny na próbkę. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że szklana fiolka zawierająca chusteczkę jest pokryta folią aluminiową. Po inkubacji z roztworem lektyny przepłukać próbki w PBS trzykrotnie przez 10 minut.
  4. Umieść eksplantaty na pokrytych agarozą szalkach Petriego, zawierających wystarczającą ilość PBS, aby pokryć próbki. Sfotografuj całe mocowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wybierz odpowiedni filtr do wykrywania fluorescencji. Lektyna PNA jest zwykle sprzężona z GFP.

3. Barwienie immunofluorescencyjne całej góry i mikroskopia konfokalna

  1. Wyizolować tkankę płucną tchawicy, przenieść do szklanych fiolek z zakrętką o pojemności 4 ml i utrwalić na noc w 4% PFA. Tkanka E11.5 może być utrwalona w 2% PFA. Przechowywać w 100% w metanolu. Próbki mogą być przechowywane do kilku miesięcy w temperaturze -20 °C.
  2. Usuń metanol za pomocą pipety transferowej i przepuszczaj próbki za pomocą wybielacza Dent's Bleach (4 części metanolu, 1 część DMSO i 1 część 30% H2O2) przez 2 godziny. Uwodnić tkankę w stopniowanej serii metanolu rozcieńczonego w PBS w następujący sposób: 100% metanolu, 75% metanolu, 50% metanolu, 25 % metanolu, 100% PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej podczas każdego etapu nawadniania.
  3. Zablokować tkankę w 0,5% odczynniku blokującym rozcieńczonym w PBS (szczegółowe informacje znajdują się w Materiałach) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym (Sox9 1:100, Nkx2,1 1:200, αSMA 1:250) i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki przemyć pięciokrotnym PBS w temperaturze pokojowej. Wykonuj każde pranie przez 1 godzinę.
  5. Zastosować przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:500 w 0,5% roztworze blokującym. Ostrożnie dobieraj przeciwciała drugorzędowe, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnym pomieszczeniu. Próbki należy myć trzykrotnie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Próbki odwodnić w stopniowanej serii metanolu rozcieńczonego w PBS w następujący sposób: 25% metanolu, 50% metanolu, 75% metanolu, 100% metanolu, 10 minut każdy krok.
    UWAGA: Upewnij się, że próbki pozostają pokryte folią aluminiową i zminimalizuj ekspozycję na światło. Tkanka może być teraz przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni do czasu sfotografowania.
  6. Przenieść próbki na specjalnie wykonane płytki sceniczne, usunąć metanol i oczyścić około 200 μl klarownego roztworu Murraya19,20 (2 części benzoesanu benzylu, 1 część alkoholu benzylowego) bezpośrednio przed obrazowaniem. Zdjęcie za pomocą mikroskopu konfokalnego. Przetwarzaj i analizuj obraz za pomocą oprogramowania do obrazowania.

4. Proliferacja komórek

  1. Ciężarnym myszom należy wstrzyknąć E11.5 dootrzewnowo roztwór BrdU o stężeniu 100 μg BrdU/g masy ciała. Złożyć ofiarę samicy zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu i wyizolować zarodki w E12.5 lub E13.5. Za pomocą ostrzy noży, główek akcyzowych i dolnej części ciała poniżej klatki piersiowej.
  2. Umieścić tkankę klatki piersiowej w 4 ml fiolkach z zakrętką i utrwalić w 1 ml 4% PFA na noc. Przemywać próbki PBS dwukrotnie przez 5 minut i odwadniać próbki za pomocą serii etanolu rozcieńczonej w wodzie destylowanej do 70% etanolu w następujący sposób: 30%, 50% i 70% etanolu, przez 5 minut każdy etap.
    1. Umieść próbki w średniej wielkości kasetach sitowych. Przetwarzaj tkankę do zatapiania parafiny za pomocą automatycznego procesora. Ustaw cykl w następujący sposób: sześć podmian alkoholu po 8 minut każda, trzy zmiany ksylenu po 6 minut, trzy zmiany parafiny po 25 minut, 9 minut i 8 minut.
  3. Zanurzyć w parafinie, ustawiając tkankę w żądanej pozycji, aby wytworzyć przekroje poprzeczne lub podłużne o wielkości 6 μm, jak opisano w sekcji 1. Umieść skrawki na szkiełkach podstawowych i pozwól chusteczce przylegać do szkiełka nastawionego na szkiełko podstawowe ustawione w temperaturze 42 °C na 1 godzinę.
  4. Szkiełka upieczemy na boku przez noc w piekarniku w temperaturze 56 °C. Umieść szkiełka w plastikowych rusztach. Szkiełka odparafinowane przez zanurzenie w trzech zmianach 100 % ksylenu, 10 minut na zmianę. Użyj 200 ml ksylenu, aby całkowicie zanurzyć szkiełka. Nawilżać szkiełka za pomocą stopniowanych serii EtOH (100%, 70%, 50% i 30%, 5 minut na krok z mieszaniem) do PBS (5 min).
  5. Przeprowadzić pobieranie antygenu przy użyciu 10 mM buforu cytrynianowego, pH 6. Aby przygotować 100 ml buforu cytrynianowego, zmieszać 18 ml 0,1 M jednowodnego kwasu cytrynowego i 82 ml 0,1 M cytrynianu sodu.
    1. Umieść próbki w plastikowych słoikach z kopiną wypełnionych roztworem do pobierania antygenu i kuchence mikrofalowej przez 6,5 minuty z dużą mocą. Dodaj wodę destylowaną do słoika z kopinem, aby skompensować bufor odparowanego cytrynianu i podgrzewaj przy 40% mocy przez 6 minut.
    2. Napełnij słoik z kopiną do góry wodą i ponownie podgrzej przy 40% mocy przez 6 minut. Czas podgrzewania w kuchence mikrofalowej może się różnić w zależności od używanej kuchenki mikrofalowej.
    3. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed umyciem szkiełek w wodzie destylowanej przez 1 minutę, a następnie PBS przez 5 minut. Po przemyciu PBS blokować przez 2 godziny w roztworze blokującym zawierającym TBS (2,425 g zasady Tris i 8,765 g NaCl rozcieńczone w 1 l wody destylowanej), 10% surowicy osła i 1% BSA.
  6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (TBS zawierający 10% surowicy osła i 1% BSA). BrdU (marker mitozy), Nkx2.1 (nabłonek dróg oddechowych), Sox9 (komórki, które dadzą początek chrząstce) i αSMA (komórki mięśni gładkich). Szkiełka inkubować przez noc, w temperaturze 4 °C. W celu zachowania przeciwciał należy stosować metodę nakładania. Nanieść 180 μl przeciwciała na uszczelkę, a następnie przymocować szkiełko tak, jakby się ślizgało pokrywą.
  7. Odczep uszczelkę, zanurzając szkiełka w wodzie destylowanej. Po usunięciu uszczelki przemyć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe, wykonując sześć 5-minutowych płukań TBS zawierającym 0,1% Tween-20.
    1. Inkubować szkiełka z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym w rozcieńczeniu 1:200 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie dobieraj przeciwciała drugorzędowe, aby zapobiec niepożądanemu wiązaniu między nimi. Usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe, wykonując trzy pięciominutowe płukania TBS zawierającym 0,1% Tween.
    2. Szkiełka należy myć w podstawie 0,1 M Tris dwa razy przez 5 minut, a następnie dwukrotnie w bazie 0,05 M Tris przez 5 minut. Szkiełka można pozostawić w podstawie 0,05 M Tris podczas nakrywania za pomocą podłoża montażowego z DAPI lub bez (1,5 μg/ml). Szkiełka należy przechowywać w folderze na slajdy w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem, przykrywając folder folią aluminiową.
  8. Wizualizacja barwienia i fotografowanie za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego. Policz znakowane komórki i całkowitą liczbę komórek na pole sfotografowane z prędkością 20X i 40X, aby określić stosunek proliferujących komórek do całkowitej liczby komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aktywność szlaku Wnt/β-katenina

Barwienie Lac-Z całego preparatu wykryto w tkance tchawkowo-płucnej embrionów izolowanych z myszy reporterowych Axin2Lac-Z 11. Miejsca barwienia wskazują na aktywność Wnt/β-catenin. Analiza przekrojów barwienia całego preparatu wykazała, że aktywność Wnt/β-catenin występowała w mezenchymie tchawicy oraz w mezenchymie obszarów obwodowych rozwijających się p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdarzenia leżące u podstaw morfogenezy dróg oddechowych nie są w pełni poznane, w szczególności procesy wymagane do ułożenia przewodzących dróg oddechowych. W poprzednich badaniach wykorzystano techniki ex vivo , w których rozwijające się eksplantaty są hodowane w interakcji powietrze-ciecz lub zatopione w matrigel21,22. Badania te wykazały, w jaki sposób czynniki wzrostu wpływają na wzorzec rozwijającej się tchawicy i tworzenie chrząstki tchawicy. Ograniczeniem tych badań jest to, że architektura tka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

– Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za pomoc Mike'owi Muntiferingowi i Mattowi Kofronowi w obrazowaniu konfokalnym oraz Gail Macke w procedurach histologicznych. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 do D.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty Sox9 ab.MilliporeAB55351:400 , królik
Anti Sox9 ab.Santa CruzSc-200951:50, królik
Anti Smooth Muscle Actin ab.SigmaA52281:2k, mysz
Anti NKX2.1 ab.Seven Hillsn/a1:100, świnka morska
Anti NKX2.1 ab.Siedem Wzgórzn/a1:400, mysz
Anti Brdu ab.AbcamAB18931:200, owca
Anti Brdu ab.Santa CruzSc-323231:4k, mysz
PNA LectinSigmaL 7381
Przeciwciała drugorzędoweTechnologieAlexa fluor Sondy molekularne
K3Fe(CN)6SigmaP8131
K4Fe(CN)6Sigma-AldrichP3289
MgCl2Sigma-AldrichM9272
NaDOCLife Technologies89905
NP4OLife Technologies85124
Alcian Blue 8GXSigmaA-3157
Super-frost marki Fisher plusFisher12-550-15
PFA (16%)EMS15710
PBSGibco70011-044
Surowica cielęca płoduSigma11K413
Odczynnik blokującyInvitrogenSkładnik zestawu TSA #2      ( T20932)
BrDuSigmaB5002-5g
Vectashield podłoże montażoweVector labsH-1000
PermountFisherSP15-500
Kasety Tissue-loc HistoscreenFisherC-0250-GR
Kasety do biopsjiPremiereBC0109Dostępne w różnych kolorach
Nuclear fast czerwony  Kernechtrot 0,1%SigmaN3020
Kwas cytrynowySigmaC1909-500G
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnySigmaS4641-1Kg
Chlorowodorek TrizmaSigmaT5941-500G
XylenePharmco-AAPER399000000
EtanolPharmco-AAPER111000200
MikronożeFST10318-14
Dumont #5 z powłoką ceramicznąFST11252-50
Dumont #5COFST11295-20
Dumont # 5FST91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ESThermo Fisher
MicrotomeLeicaRM2135
Nikon i90Mikroskopszerokokątny
. Ustawienia: aparat NikonA1 plus, skaner: Galvano, detektor: DU4. Optyka Plan Apo lambda 10X. Modalność: Konfokal lasera fluorescencyjnego o szerokim polu.
Leica MS 16 FAMikroskop preparacyjny fluorescencyjnyLeica
Zeiss ZeissZautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny
Pakiet aplikacji Leica Oprogramowaniedoobrazowania Leica
NISNikon NikonOprogramowanie do obrazowania
IMARISBitplaneOprogramowanie do przetwarzania obrazów
życiowe Nikon NikonA1Rsi Mikroskopia konfokalna firmy Nikon

Bibliografia

  1. Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
  3. Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
  4. Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
  5. Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
  6. Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
  7. Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
  8. Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
  9. Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
  10. Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
  11. Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
  12. Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
  13. Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
  14. Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
  15. Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
  16. Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
  17. Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
  18. Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  19. Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
  20. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  21. Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
  22. Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
  23. Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  25. Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
  26. Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
  27. Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkanka embrionalnabarwienie całego preparatumikroskopia konfokalnabarwienie immunofluorescencyjnemezenchyma tchawicychondrogenezaproliferacja komórekkondensacje mezenchymalne
Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.