Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Streszczenie

Obrazowanie spektrometrii mas (MSI) i analiza spektrometrii mas in-situ pojedynczej komórki (SCMS) w warunkach otoczenia to dwie nowe dziedziny o dużym potencjale dla szczegółowej analizy spektrometrii mas (MS) biomolekuł z próbek biologicznych. Pojedyncza sonda, zminiaturyzowane urządzenie ze zintegrowanymi możliwościami próbkowania i jonizacji, jest w stanie wykonywać zarówno analizę MSI w otoczeniu, jak i analizę SCMS in-situ. W przypadku MSI otoczenia pojedyncza sonda wykorzystuje mikroekstrakcję powierzchniową do ciągłego przeprowadzania analizy MS próbki, a technika ta umożliwia tworzenie obrazów MS o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (8,5 μm) z próbek biologicznych, takich jak mózg myszy i skrawki nerek. Ambient MSI ma tę zaletę, że przed analizą nie jest wymagane żadne przygotowanie próbki, co zmniejsza ilość potencjalnych artefaktów obecnych podczas pozyskiwania danych i pozwala na bardziej reprezentatywną analizę próbki, która ma zostać pozyskana. W przypadku SCMS in-situ końcówka z pojedynczą sondą może być bezpośrednio wprowadzana do żywych komórek eukariotycznych, takich jak komórki HeLa, ze względu na mały rozmiar końcówki do pobierania próbek (< 10 μm), a technika ta jest w stanie wykryć szeroki zakres metabolitów wewnątrz pojedynczych komórek w czasie zbliżonym do rzeczywistego. SCMS umożliwia uzyskanie większej czułości i dokładności informacji chemicznych na poziomie pojedynczej komórki, co może poprawić nasze zrozumienie procesów biologicznych na bardziej podstawowym poziomie niż było to możliwe wcześniej. Urządzenie z pojedynczą sondą może być potencjalnie sprzężone z różnymi spektrometrami mas dla szerokiego zakresu badań MSI i SCMS.

Wprowadzenie

Obrazowanie spektrometrii mas (MSI) jest stosunkowo nową techniką obrazowania molekularnego, która zapewnia przestrzenny rozkład interesujących związków na powierzchniach. Podczas analizy MSI pomiary spektrometrii mas (MS) są rejestrowane na całej powierzchni na podstawie pojedynczych pikseli w celu stworzenia obrazu 2D gatunków będących przedmiotem zainteresowania ¹. Techniki MSI mają zdolność do zapewnienia przestrzennie rozdzielczego rozkładu cech dla szerokiego zakresu metabolitów, co pozwala na uzyskanie znacznie większej ilości informacji z próbki niż przy użyciu tradycyjnych technik obrazowania molekularnego, a także mają potencjał, aby znacznie poprawić analizę próbek biologicznych do badań biologicznych i farmakologicznych ². MSI można ogólnie podzielić na podejścia niezwiązane z otoczeniem i podejścia ambientowe. Techniki analizy MSI poza otoczeniem, takie jak jonizacja desorpcji laserowej wspomagana matrycą (MALDI) MS ³ i czas przelotu jonów wtórnych MS (ToF SIMS) ⁴, są zdolne do uzyskania wysokiej rozdzielczości przestrzennej (odpowiednio około 5 μm i 100 nm) i wysokiej czułości. Metody te wymagają jednak intensywnego przygotowania próbki, takiego jak nałożenie cząsteczek matrycy na powierzchnię próbki oraz środowisko próbkowania próżniowego, które może wprowadzić artefakty do uzyskanych danych. Techniki otoczenia, takie jak desorpcja, jonizacja elektronatryskowa (DESI) MS ⁵, jonizacja elektronrozpylania metodą ablacji laserowej (LAESI) MS ⁶ i nano-DESI MS ⁷, są zdolne do MSI próbek z niewielką lub żadną wcześniejszą przygotowaniem w środowisku otoczenia, co jest w stanie wytworzyć obrazy MS, które potencjalnie odzwierciedlają próbkę w jej najbardziej natywnym stanie. Jednak większość z tych technik na ogół nie ma wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czułości wykrywania w porównaniu z technikami bez otoczenia, przy czym eksperymenty są zwykle przeprowadzane przy około 150 μm na piksel ⁸.

Analiza pojedynczych komórek (SCA) to rozwijająca się dziedzina, która ma możliwość charakteryzowania składu chemicznego próbek biologicznych na poziomie komórkowym. SCA umożliwia analizę systemów biologicznych na bardziej podstawowym poziomie niż tradycyjne techniki analizy komórek, które dają uśredniony wynik populacji komórek, potencjalnie dostarczając informacji, które wcześniej były trudne do opanowania ⁹. Techniki MS zostały ostatnio zastosowane do SCA (określanej jako spektrometria mas pojedynczej komórki lub SCMS) przy użyciu technik niezwiązanych z otoczeniem, takich jak MALDI MS ¹⁰ i ToF SIMS ¹¹, w których komórki są poddawane wstępnej obróbce przed analizą, oraz technik otoczenia, takich jak LAESI MS ¹² i metod ekstrakcji bezpośredniej, takich jak wideo na żywo z pojedynczej komórki-MS ^{13, 14}, do analizy szerokiej gamy typów komórek, takich jak jaja, rośliny i rak. Techniki otoczenia mają tę zaletę, że są stosowane do żywych komórek, co ponownie minimalizuje artefakty, prowadząc do lepszej reprezentacji metabolitów w żywych komórkach. Opisane powyżej metody oparte na ekstrakcji bezpośredniej przeprowadzają jednak proces ekstrakcji i analizy próbki na dwóch różnych etapach, co powoduje przerwę czasową podczas analizy, która może potencjalnie zmienić metabolity obecne w próbce.

Pojedyncza sonda, zminiaturyzowane wielofunkcyjne urządzenie, które jest zdolne do przeprowadzania wysokiej rozdzielczości przestrzennej otoczenia MSI na sekcjach tkanek biologicznych ¹⁵ oraz SCMS w czasie zbliżonym do rzeczywistego in-situ na żywych pojedynczych komórkach ¹⁶. Pojedyncza sonda ma zintegrowaną konstrukcję, która składa się z ciągnionej kapilary kwarcowej z podwójnym otworem połączonej z wlotem rozpuszczalnika i emiterem nano-ESI wykonanym z kapilar ze stopionej krzemionki, umożliwiając dostarczanie rozpuszczalnika i ekstrakcję analitu za pomocą jednego urządzenia. W trybie otoczenia MSI pojedynczą sondę umieszcza się nad tkanką próbki i następuje mikroekstrakcja powierzchniowa, co pozwala na uzyskanie rastrowego obrazu MS w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. W szczególności stożkowa końcówka pojedynczej sondy jest na tyle mała, że można ją wprowadzić do żywych komórek eukariotycznych w celu analizy SCMS in-situ, gdzie wykrywanie metabolitów trwa mniej niż dwie sekundy między wprowadzeniem sondy a wykryciem MS, co pozwala na uzyskanie informacji chemicznych w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Poniżej przedstawiono protokoły do produkcji urządzenia z pojedynczą sondą i przeprowadzania zarówno trybów otoczenia MSI, jak i SCMS przy użyciu technik MS z jedną sondą.

Protokół

Wykorzystanie i dobrostan zwierząt powinny być zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Próbki tkanek myszy zostały dostarczone przez współpracownika dr Chuanbin Mao.

1. Przygotowanie sekcji tkanek myszy

1. Umieść cały interesujący nas narząd myszy (mózg, nerka, wątroba itp.) w środku małego plastikowego dołka (np. 12-dołkowej płytki do hodowli komórek) i zanurz w tkance osadzającej związek do wysokości około 10 mm. Upewnij się, że w związku zatapiającym tkankę nie tworzy się pęcherzyk i że narząd jest umieszczony w pożądanej orientacji (tj. strzałkowej, czołowej itp.).
2. Natychmiast umieść tkanki w ciekłym azocie w celu błyskawicznego zamrożenia. W przypadku długotrwałego przechowywania zamrożone próbki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
3. Wziąć zamrożony narząd myszy i rozmrozić do temperatury -15 °C w kriomikrotomie o kontrolowanej temperaturze.
4. Przymocuj tkankę do stalowej podstawy za pomocą około 500 μl masy do zatapiania tkanek i umieść na uchwycie do cięcia kriomikrotomu tak, aby nóż przedstawił żądaną orientację cięcia.
5. Przeciąć tkankę do grubości 12 μm. Umieść pokrojone plastry tkanki na poliwęglanowych szkiełkach mikroskopowych i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałego przechowywania zamrożone szkiełko należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

2. Hodowla komórkowa

Uwaga: Hodowla komórkowa została przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego (poziom bezpieczeństwa biologicznego II) w sterylnych warunkach. Linia komórkowa HeLa została wykorzystana jako system modelowy, a komórki hodowano w kompletnej pożywce hodowlanej przy użyciu następujących konwencjonalnych protokołów:

1. Ciepłe odczynniki (tj. trypsyna, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) i pożywka do hodowli komórkowych) do 37 °C.
   Uwaga: Pożywka do hodowli komórkowych zawiera sole nieorganiczne, aminokwasy, witaminy i inne. Pełna lista składników znajduje się w składzie producenta.
2. Pobrać próbkę komórek (np. 1 ml zawiesiny komórek HeLa) i dodać ją do 9 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych na standardowej 10-centymetrowej płytce do hodowli komórkowych. Początkowa liczba komórek wynosi około 0,5 x 10⁶ komórek/ml. Utrzymywać komórki w hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2-3 dni, aż powierzchnia wzrostu pokryje się w 70-80% na płytce do hodowli komórkowej. Zapisz liczbę przejść komórki dla każdej kolejnej rundy.
3. Wykonaj pasażowanie komórek (tj. dzielenie komórek) na płytce do hodowli komórkowej.
   1. Odessać pożywkę wzrostową i użyć 5 ml 1x PBS do przepłukania komórek. Usunąć PBS za pomocą sterylnej końcówki aspiracyjnej i inkubować komórki z 2,5 ml trypsyny (0,25%) przez ~5 minut w temperaturze 37 °C, aby odłączyć komórki od płytki hodowlanej.
      Uwaga: Rzeczywisty czas leczenia trypsyną należy zoptymalizować zgodnie z konkretnym produktem trypsynowym zakupionym od producenta. Nieodpowiedni czas leczenia pozostawia komórki przyczepione do płytki, podczas gdy nadmierne leczenie prowadzi do śmierci komórki.
   2. Zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając 7,5 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych, a następnie równomiernie ponownie zawiesić komórki (całkowita objętość 10 ml). Zawiesinę komórkową należy wykorzystać do hodowli (etap 2.2) lub przygotowania próbek SCMS (etap 2.4).
4. Przygotuj próbki komórek do eksperymentów SCMS.
   1. Umieść pojedyncze szkiełka z mikro pokrywką na 12-dołkowej płytce i dodaj do dołka 1,8 ml pożywki do hodowli komórkowych i 0,2 ml zawiesiny komórek.
   2. Delikatnie wymieszać komórki z łagodnym mieszaniem płytki i inkubować w środowisku 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez ~24 godziny. Aby przeprowadzić leczenie farmakologiczne hodowanych komórek, dodać roztwór związku leczniczego (np. w DMSO (dimetylosulfotlenek)) do 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
      Uwaga: Końcowe stężenie leku (np. 10 nM, 100 nM, 1 μM i 10 μM) i czas leczenia (np. 4 godziny) różnią się w zależności od konkretnego celu badań. Komórki są przymocowane do mikro szkiełek i gotowe do eksperymentów CSMS (krok 6).

3. Produkcja z pojedynczą sondą

1. Umieść rurkę kwarcową z podwójnym otworem (średnica wewnętrzna (ID) 127 μm, średnica zewnętrzna (OD) 500 μm) w laserowym ściągaczu do mikropipet i pociągnij igłę kwarcową o podwójnym otworze. Jako punkty wyjścia należy przyjąć następujące parametry: Heat = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del =150 i Pul = 250 (wszystkie jednostki są jednostkami producenta). Upewnij się, że ciągnięta igła kwarcowa z podwójnym otworem ma zwężającą się końcówkę, aby zapewnić optymalne właściwości sondy. Przytnij wyciągniętą końcówkę tak, aby na drugim końcu pozostała nienaciągnięta kapilara kwarcowa o podwójnym otworze o długości ~5 mm.
   Uwaga: Rzeczywiste parametry ściągacza laserowego powinny być zoptymalizowane zgodnie z konkretnymi warunkami urządzenia.
2. Wytnij ~80 mm odcinek kapilary ze stopionej krzemionki (ID 40 μm, OD 105 μm) jako rozpuszczalnik dostarczający kapilę i włóż go do jednego otworu na płaskim końcu igły kwarcowej z podwójnym otworem.
3. Wytnij ~40 mm odcinek kapilary ze stopionej krzemionki (ID 40 μm, OD 105 μm) i użyj brzytwy, aby ogolić ~5 mm powłoki poliimidowej od punktu środkowego. Użyj płomienia propanu, aby szybko podgrzać i wciągnąć stopioną kapilę do emitera jonizacji nano-elektronrozpylania (ESI) z drobnym stożkiem. Wytnij emiter nano-ESI (o długości ~7-10 mm) i włóż go do drugiego otworu na płaskim końcu igły kwarcowej z podwójnym otworem. Alternatywnie użyj ściągacza laserowego, aby uzyskać drobny stożek.
4. Nałóż minimalną ilość (~1-2 μl) żywicy utwardzanej promieniami UV na płaski koniec igły kwarcowej z podwójnym otworem i zestal żywicę za pomocą lampy LED UV przez ~20 sekund, aby zabezpieczyć rozpuszczalnik zapewniający kapilarność i emiter nano-ESI. Procedury montażu poszczególnych części w pojedynczą sondę przedstawiono na rysunku 1a.
5. Przetnij standardowe szkiełko mikroskopowe (1" x 3") na pół wzdłuż. Umieść pojedynczą sondę na jednym końcu szklanego szkiełka tak, aby emiter nano-ESI był skierowany na zewnątrz. Nałóż zwykłą żywicę epoksydową na korpus pojedynczej sondy tak, aby została przymocowana do szkiełka podstawowego (Rysunek 1b). Pozostaw na noc do stwardnienia. Sprzęgnij wyprodukowaną pojedynczą sondę ze zintegrowanym zestawem z pojedynczą sondą (rysunek 1c), który jest podłączony do spektrometru mas, jak pokazano na rysunku 1d.

4. Zbuduj zintegrowaną konfigurację MS z pojedynczą sondą

1. Zmodyfikuj kołnierz interfejsu źródła jonów spektrometru mas i wyprodukuj statyw (z regulowaną pozycją i wysokością) cyfrowego stereoskopu (rysunki 1e i 1f).
   1. Wywierć kołnierz interfejsu źródła jonów z dwoma otworami umożliwiającymi zamocowanie aluminiowej płytki optycznej. Wykonać szynę ślizgową i pręt regulacji wysokości (przymocowany do stolika XY w celu precyzyjnego dostrojenia pozycji), tak aby cyfrowy system stereoskopowy można było przymocować do aluminiowej płytki optycznej (rysunek 1e).
2. Przymocuj zmodyfikowany cyfrowy mikroskop stereoskopowy, mikroskop cyfrowy USB, miniaturowy ręczny stolik translacyjny XYZ z elastycznym uchwytem zaciskowym, zmotoryzowany system stolika translacyjnego XYZ do aluminiowej płytki optycznej, która jest zamontowana na niestandardowym kołnierzu interfejsu źródła jonów spektrometru mas (rysunki 1c i 1f). Użyj elastycznego clamp uchwyt, aby zamocować szklaną szkiełko przymocowane za pomocą pojedynczej sondy.
3. Podłącz konfigurację z pojedynczą sondą do spektrometru mas (rysunek 1f). Wyreguluj elastyczny uchwyt zaciskowy i miniaturowy stolik XYZ, aby umieścić emiter pojedynczej sondy przed wlotem spektrometru masowego. Użyj mikroskopu cyfrowego USB (z regulowanym kątem widzenia) z boku pojedynczej sondy, aby uzyskać powiększony obraz końcówki pojedynczej sondy lub emitera nano-ESI, oraz cyfrowego stereoskopu (z regulowaną wysokością) nad pojedynczą sondą, aby view komórki i końcówka sondy.
   Uwaga: Korzystając z odpowiedniego kołnierza źródła jonów, ten zintegrowany system z pojedynczą sondą może być sprzężony z dowolnymi innymi typami spektrometrów masowych wyposażonych w źródła jonizacji otoczenia.

5. Otoczenie MSI

1. Rozmrozić fragment próbki w temperaturze pokojowej i umieścić go na zmotoryzowanym systemie stolika translacyjnego XYZ pod pojedynczą sondą. Dostosuj pozycję próbki, zmieniając współrzędne w oprogramowaniu sterującym.
2. Za pomocą strzykawki przepompować rozpuszczalnik do pobierania próbek z odpowiednią szybkością (np. 0,2 μl/min) i przyłożyć napięcie jonizacji (np. 5 kV). Dobór rozpuszczalnika do pobierania próbek jest elastyczny, a do najczęściej spotykanych należą MeOH:woda (9:1) i acetonitryl. Objętość martwa emitera nano-ESI oszacowano na ~3 nl, a czas między kontaktem sondy-powierzchnia a obserwacją sygnału jonowego wynosi zwykle mniej niż 1 sek ¹⁵,
   Uwaga: Dostosowany kołnierz interfejsu źródła jonów umożliwia dostarczenie napięcia jonizacji ze spektrometru mas do złącza przewodzącego przez zacisk krokodylkowy. Napięcie jonizacji jest następnie przenoszone przez przewodzące złącze do rozpuszczalnika wewnątrz kapilary i kanałów z pojedynczą sondą i nakładane na emiter nano-ESI w celu jonizacji pobranych analitów. Upewnij się, że jonizacjatage jest wyłączone podczas łączenia zacisku krokodylkowego ze złączem przewodzącym.
3. Dostosować wysokość pojedynczej sondy tak, aby spoczywała tuż nad powierzchnią próbki i była w stanie przeprowadzić ekstrakcję powierzchniową metabolitów. Ostrożnie podnieś stolik Z, a następnie użyj mikroskopu cyfrowego USB (z boku pojedynczej sondy), aby monitorować zmianę odległości między końcówką pojedynczej sondy a powierzchnią tkanki. Monitoruj zmiany w widmie masowym podczas tej regulacji wysokości i przestań podnosić stopień Z, gdy zaobserwuje się zmianę sygnału jonowego z tła rozpuszczalnika na metabolity tkankowe.
4. Powtórz krok 5.3 trzy razy, aby ustawić trzy różne punkty w programie sterowania stolikiem w celu automatycznej regulacji spłaszczania powierzchni. Umieść końcówkę pojedynczej sondy w trzech punktach na powierzchni próbki w odległości około 10 mm od siebie. Wykonaj regulację wysokości, naciskając ikony w górę i w dół, a następnie zablokuj trzy punkty w pozycji w ramach "Metody planowania".
5. Za pomocą tego programu można ustawić inne parametry rastrowania w poprzek interesującego nas przekroju w próbce. W przypadku przedstawionych tutaj odcinków nerki myszy należy użyć prędkości rastrowej 10,0 μm/s i odległości między liniami 20 μm. Zmotoryzowany system stolika ma minimalny ruch przyrostowy 0,1 μm. Odległość między końcówką pojedynczej sondy a tkanką uzyskuje się z kroku 5.3.
6. Skonfiguruj metodę automatycznego pozyskiwania widm MS ze spektrometru mas. Aby uzyskać MSI o wysokiej rozdzielczości masowej na próbce nerki myszy, użyj następujących parametrów: rozdzielczość masowa 60 000 (m/Δm), tryb dodatni ~5 kV, 1 mikroskop, maksymalny czas wstrzyknięcia 150 ms i AGC włączone. Wszystkie uzyskane widma MS reprezentujące poszczególne linie obrazu MS miały taką samą liczbę skanów z jednolitymi odstępami czasowymi między każdym skanem, co wskazuje, że rozmiary pikseli dla wytworzonych obrazów były równomiernie rozłożone.
7. Rozpocznij pobieranie danych MSI. Zainicjuj sekwencję akwizycji MS dla spektrometru mas, a następnie zainicjuj sekwencję rastrową dla programu sterującego XYZ.
   1. Na przykład w używanym tutaj programie do akwizycji danych MS przejdź do "Ustawienia sekwencji", wybierz "Nowa sekwencja", wygeneruj zestaw plików dla nowej sekwencji o numerze od 01 do X, gdzie X to liczba wierszy użytych do wykonania żądanego obrazu MS, a następnie naciśnij "Uruchom sekwencję".
   2. Użyj domowego urządzenia elektronicznego, aby umożliwić oprogramowaniu wytworzenie sygnału zamknięcia styku dla spektrometru mas w celu zebrania danych. Schemat obwodu pokazano na rysunku uzupełniającym (rysunek S1) jako odniesienie.
8. Skonstruuj obrazy MS z surowych plików MS za pomocą odpowiedniego oprogramowania do wizualizacji MSI. Na przykład w przypadku korzystania z pakietu oprogramowania opracowanego przez grupę Laskina pod adresem PNNL ¹⁷ należy wykonać następujące czynności.
   1. Kliknij "Brows File" (Plik przeglądań). Wybierz pierwszy plik uzyskany z eksperymentu MSI. Określ miejsce rozpoczęcia i zakończenia pliku w polu "Liczba wierszy". Wybierz zakres wartości m/z dla zakresu obrazów MS w polu "Wprowadź zakres MZ".
   2. Naciśnij przycisk "Start", aby rozpocząć proces tworzenia obrazu. Po utworzeniu obrazu MS kliknij "Zapisz obraz" w "Pasku narzędzi", aby zapisać obrazy na komputerze.

6. SCMS na żywo na miejscu

1. Skonfiguruj system z jedną sondą zgodnie z instrukcjami dla MSI. Dostosuj natężenie przepływu rozpuszczalnika (np. MeOH/H₂O lub acetonitrylu) (np. ~25 nl/min).
2. Umyj hodowane komórki, które są przymocowane do szkiełek z mikro pokrywą, PBS w celu usunięcia pożywek hodowlanych i zewnątrzkomórkowych składników leku. Umieść komórkę zawierającą szkiełko w zmotoryzowanym systemie etapu translacji XYZ w celu eksperymentu.
   Uwaga: Alternatywnie można użyć pożywki do hodowli świeżych komórek (bez zawierającej płodowej surowicy bydlęcej) do przepłukania hodowanych komórek. Zaobserwowano mniejszą supresję jonów. Ponadto komórka może przetrwać przez dłuższy czas podczas eksperymentu, w którym temperatura otoczenia (~20 °C) jest znacznie niższa niż temperatura hodowli (37 °C). Rodzaj leku, stężenie roztworu i czas leczenia różnią się w różnych badaniach.
3. Ustaw cyfrowy mikroskop stereoskopowy (nad próbką) na końcówce pojedynczej sondy, aby monitorować penetrację komórek podczas analizy. Użyj mikroskopu cyfrowego USB (z boku pojedynczej sondy), aby monitorować warunki pracy emitera nano-ESI na pojedynczej sondzie.
4. Użyj zmotoryzowanego programu sterującego stolikiem XYZ i cyfrowego mikroskopu stereoskopowego (nad komórkami), aby zlokalizować interesującą komórkę i precyzyjnie ustawić końcówkę pojedynczej sondy nad próbką. Rozpocznij akwizycję danych MS przed włożeniem końcówki pojedynczej sondy do komórki.
   1. Użyj następujących parametrów jako odniesień do analizy MS przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości: rozdzielczość masowa 100 000 (m/Δm), tryb dodatni i ujemny ~3 kV, 1 mikroskop, maksymalny czas wstrzykiwania 150 ms, włączony tryb AGC. Automatyczne pozyskiwanie widm MS odbywa się poprzez kliknięcie "Start" w programie do akwizycji danych MS.
   2. Podnieś zmotoryzowany stopień Z, klikając ikonę, aby przeniknąć przez błonę komórkową i kontynuować nagrywanie sygnału MS generowanego z komórki. Zwykle obserwuje się opóźnienie czasowe wynoszące 1-2 sekundy między włożeniem sondy a wykryciem sygnału MS. Jako drugie potwierdzenie penetracji komórki, po penetracji błony komórkowej można zaobserwować dramatyczną zmianę sygnałów SM. Sygnały MS związków wewnątrzkomórkowych zwykle mogą trwać przez ~ 15-20 sekund, zanim znacznie się zmniejszą.
   3. Opuść płytkę zawierającą celę, aby wyciągnąć końcówkę pojedynczej sondy z ogniwa. Zwykle potrzeba <15 sekundy, aby sygnały jonowe związków komórkowych zbliżyły się do poziomu szumu. Pozwól rozpuszczalnikowi przepływać przez ~ 3 minuty, aby całkowicie przepłukać pojedynczą sondę. W międzyczasie ustaw zmotoryzowany system stolika XYZ, aby zlokalizować następną komórkę do analizy. Każdy eksperyment z komórką wymaga wykonania ~3 minut.

Wyniki

Pojedyncza sonda została z powodzeniem wykorzystana do analizy otoczenia MSI wyciętej tkanki nerkowej myszy ¹⁵. Urządzenie wykorzystuje mechanizm mikroekstrakcji cieczy powierzchniowej (ryc. 1a), który zapewnia wysoce wydajną ekstrakcję analitu z małego obszaru, co prowadzi do dużej intensywności sygnałów jonowych w wynikach MSI. Na przykład intensywność sygnału większa niż 10⁷ została osiągnięta dla niektórych obfitych metabolitów (ryc. 2a). W ten sposób wykryto dużą liczbę metabolitów, w tym szereg gatunków sfingomieliny (SM) i fosfatydylocholiny (PC), takich jak [SM (34:1) + Na]⁺ (725,5575 m/z), [PC (32:0) + H]⁺ (734,5700 m/z), [PC (34:1) + Na]⁺ (782,5696 m/z) i [PC (38:5 + Na)]⁺ (814,5726 m/z)). Związki te zidentyfikowano z wysoką rozdzielczością masową i dokładnością masy po sprzężeniu ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości. Na przykład, identyfikacja została osiągnięta z dokładnością masową mniejszą niż 4 ppm m/z (tj. różnicą między wartościami obserwowanymi a teoretycznymi) dla każdego metabolitu (rysunek 2b) w prezentowanych tutaj wynikach. Ponadto przeprowadzono również tandemowe analizy MS (tj. MS/MS) w celu dokładniejszej identyfikacji gatunków będących przedmiotem zainteresowania. ¹⁵

Ze względu na możliwość przeprowadzenia efektywnej mikroekstrakcji cieczy na małym obszarze, urządzenie z pojedynczą sondą może być używane do przeprowadzania eksperymentów MSI o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w warunkach otoczenia¹⁵. Na przykład uzyskano szczegółowe obrazy stwardnienia rozsianego wycinków nerek myszy ilustrujące rozkład przestrzenny wybranych metabolitów (ryc. 2c). Rozdzielczość przestrzenna obrazu MS została określona na 8,5 μm, zgodnie z powszechnie stosowaną metryką polegającą na określeniu punktu przejścia ostrej cechy w zakresie 20-80% zmiany intensywności sygnału MS. ¹⁸ W przypadku fosfolipidu [PC (38:5 + Na)]⁺ _{na mysim} odcinku nerkowym, przejście między rdzeniem wewnętrznym a rdzeniem zewnętrznym odbywa się w ciągu jednego cyklu skanowania chronogramu, wykazując zmianę intensywności większą niż 20-80% zakresu. Na podstawie prędkości ruchu próbki (10,0 μm/s) i szybkości akwizycji danych MS (0,85 s/widmo) można obliczyć odległość ruchu próbki w jednym cyklu skanowania MS (8,5 μm), tj. rozdzielczość przestrzenną MSI (rysunek 2d). Ta rozdzielczość przestrzenna jest jedną z najwyższych osiągniętych do tej pory dla technik MSI w otoczeniu przeprowadzonych na próbkach biologicznych.

Dla SCMS pojedyncza sonda była w stanie przeprowadzić analizę pojedynczych żywych komórek HeLa ¹⁶. Rozmiar końcówki pojedynczej sondy jest zwykle mniejszy niż 10 μm (ryc. 3a), co jest wystarczająco małe, aby można je było bezpośrednio wprowadzić do wielu typów komórek eukariotycznych, których średnica wynosi ~10 μm, w celu ekstrakcji i analizy MS. Proces wprowadzania końcówki pojedynczej sondy do komórki może być wizualnie monitorowany za pomocą cyfrowego mikroskopu stereoskopowego (ryc. 3b), a penetrację błony komórkowej można potwierdzić poprzez szybką i znaczącą zmianę widm masowych z PBS (lub pożywki do hodowli świeżych komórek) na związki wewnątrzkomórkowe (ryc. 3c i 3d). Eksperymenty można przeprowadzać zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych, aby wykryć szersze typy gatunków molekularnych. Na przykład 18 różnych gatunków lipidów zidentyfikowano w trybie dodatnim, w tym sfingomieliny (SM) i fosfatydylocholiny (PC), podczas gdy fosforany adenozyny (AMP, ADP i ATP) wykryto w trybie jonów ujemnych (ryc. 3c i d). Opóźnienie czasowe między wprowadzeniem pojedynczej sondy do komórki a wykryciem sygnału było zwykle mniejsze niż dwie sekundy, co pozwalało na wykrywanie metabolitów komórkowych w czasie zbliżonym do rzeczywistego. SCMS zastosowano również w eksperymentach, w których komórki leczono lekami przeciwnowotworowymi (np. OSW-1, paklitakselem i doksorubicyną) ¹⁹]. Odpowiednie leki można wykryć w komórkach HeLa po 4-godzinnym leczeniu w serii stężeń (tj. 10 nM, 100 nM, 1 μM i 10 μM) w DMSO (dimetylosulfotlenek), przy użyciu komórek nietraktowanych (dodać tylko DMSO) jako kontrolnych. Sygnały MS leków nie były obecne w zewnątrzkomórkowym PBS ani w grupie kontrolnej (Figura 3e), ale zostały wykryte w pojedynczych komórkach za pomocą techniki SM z pojedynczą sondą (tylko wyniki leczenia 100 nM pokazano na Figurze 3f). Ponieważ komórki przepłukano PBS (lub świeżą pożywką do hodowli komórkowych) w celu usunięcia związków zewnątrzkomórkowych i zanieczyszczeń, wykrycie endogennych metabolitów (np. lipidów komórkowych i fosforanów adenozyny) i związków egzogennych (np. leków przeciwnowotworowych) wskazuje, że technika MS z pojedynczą sondą może być stosowana do analizy związków wewnątrzkomórkowych.

Rysunek 1. Produkcja i konfiguracja pojedynczej sondy do analizy otoczenia MSI i SCMS. a) Procedury wytwarzania pojedynczej sondy. b) Fotografia spreparowanej pojedynczej sondy przymocowanej do szkiełka podstawowego. c) Fotografia zestawu z pojedynczą sondą podłączoną do spektrometru mas. d) Schemat konfiguracji z pojedynczą sondą sprzężoną ze spektrometrem masowym. Podczas eksperymentu rozpuszczalnik do pobierania próbek jest stale dostarczany ze strzykawki, napięcie jonizacji jest przykładane do złącza przewodzącego ze spektrometru masowego, dwa mikroskopy cyfrowe służą do monitorowania umieszczania próbki, zmotoryzowany system stolika XYZ służy do kontrolowania ruchu próbki, a spektrometr masowy służy do analizy. e) Zdjęcie dostosowanego cyfrowego systemu stereoskopowego. f) Fotografia przedstawiająca stereoskop cyfrowy przymocowany do kołnierza interfejsu źródła jonów za pomocą płytki optycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wyniki badania MSI w otoczeniu mysiego wycinka nerki o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i masowej. a) Reprezentatywne widmo masowe z pojedynczej sondy MSI. Maksymalna intensywność wykrywanych metabolitów może osiągnąć 3,39 x^10,7 (dowolne jednostki). b) Wybór wykrytych metabolitów przedstawiony z dokładnością do ich masy. c) Obrazy MS [PC(32:0) + H]⁺ i [PC(34:1) + Na]⁺ wykonane z mysiego przekroju nerki w rozdzielczości przestrzennej 8,5 μm. PC: fosfatydylocholina. Podziałka: 2 mm; 0,20 mm (wkładka). d) Określenie rozdzielczości przestrzennej obrazu MS dla [PC(38:5) + Na]⁺ (zaadaptowane za zgodą z odnośnika 15). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Wyniki analizy SCMS otoczenia komórek HeLa traktowanych lekami z wysoką rozdzielczością masy. a) Powiększone zdjęcie końcówki pojedynczej sondy o typowym rozmiarze < średnicy 10 μm. b) Zdjęcie wykonane w miejscu wprowadzenia pojedynczej sondy do komórki HeLa. Podziałka skali: 50 μm. c) Typowe widmo masowe w trybie jonów dodatnich z identyfikacją wielu gatunków PC (fosfatydylocholiny). d) Reprezentatywna lista metabolitów wykrytych w wyniku analizy SCMS komórek HeLa zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych. e-f) Widma masowe dla komórek kontrolnych i poddanych działaniu substancji (100 nM OSW-1) (dostosowane za zgodą z odnośnika 16). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek S1. Schemat obwodu urządzenia elektronicznego używanego do wytwarzania sygnału zamknięcia styku dla spektrometru mas w celu zbierania danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić lub pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Pojedyncza sonda to wielofunkcyjne urządzenie, które może być używane zarówno do eksperymentów MSI, jak i SCMS. Konfiguracja z pojedynczą sondą (w tym systemy stolików translacyjnych, mikroskopy, kołnierz interfejsu źródła jonów itp.) została zaprojektowana jako element dodatkowy, który można elastycznie dostosować do istniejącego spektrometru masowego. Szybka wymiana między konfiguracją z pojedynczą sondą a konwencjonalnym źródłem jonów ESI może być zrealizowana w ciągu jednej minuty. Zasadniczo, przy użyciu odpowiedniego kołnierza interfejsu źródła jonów, konfigurację z pojedynczą sondą można dostosować do dowolnych innych spektrometrów masowych. Dodatkowo, rozpuszczalnik do pobierania próbek zawierający różne odczynniki może być używany z konfiguracją z pojedynczą sondą do reaktywnych eksperymentów MSI i SCMS, co znacznie usprawnia wykrywanie szerszych zakresów biomolekuł. Oprócz tkanek zwierzęcych i linii komórkowych, pojedyncza sonda jest również w stanie analizować inne systemy biologiczne, takie jak rośliny. W związku z tym, przy tej samej konfiguracji eksperymentalnej i podobnym szkoleniu użytkowników, różne badania mogą być wykonywane przy użyciu jednego urządzenia i przez tych samych użytkowników, co pozwala na przeprowadzanie wydajnych i wszechstronnych eksperymentów przy minimalnym czasie szkolenia i kosztach oprzyrządowania.

Kluczowym elementem techniki MS z pojedynczą sondą jest sama sonda. Jakość pojedynczej sondy ma znaczący wpływ na jej wydajność, co w dużej mierze decyduje o jakości eksperymentów zarówno MSI, jak i SCMS. Podczas wytwarzania pojedynczych sond należy upewnić się, że kapilary wewnątrz rurki z podwójnym otworem są bezpiecznie sklejone, aby wyeliminować ryzyko wycieku rozpuszczalnika podczas eksperymentów. Bardzo ważne jest, aby użyć minimalnej ilości żywicy epoksydowej utwardzanej promieniami UV, tak aby otwory i kapilary nie były zatkane podczas produkcji sondy.

Pojedyncza sonda została wykorzystana do przeprowadzenia MSI otoczenia o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i masowej na próbkach biologicznych ¹⁵. Główną zaletą MSI w temperaturze otoczenia w porównaniu z metodami nieopartymi na temperaturze otoczenia jest to, że przygotowanie próbki jest ograniczone do minimum, bez potrzeby stosowania środowiska pobierania próbek próżniowych, co pozwala na analizę próbki w stanie zbliżonym do natywnego ⁸. Jedną z głównych przeszkód dla większości innych technik otoczenia MSI był brak rozdzielczości przestrzennej ¹. W porównaniu z technikami MSI opartymi na desorpcji (takimi jak DESI i LAESI), mały rozmiar końcówki pojedynczej sondy pozwala na przeprowadzenie bardziej niezawodnej i wydajnej mikroekstrakcji cieczy powierzchniowej na małym obszarze, co prowadzi do wysokiej rozdzielczości przestrzennej 8,5 μm, która jest jedną z najwyższych osiągniętych przy użyciu technik MSI w otoczeniu ¹⁵. Ponadto dostosowanie składników rozpuszczalnika do pobierania próbek zapewnia dodatkową elastyczność w przeprowadzaniu eksperymentów. Na przykład do przeprowadzenia reaktywnych eksperymentów MSI wykorzystano rozpuszczalniki do pobierania próbek zawierające odczynniki (np. związki dikationowe), co pozwoliło na znaczne zwiększenie liczby metabolitów zidentyfikowanych w jednym eksperymencie ²⁰. Kolejną zaletą pojedynczej sondy jest zintegrowana konstrukcja, która zapewnia łatwość obsługi podczas całego procesu akwizycji danych. Ponieważ odległość między końcówką a powierzchnią tkanki jest bardzo wrażliwa na intensywność i stabilność sygnału jonowego, uzyskanie płaskiego przekroju tkanki i przeprowadzenie regulacji spłaszczenia powierzchni w celu zminimalizowania odchylenia odległości jest kluczem do wysokiej jakości eksperymentów MSI. Wynika z tego, że techniki MSI z pojedynczą sondą nie są odpowiednie do uzyskiwania wysokoprzestrzennych obrazów MS nierównych powierzchni.

Oprócz wyprodukowania wysokiej jakości sondy, staranne dostrojenie instrumentu jest niezbędne do udanego eksperymentu MSI. Spośród wszystkich etapów strojenia, najbardziej krytyczna jest regulacja wysokości końcówki pojedynczej sondy nad powierzchnią przekroju tkanki. Podczas regulacji wysokości sondy należy przepompować rozpuszczalnik do pobierania próbek i włączyć napięcie jonizacji, tak aby można było zaobserwować tylko sygnały jonów tła rozpuszczalnika. Następnie monitoruj zmianę widma masowego, ostrożnie zmniejszając odległość sondy-powierzchnia, podnosząc zmotoryzowany stopień Z, aż będzie można zaobserwować silne i stabilne sygnały jonowe z przekroju tkanki; ta wysokość sondy zostanie wykorzystana do zbierania danych MSI podczas eksperymentu. Ponadto zoptymalizowane natężenie przepływu rozpuszczalnika jest niezbędne w eksperymentach MSI. Dostosuj natężenie przepływu za pomocą zoptymalizowanej wysokości sondy. Upewnij się, że na powierzchni tkanki nie ma rozprowadzonego rozpuszczalnika (tj. natężenie przepływu jest zbyt wysokie) lub nie tworzy się pęcherzyki wewnątrz emitera nano-ESI (tj. natężenie przepływu jest zbyt niskie).

Pojedyncza sonda jest wielofunkcyjnym urządzeniem do bioanalizy. Oprócz eksperymentów MSI, jest w stanie przeprowadzać SCMS in-situ w czasie zbliżonym do rzeczywistego w celu wyjaśnienia szczegółowych informacji chemicznych z żywych komórek eukariotycznych¹⁶, co jest główną zaletą w porównaniu z innymi technikami SCMS opartymi na próżni (takimi jak MALDI¹⁰ i SIMS²¹). Niewielki rozmiar końcówki sondy zapewnia możliwość wprowadzenia jej do żywej komórki eukariotycznej oraz ekstrakcji i jonizacji związków wewnątrzkomórkowych w celu natychmiastowej analizy stwardnienia rozsianego. Podobnie, rozpuszczalniki do pobierania próbek zawierające odczynniki (np. związki dicationowe) mogą być używane w eksperymentach SCMS, a w żywej pojedynczej komórce można wykryć szerszy zakres składników komórkowych niż kiedykolwiek wcześniej (trwające badania, dane nie są pokazane). Chociaż analiza w czasie rzeczywistym dostarczy profili chemicznych żywych pojedynczych komórek, ze względu na penetrację błony komórkowej i ekstrakcję zawartości komórkowej, badana komórka zostanie zabita po eksperymencie, co oznacza, że technika SCMS z pojedynczą sondą jest nadal metodą destrukcyjną. Ponadto końcówka sondy i emiter nano-ESI w pojedynczej sondzie mogą być łatwo zatkane przez niedoświadczonych użytkowników. Aby zmniejszyć ryzyko zatkania urządzenia, należy unikać dotykania jądra podczas wkładania końcówki pojedynczej sondy do komórki. Jeśli dojdzie do zatkania, urządzenie można zregenerować, podgrzewając zatkaną końcówkę sondy lub emiter nano-ESI za pomocą domowej cewki grzewczej¹⁶. Innym ograniczeniem techniki SCMS z pojedynczą sondą jest to, że tylko komórki adhezyjne (tj. komórki są przymocowane do powierzchni) mogą być analizowane przy użyciu bieżącej konfiguracji. Jednak dzięki włączeniu systemu manipulacji komórkami do aparatu SM z pojedynczą sondą, w przyszłości można badać szersze typy komórek.

Podobnie jak w przypadku eksperymentu MSI, uzyskanie wysokiej jakości sondy i zoptymalizowanego natężenia przepływu rozpuszczalnika ma kluczowe znaczenie dla badań SCMS. Podczas dostrajania natężenia przepływu rozpuszczalnika, końcówka pojedynczej sondy jest umieszczana nad próbką (tj. nie ma kontaktu z komórką lub pożywką hodowlaną) i upewnij się, że z końcówki sondy nie kapie rozpuszczalnik ani nie tworzy się pęcherzyków wewnątrz emitera nano-ESI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Produkcja pojedynczej sondy
Rurka kwarcowa dwuotworowa, 1.120' ’ &czasy; 0,005" &czasy; 12"	Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ	MBT-005-020-2Q
Ściągacz laserowy do mikropipet	Sutter Instrument Co., Novato, CA	Model P-2000
Kapilara z topionej krzemionki, ID: 40  &mikro; m, OD: 110  &mikro; m	Molex, Lisle, IL	TSP040105
żywica utwardzana promieniami UV	Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA	Nr artykułu 006.030
Lampa UV LED	Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, Chiny	LY-C240
Żywica epoksydowa	Devcon, Danvers, MA	Nr kat. 20945
Mikrofiltr liniowy	IDEX Zdrowie & Science LLC, Jezioro Leśne, IL	M-520
Microunion	IDEX Zdrowie & Science LLC, Lake Forest, IL	M-539
Szkiełko mikroskopowe (szkło)	C & Naukowy - premiera, Manassas, VA	9105
Strzykawka	Hamilton, Reno, NV	1725LTN 250UL
Spektrometr masowy
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	Oprogramowanie LTQ Orbitrap XL
Xcalibur 2.1	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA
Fance Stage Control	Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
MSI QuickView	Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
Urządzenie zamykające kontakty
USB-6009 Multifunction DAQ	National Instruments, Austin, TX	779026-01
DR-5V SDS Przekaźnik	Panasonic, Kadoma, Japonia	DR-SDS-5
Bramki logiczne 50 Ohm Sterownik	liniowy Texas Instruments, Dallas, TX	SN74128N
Konfiguracja z jedną sondą
Zmotoryzowany stolik liniowy i kontroler (3 zestawy)	Newport, Irvine, CA	Conex-MFACC
Miniaturowy stolik XYZ	Newport, Irvine, CA	MT-XYZ
Tłumaczenie Stopień XY	ThorLab, Newton, NJ	PT1 i PT102
Thermo LTQ XL kołnierz interfejsu źródła jonów	Nowy obiektyw, Woburn, MA	PV5500
Cyfrowy mikroskop stereoskopowy, 250X - 2,000X	Shenzhen D& F Co., Shenzhen, Chiny	Supereyes T004
USB	DX.com, Hongkong, Chiny	S02 25~500X
Pompa strzykawkowa	Chemyx Inc., Stafford, TX	Nexus 3000
Solidna aluminiowa płytka optyczna do krojenia chlebowego, 8" x 8" x 1/2"	Thorlabs, Newton, NJ	MB810
Elastyczny uchwyt zaciskowy	Siskiyou, Grants Pass, LUB	MXB-3h
Rozpuszczalniki
Metol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34860 Chromasolv
Water	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	W4502
Acetonitryl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34967 Chromasolv
Hodowla komórkowa
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)	Cellgro, Manasas, VA	10-013-CV
10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco/Life Technologies, Long Island, NY	10100-139
Penicylina/Streptomycyna	Cellgro, Manasas, VA	30-002-CI
10 mM HEPES (pH 7,4)	Cellgro, Manasas, VA	25-060-CI
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Cellgro, Manasas, VA	46-013-CM
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	12604-013
Płytki 12-dołkowe	Corning Inc., Corning, Nowy Jork	Kolba Falcon 351143
T25	Corning Inc., Corning, Nowy Jork	Okulary Micro Cover Falcon 3055
okrągłe, nr 1	VWR International, Radnor, PA	48380-046
DMSO (sulcotlenek dimetylu)	VWR International, Radnor, PA	BDH1115-1LP
Obrazowanie tkanek
Cyro-Cut Microtome	American Optical Coporation
Tissue-Tek, Optymalna temperatura cięcia (OCT)	Sakura Finetek Inc., Torrance, CA	4583
Szkiełko mikroskopowe (poliwęglan)	Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL	P11011P