Artykuł metodologiczny

Dożylne badanie endotoksyn u zdrowych ludzi: eksperymentalna platforma do badania i modulowania ogólnoustrojowego stanu zapalnego

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53913

⸱

16 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Clinical Pharmacology, Division of Medicine, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Dożylne podawanie endotoksyny niezawodnie wywołuje zależne od dawki fizjologiczne i immunologiczne zmiany zgodne z kilkoma stanami patologicznymi. To redukcjonistyczne podejście pozwala na badanie, modelowanie i eksperymentalną modyfikację ogólnoustrojowego zapalenia i jego dalszych skutków u człowieka.

Streszczenie

Aktywacja szlaków zapalnych stanowi centralny mechanizm w wielu stanach chorobowych, zarówno ostrych, jak i przewlekłych. Wspólne szlaki biochemiczne, wyzwalane przez patogeny lub motywy molekularne związane z uszkodzeniem tkanki, prowadzą do konserwatywnych, ale zmiennych zmian fizjologicznych i immunologicznych. Oczekuje się, że analiza i nakreślenie determinantów i mechanizmów leżących u podstaw fenotypowej zmienności odpowiedzi przyniesie nowe postępy terapeutyczne.

Dożylne (IV) podawanie endotoksyny (Gram-ujemnego bakteryjnego lipopolisacharydu), specyficznego agonisty receptora Toll-podobnego 4, reprezentuje model in vivo ogólnoustrojowego zapalenia u człowieka. National Institutes for Health Clinical Center Reference Endotoxin (CCRE, Escherichia coli O:113:H10:K negative) jest stosowany do niezawodnego i powtarzalnego generowania naczyniowych, hematologicznych, endokrynologicznych, immunologicznych i specyficznych dla narządów efektów funkcjonalnych, które są równoległe, w różnym stopniu obserwowane we wczesnych stadiach stanów patologicznych. Zmiana dawki (0,06 - 4 ng/kg) i skali czasowej ekspozycji (bolus vs. infuzja) pozwala na replikację ostrego lub przewlekłego stanu zapalnego i uzyskanie różnych nasileń, przy czym wyższe dawki (2 - 4 ng/kg) są często stosowane w celu wytworzenia stanu "podobnego do sepsy". Uznane i nowe związki lecznicze mogą być dodatkowo podawane przed lub po ekspozycji na endotoksyny, aby ocenić ich wpływ na kaskadę zapalną. Pomimo ograniczeń w zakresie i możliwości uogólnienia, prowokacja endotoksyną dożylną u ludzi stanowi unikalną platformę do uzyskania mechanistycznego wglądu w indukowalne reakcje fizjologiczne i szlaki zapalne. Racjonalnie wykorzystana może pomóc w przełożeniu tej wiedzy na innowacje terapeutyczne.

Wprowadzenie

Zapalenie o różnej etiologii, nasileniu i czasie trwania stanowi centralny składnik patologii wielu chorób. Począwszy od krytycznych stanów chorobowych, takich jak sepsa lub uraz, w których dominuje ciężki, stosunkowo krótkotrwały stan zapalny, po choroby przewlekłe, w tym cukrzycę typu 2, miażdżycę i chorobę Alzheimera, w których utrzymujący się niski ton zapalny jest uważany za czynnik patologiczny, rozregulowane szlaki zapalne są kluczowym czynnikiem powodującym globalną zachorowalność i śmiertelność1,2.

Stan zapalny jest inicjowany przez obecność wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) lub wzorców molekularnych związanych z niebezpieczeństwem (DAMPs) — zwykle składników wewnątrzkomórkowych uwalnianych przez uszkodzenie tkanek3-5. Te konserwatywne motywy molekularne wiążą receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory Toll-podobne (TLR) znajdujące się na komórkach nabłonka, komórkach śródbłonka i komórkach wrodzonego układu odpornościowego, aby uruchomić wspólne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe6. Aktywacja jądrowego czynnika transkrypcyjnego czynnika jądrowego κB, między innymi, prowadzi do transkrypcji genów kodujących cytokiny prozapalne, które tworzą kaskadę zapalną7.

Stan zapalny wywołuje zarówno miejscowe, jak i ogólnoustrojowe efekty, mające na celu wyizolowanie i usunięcie pierwotnej zniewagi. Zmiany miejscowe obejmują regulację w górę markerów adhezji, uwalnianie chemokin, rozszerzenie naczyń krwionośnych i zwiększoną przepuszczalność naczyń krwionośnych w celu ułatwienia transmigracji wrodzonych komórek odpornościowych. Aktywowany jest również układ dopełniacza i krzepnięcia. Ogólnoustrojowo obserwuje się wiele zmian fizjologicznych specyficznych dla narządów, koordynowanych za pośrednictwem sieci neuroendokrynnej. Dochodzi do znacznego wzrostu mediatorów humoralnych, a profil krążących komórek radykalnie się zmienia. Brak ustania stanu zapalnego i przywrócenia homeostazy może być spowodowany utrzymywaniem się bodźców inicjujących lub niepowodzeniem dedykowanych ścieżek rozwiązywania8. Te silne mechanizmy, często koordynowane przez mediatory lipidowe, mogą same w sobie być patogenne9,10.

Badanie reakcji zapalnej i tych kluczowych kroków regulacyjnych w populacji klinicznej jest wyzwaniem. Zmienność demograficzna (wiek, płeć, pochodzenie etniczne), czasowa (czas wystąpienia, czas ekspozycji) i kliniczna (rodzaj bodźców inicjujących, nasilenie urazu, obciążenie chorobami współistniejącymi, interwencja terapeutyczna) utrudniają dostęp do kluczowych szlaków biologicznych. Tradycyjnym rozwiązaniem było wykorzystanie modeli zwierzęcych. Pomimo wielu zalet, ich fundamentalne podobieństwo do ludzkiej patofizjologii11,12 i znaczenie ich wyników są przedmiotem coraz większej analizy13-15. Alternatywą jest zastosowanie redukcjonistycznych modeli ludzkich.

Opracowany pod koniec lat sześćdziesiątych, dożylne (IV) podawanie endotoksyn człowiekowi stanowi istotną platformę, dzięki której można odkryć, wytyczyć i potencjalnie leczyć szlaki zapalne16-19. Endotoksyna (używana w tym artykule jako synonim lipopolisacharydu [LPS]) jest silnym agonistą TLR4, który wyzwala kaskadę zapalną w sposób zależny od dawki. Wstrzykiwany w bolusie lub infuzji może być zatem stosowany do modelowania zarówno małego, jak i umiarkowanego ogólnoustrojowego zapalenia o różnym czasie trwania. Uzyskana w ten sposób krótkotrwała reakcja zapalna pozwala na ocenę pojedynczego składnika wysoce złożonej interakcji gospodarz-patogen, która rozwija się podczas infekcji bakteryjnej. Chociaż nie jest to model szoku, wyzwania związane z endotoksynami dożylnymi wywołują reakcje, które wydają się replikować wczesne stadia infekcji. Eliminując międzygatunkowe bariery translacyjne i dokładnie naśladując fenotyp kliniczny jakościowo, jeśli nie ilościowo, zapewnia interpretację wpływów zapalnych, konsekwencji i możliwość przetestowania interwencji w czasie rzeczywistym. Endotoksyna może być również podawana wewnątrzoskrzelowo20, śródskórnie21 lub w połączeniu z dożylnym LPS22 w celu zbadania miejscowych reakcji zapalnych w różnych przedziałach. Rzadziej stosowane metody alternatywne obejmują infuzję proksymalnych cytokin prozapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworu α (TNFα) i interleukina (IL) 6,19. Nie będą one tutaj dalej omawiane.

Protokół

University College London REC (Wielka Brytania) zatwierdził badanie, w wyniku którego uzyskano dane przedstawione w sekcji reprezentatywnych wyników (nr referencyjny 5060/001).

ETYCZNA APROBATA:

Większość badań z użyciem dożylnych prowokacji endotoksynami została przeprowadzona u zdrowych osób. Ponieważ badania te nie przynoszą żadnych korzyści zdrowotnych, znaczenie celów badania powinno wyraźnie przeważać nad wszelkim nieodłącznym ryzykiem. Jest to istotne, gdy rozważa się interakcje z nowymi środkami stosowanymi do modyfikowania stanu zapalnego, które mogą nasilać reakcje gospodarza na endotoksynę (np. gorączka, zmiany ciśnienia krwi, objawy).

Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek badania z użyciem endotoksyny dożylnej, należy uzyskać zgodę od odpowiedniej Komisji Etyki Badań (REC) / Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB). Dożylne podawanie endotoksyn jest stosowane od ponad czterdziestu lat w celu uzyskania ważnych mechanistycznych wglądów w biologię człowieka bez poważnych lub trwałych negatywnych skutków dlanaszej lub innego autora wiedzy. Biorąc pod uwagę potencjał modelu w zakresie dostarczania istotnych informacji dotyczących wielu stanów zapalnych, które są głównymi przyczynami śmiertelności i zachorowalności, uważamy, że etycznie dopuszczalne jest narażanie zdrowych ochotników i zdefiniowanych grup demograficznych lub klinicznych na działanie endotoksyny, pod warunkiem, że istnieją odpowiednie strategie minimalizacji ryzyka. Może to wymagać niezależnej zewnętrznej oceny przeprowadzonej przez wykwalifikowanych ekspertów lub badań pilotażowych w celu zapewnienia bezpiecznego prowadzenia badań, szczególnie w przypadku stosowania nowych środków i ich interakcji ze stanem zapalnym wywołanym przez endotoksyny.

Przygotowanie

1. Określ cechy demograficzne i kliniczne uczestników

UWAGA: Większość badań wykorzystujących dożylną prowokację endotoksyną rekrutuje zdrowych młodych ochotników płci męskiej < 30 roku życia. Badania przeprowadzono dodatkowo na zdrowychkobietach23, starszych ochotnikach24,25 i podgrupach pacjentów26, w zależności od pytania eksperymentalnego. Uczestnicy w podeszłym wieku (tj. w wieku powyżej 60 lat) mogą mieć większą i bardziej trwałą odpowiedź (wyższa gorączka, większy spadek ciśnienia krwi), a interakcje zapalenia wywołanego endotoksyną z jakimikolwiek chorobami współistniejącymi lub lekami muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu tych badań. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru uczestników.

2. Rekrutacja uczestników

  1. Zorganizuj odpowiednią reklamę zgodnie z wymaganiami.
    nuta: Powszechnie oferowana jest rekompensata finansowa za czas uczestnika i niedogodności. Musi to zostać ustalone przed rekrutacją i zatwierdzone przez REC/IRB.
  2. Wydanie zatwierdzonej przez REC/IRB ulotki informacyjnej dla uczestników (PIL) wyjaśniającej charakter badania, przegląd protokołu, oczekiwane skutki uboczne i ryzyko związane z endotoksyną dożylną respondentom spełniającym kryteria włączenia.
    nuta: Dokument ten powinien zostać wydany przed wyrażeniem zgody, aby umożliwić podjęcie świadomej decyzji o udziale oraz aby badacz mógł odpowiedzieć na wszelkie pytania lub wątpliwości.

3. Uzyskaj formalną świadomą zgodę

  1. Należy uzyskać pisemną zgodę wszystkich uczestników przed podjęciem jakiejkolwiek procedury związanej z badaniem, w tym badań przesiewowych.
  2. Szukaj ustnego potwierdzenia, że uczestnik zapamiętuje i rozumie informacje zawarte w PIL.
  3. Omów skutki uboczne dożylnego podawania endotoksyny.
    nuta: Przy większych dawkach (2 - 4 ng/kg) należą do nich dreszcze, ból głowy, światłowstręt, bóle mięśni, bóle stawów, nudności i rzadziej wymioty. Maksymalne nasilenie objawów występuje około 1 - 2 godziny po wstrzyknięciu, a następnie zmniejsza się do wartości wyjściowej po 6 - 8 godzinach. Nie zgłoszono żadnych poważnych lub utrzymujących się działań niepożądanych wtórnych do endotoksyny w tych dawkach. Rzadko zdarza się, że ochotnik może uznać, że stopień objawów jest nie do zaakceptowania w szczytowym okresie odpowiedzi. Objawy można złagodzić, podając paracetamol/paracetamol lub leki niesteroidowe doustnie lub dożylnie (np. aspiryna, ibuprofen). Takie środki mogą zmieniać reakcję zapalną i ich stosowanie powinno być rejestrowane.
  4. Ponownie potwierdzić zdolność uczestników do wycofania się z badania w dowolnym momencie bez podania przyczyny.

4. Przeprowadź 'Badanie Zdrowotne' na potencjalnych uczestnikach

UWAGA: Ma to na celu zapewnienie braku nieujawnionych schorzeń, które narażają je na większe ryzyko szkód spowodowanych endotoksyną dożylną. Jako cel drugorzędny można zidentyfikować informacje istotne dla pytania doświadczalnego.

  1. Zidentyfikuj odpowiednie środowisko kliniczne i odpowiednio przeszkolonego lekarza, który przeprowadzi badanie przesiewowe.
  2. Weź pełną historię kliniczną, w tym przeszłą historię medyczną i społeczną, przeszłe i trwające leki/terapie, nową zdrową żywność lub leki dostępne bez recepty, stan alergii i dochodzenie w sprawie obecności obecnych objawów, które mogą sugerować nową lub niedawną chorobę.
  3. Wykonaj formalne badanie kliniczne, jako minimum, układu sercowo-naczyniowego i oddechowego.
  4. Uporządkuj i przejrzyj podstawowe badania, w tym rutynowe obserwacje (waga, tętno, ciśnienie krwi, częstość oddechów, nasycenie tlenem, temperatura), badania krwi (pełna morfologia krwi, testy funkcjonalne nerek, wątroby i krzepnięcia) oraz 12-odprowadzeniowy elektrokardiogram.
    nuta: Mogą być wymagane dodatkowe badania zgodnie z protokołem doświadczalnym.
  5. Niech uczestnicy z niezwykłą historią, badaniami i dochodzeniami przejdą do dożylnego prowokacji endotoksyną, w zależności od zatwierdzonych przez REC / IRB kryteriów włączenia/wykluczenia.
    nuta: Najlepszą praktyką jest, aby nowo wykryte objawy, oznaki lub nieprawidłowości w teście były zgłaszane i badane przez rutynowego lekarza uczestnika. Osoby te powinny zostać wykluczone do czasu odpowiedniego rozwiązania wszelkich problemów.

5. Poinformuj uczestników przystępujących do IV Endotoxin Challenge, aby;  

  1. Powiadom badacza o wszelkich nowych objawach lub chorobie.
    nuta: Zazwyczaj wyklucza to ich udział w badaniu.
  2. Poproś uczestników, aby przybyli we wcześniej umówionym czasie i miejscu. Poinstruuj uczestników, aby ubrali się w wygodne ubrania i przynieśli ze sobą rozrywkę.
  3. Poproś uczestników, aby pościli od północy (dozwolone są klarowne płyny).
  4. Poproś uczestników o powstrzymanie się od alkoholu i kofeiny przez 24 godziny przed wstrzyknięciem i/lub wcześniej określony okres po wstrzyknięciu (opcjonalnie i w zależności od protokołu)。

Procedura

6. Wyzwanie endotoksyną (przed podaniem endotoksyny)

  1. Przygotuj łóżko z głową pod kątem 45°.
    nuta: Upewnij się, że znajduje się w odpowiednim miejscu, aby uzyskać pomoc kliniczną i sprzęt do resuscytacji. Na przykład placówka badań klinicznych, sala anestezjologiczna lub oddział intensywnej terapii.
  2. Upewnij się, że wymagany sprzęt kliniczny i eksperymentalny jest dostępny i działa.
    nuta: Obejmuje to ciśnieniomierz, termometr, pulsoksymetr i, jeśli jest stosowany, 3-odprowadzeniowe monitorowanie serca. Sprawdź kompletność miejscowego sprzętu do resuscytacji i dostępność tlenu.
  3. Odtworzyć endotoksynę referencyjną centrum klinicznego
    1. Dodać 5 ml sterylnej wody do wstrzykiwań, USP (SWI) do wcześniej nieodtworzonej fiolki CCRE, stosując w pełni aseptyczną technikę bezdotykową (ANTT) przez cały czas. Fiolki zawierają 10 000 jednostek endotoksyny (EU) (około 1 μg) w postaci białego, liofilizowanego proszku.
    2. Umieścić fiolkę CCRE z dodatkiem 5 ml SWI na wytrząsarce wirowej na 1 godzinę, aby upewnić się, że endotoksyna przylegająca do szklanej powierzchni fiolki jest całkowicie rozpuszczona.
      nuta: CCRE nie przechodzi łatwo w stan roztworu, mimo że wydaje się, że całkowicie się rozpuścił.
    3. Pobrać odpowiednią objętość endotoksyny dostosowaną do masy ciała (teraz 2 000 EU/ml lub około 200 ng/ml) do strzykawki o pojemności 1 ml.
      nuta: Używaj szklanych lub polipropylenowych strzykawek, aby zminimalizować przyleganie (i utratę) endotoksyny do sprzętu.
  4. uczestnik
    1. Potwierdź zgodę na dalsze podawanie endotoksyny dożylnie. Zapytaj o nową chorobę, objawy i zgodność z instrukcjami specyficznymi dla protokołu.
      nuta: Jeśli istnieje problem medyczny lub niezgodność endotoksyny, należy opóźnić jej podanie.
    2. Poproś uczestnika, aby położył się w przygotowanym łóżku, upewniając się, że jest mu wygodnie. Upewnij się, że mają opróżniony pęcherz moczowy i jelita.
  5. Uzyskaj dostęp naczyniowy.
    1. Wprowadzić kaniulę dożylną pod ANTT w celu podania endotoksyny i, jeśli jest to uwzględnione w protokole, płynów dożylnych.
    2. Umieść drugą linię wewnątrznaczyniową do ciągłego pobierania krwi, aby uniknąć powtarzających się dźgnięć żylnych. Włóż go dożylnie i podłącz do 3-kierunkowego kranu (z przedłużeniem lub bez), aby ułatwić pobieranie i płukanie krwi.
      nuta: Alternatywnie, w celu ciągłego monitorowania ciśnienia krwi i pobierania próbek, należy umieścić linię dotętniczą. Wymaga to większej wiedzy specjalistycznej w zakresie wprowadzania i zwiększa ryzyko powikłań miejscowych.
      1. Do ciągłego pobierania krwi za pomocą kaniuli dożylnej należy użyć kaniuli o średnicy 18 G lub większej wraz z umiejscowieniem w dole łokciowym, aby uniknąć hemolizy i krzepnięcia. Dożylne podawanie płynów pomoże utrzymać drożność.
        nuta: Wybór rodzaju i miejsca wprowadzenia kaniuli wewnątrznaczyniowej powinien odbywać się zgodnie z indywidualnymi preferencjami lekarza i uczestnika. Linie wewnątrztętnicze są tradycyjnie umieszczane w tętnicy promieniowej lub udowej po uprzednim wkropleniu środka znieczulającego miejscowo (np. 1% lidokainy).
    3. Pobrać krew do badań wyjściowych po wprowadzeniu pierwszej lub drugiej linii. Odrzucić pierwsze 5 ml krwi (zajmującej martwe miejsce w kaniuli i łącznikach) przed pobraniem krwi do pobrania. Przepłukać linię 10 ml 0,9% chlorku sodu po pobraniu krwi.
      nuta: Objętość pobranej krwi i postępowanie z próbkami zostaną określone na podstawie protokołu doświadczalnego i lokalnych procedur laboratoryjnych.
    4. W razie potrzeby należy dołączyć monitorowanie kliniczne (np. 3-odprowadzeniowe monitorowanie serca jest zwykle stosowane przy wyższych dawkach 2 - 4 ng/kg).
    5. Zapisać podstawowe rutynowe obserwacje kliniczne, jak podano w ppkt 4.4, na odpowiedniej karcie parametrów życiowych. Subiektywna ocena objawów (np. przy użyciu wizualnych wyników analogowych dla bólu głowy, bólów mięśni itp.) powinna być dodatkowo przeprowadzona w celu monitorowania doświadczenia uczestnika.
  6. Podawanie endotoksyn
    1. Przepłucz kaniulę dożylnie 0,9% chlorkiem sodu, aby upewnić się, że kaniula jest prawidłowo umieszczona i opatentowana.
    2. Podać wcześniej przygotowaną, dostosowaną do masy ciała dawkę odtworzonego CCRE za pomocą tej samej kaniuli dożylnej. Wstrzyknąć dawkę bolusa (< 2 min) do 3-kierunkowego kranu w piaście linii dożylnej.
    3. Przepłukać 10 ml 0,9% chlorku sodu, aby upewnić się, że wszystkie CCRE dostaną się do krążenia.
      nuta: Aby podawać ciągłe wlewy, wstrzyknąć endotoksynę do znanej objętości rozcieńczalnika, np. 100 ml 0,9% chlorku sodu, aby osiągnąć z góry określone stężenie, i wlewać otrzymany roztwór z ustaloną szybkością (objętość/czas).

7. Monitorowanie, obserwacja i pobieranie próbek

  1. Monitoruj uczestników poddawanych endotoksynie dożylnej przez co najmniej 6 godzin po podaniu bolusa lub przez czas trwania wlewu. Zleć ten krok wykwalifikowanemu, doświadczonemu klinicyście.
  2. Rejestruj i przeglądaj parametry życiowe i wszelkie obserwacje kliniczne co najmniej raz na godzinę. Dodatkowo można podjąć ciągłe monitorowanie, takie jak 3-odprowadzeniowe monitorowanie serca.
    nuta: Badacze powinni pamiętać, że przy większych dawkach bolusa (2 - 4 ng/kg) reakcje wazowagalne mogą powodować przerwy w pracy serca. Występują one najczęściej od 30 minut do 2 godzin po wstrzyknięciu i nie są złośliwe (więcej informacji można znaleźć w dyskusji).
  3. Podejmij subiektywną ocenę objawów według uznania badacza.
  4. Podawać 2-3 l krystaloidu (na przykład 0,9% chlorku sodu lub roztworu Hartmanna) w ciągu 6 - 8 godzin po podaniu w bolusie 2-4 ng/kg.
    nuta: Nie istnieje akceptowalna norma dotycząca podawania wyżej wymienionych płynów. Bezpieczeństwo uczestników jest najważniejsze. Zapewnia to rutynową konserwację płynów i uzupełnianie objętości (przez okres utrzymywany na poziomie zerowym w jamie ustnej i zwiększonych niewyczuwalnych stratach spowodowanych podwyższoną temperaturą ciała i częstością oddechów). Mogą również przeciwdziałać ryzyku zaburzeń rytmu serca (patrz dyskusja).
  5. Uzyskać wstępnie określone próbki wymagane do udzielenia odpowiedzi na pytanie eksperymentalne.
    nuta: Tradycyjnie należą do nich między innymi krew i mocz. Czas, liczba i objętość próbek powinny być minimalne i powinny być wymagane do uzyskania dokładnych danych i powinny być zatwierdzone przez REC/IRB. W niektórych punktach czasowych (np. co 30 minut) może być wymagane częstsze pobieranie próbek, aby zapewnić, że wartości szczytowe (lub minimalne) nie zostaną przekroczone. Obliczenia objętości krwi muszą uwzględniać krew odrzuconą podczas wycofywania martwej przestrzeni.
  6. Przetwarzaj próbki zgodnie z wymaganiami.

8. Zakończenie procedury

  1. Poproś lekarza prowadzącego, aby upewnił się, że objawy uczestnika ustąpiły i że jego obserwacje zmierzają do normy (wszystkie zmienione parametry, np. podwyższone tętno i temperatura, wykazujące konsekwentne zmniejszanie w kierunku wartości wyjściowych) przed usankcjonowaniem zakończenia obserwacji i późniejszego wypisu.
    nuta: Po wstrzyknięciu bolusa w dawce 2 - 4 ng/kg CCRE objawy zwykle całkowicie ustępują po 6 - 8 godzinach. Poszczególne obserwacje przebiegają nakładając się na siebie, ale odrębnie przebiegają w czasie. Zwykle wracają one do wartości wyjściowej po 10 - 12 godzinach. Ciągły wlew wymaga dłuższego okresu obserwacji, ponieważ objawy i parametry życiowe nie ustąpią natychmiast po zaprzestaniu podawania endotoksyny.
  2. Usuń wszystkie urządzenia monitorujące i linie wewnątrznaczyniowe zapewniające hemostazę.
  3. Potwierdź, że uczestnik jest zadowolony z powrotu do domu i posiada dane kontaktowe badacza w przypadku jakichkolwiek wątpliwości.
    nuta: Za najlepszą praktykę uważa się skontaktowanie się z uczestnikiem następnego dnia w celu sprawdzenia jego stanu zdrowia i monitorowania pod kątem następstw.

Wyniki

Zróżnicowane, wieloukładowe skutki podawania endotoksyny dożylnie zostały niedawno szczegółowo omówione i nie będą tutaj w pełni analizowane (pełne szczegóły znajdują się w 17-19,27). Zamiast tego przedstawiony zostanie krótki przegląd zakresu i zastosowań tego modelu wraz z podstawowymi danymi dotyczącymi klasycznego schematu dawkowania w formie bolusa (2 ng/kg). Schemat ilustrujący ramy czasowe takiego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1.

Harmonogram iniekcji endotoksyny; schemat eksperymentu dotyczącego monitorowania klinicznego i płynów dożylnych.
Rysunek 1: Reprezentatywny schemat protokołu podaży endotoksyny w bolusie drogą dożylną. Po przybyciu należy potwierdzić zgodę uczestnika na udział w badaniu, a także sprawdzić jego stan zdrowia oraz stopień przestrzegania protokołu (post, abstynencja alkoholowa, itp.). Po wprowadzeniu linii dożylnych, podłączeniu aparatury monitorującej oraz zebraniu wyjściowych obserwacji klinicznych i próbek, podaje się dawkę zrekonstytuowanego CCRE dostosowaną do masy ciała. Obowiązkowy jest monitoring kliniczny przez co najmniej 6–8 godzin. Próbki, najczęściej krew, mogą być pobierane w wybranych punktach czasowych. Zazwyczaj podawane są dożylne płyny krystaloidowe; w tym przypadku 1 L w ciągu 2 godzin, a następnie 1 L w ciągu 6 godzin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Efekt podania endotoksyny dożylnie zależy od wybranej dawki oraz metody podania (bolus vs. infuzja). Bolus w dawce 2 - 4 ng/kg niezawodnie wywołuje cechy zespołu ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej, objawiające się podwyższeniem temperatury wewnętrznej ciała, częstości akcji serca oraz liczby białych krwinek (WBC)16. Towarzyszy temu obecność humoralnych mediatorów stanu zapalnego, w tym cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych, białek ostrej fazy (takich jak białko C-reaktywne) (patrz Rycina 2 i 3), a także aktywacja osi podwzgórze-przysadka28 oraz układów prozakrzepowych i fibrynolitycznych29. Dochodzi do zmian w metabolizmie tkanek centralnych i obwodowych oraz wywołania licznych narządowych zaburzeń czynnościowych19,30. U uczestników występuje szereg objawów „grypopodobnych”, których nasilenie osiąga szczyt po około 1 - 2 h i w znacznym stopniu ustępuje do 6 h (patrz Rycina 4). Protokół bolusa w „wysokiej dawce” indukuje u ochotników odpowiedź jakościowo spójną, lecz ilościowo zmienną31.

Wykresy liniowe parametrów życiowych w czasie: częstość oddechów, tętno, skurczowe ciśnienie tętnicze, temperatura.
Rycina 2: Profil obserwacji klinicznej. Zmiany parametrów życiowych po podaniu w bolusie Clinical Center Reference Endotoxin w dawce 2 ng/kg (mediana z IQR, n = 10). Przedstawiono częstość oddechów (RR, oddechów na min, A), tętno (uderzeń na min, B), skurczowe ciśnienie tętnicze (SBP, mmHg, C) oraz temperaturę (°C, mierzoną termometrem bębenkowym, D). SBP nie spadło dzięki podawaniu płynów dożylnie, a niewielki wzrost prawdopodobnie odzwierciedla zwiększony odpływ współczulny. Czas naniesiono na oś x (godziny po podaniu endotoksyny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy przebiegu czasowego parametrów krwi; poziomy WBC, C-RP, TNFα, IL-6 w ciągu 24 godzin; dane eksperymentalne.
Rysunek 3: Odpowiedź komórkowa i humoralna. Obserwuje się trwałe zmiany w całkowitej liczbie leukocytów, w tym przejściową neutrofilię (A), wraz z powszechnie stosowanymi klinicznymi wskaźnikami stanu zapalnego, takimi jak białko C-reaktywne (B). Po dożylnym podaniu endotoksyny występują ilościowo zróżnicowane, lecz jakościowo zachowane zmiany w stężeniach cytokin w krążącym osoczu. Jako przykłady przedstawiono TNFα (C) oraz IL-6 (D). Wszystkie dane pochodzą z okresu po bolusowym podaniu Clinical Center Reference Endotoxin w dawce 2 ng/kg (mediana z IQR, n = 10. Stężenie cytokin stanowi średnią z 2 powtórzeń technicznych na osobnika w każdym punkcie czasowym). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres progresji objawów; wykres liniowy; czas vs wynik; przedstawione słupki błędów statystycznych; analiza z zakresu 0-8 godzin.
Rycina 4: Profil objawów. Skumulowany wynik objawów zapisany w określonych punktach czasowych po podaniu bolusa Clinical Center Reference Endotoxin 2 ng/kg (mediana z IQR, n = 10). Uczestników poproszono o ocenę nasilenia bólu głowy, dreszczy, bólów mięśni oraz nudności w wizualnych skalach analogowych (0 - 10, maksymalny wynik 40). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

'Niska dawka' endotoksyny ma z kolei znacznie bardziej zróżnicowany wpływ na poszczególne osoby i może być wykorzystana do badania różnic międzyosobniczych w odpowiedzi zapalnej31. Podanie dawki 0.06 - 0.2 ng/kg w formie bolusa lub infuzji indukuje 2- do 10-krotny wzrost poziomu cytokin w osoczu, co odpowiada wartościom obserwowanym w przewlekłych stanach zapalnych o niskim nasileniu32. Takie protokoły mogą odgrywać kluczową rolę w badaniu udziału stanu zapalnego oraz szlaków go regulujących w wielu złożonych schorzeniach kardiometabolicznych27.

Dyskusja

Jak wykazano tutaj i w pełni opisano w ostatnich artykułach przeglądowych, prowokacja endotoksyną dożylną u ludzi jest unikalną platformą eksperymentalną zapewniającą wgląd w szlaki zapalne, które leżą u podstaw szerokiego zakresu chorób u ludzi. Umożliwiając kontrolowaną, powtarzalną indukcję ogólnoustrojowego stanu zapalnego, model umożliwia dostęp do początkowych faz kaskady zapalnej, eliminując potencjalne czynniki zakłócające.

Odpowiedzi uczestników mogą być modulowane pod względem nasilenia i czasu trwania, a wpływ genomu na ich prezentację fenotypową oceniany. Co więcej, model może służyć jako poligon doświadczalny dla terapii, nie tylko tych skierowanych przeciwko samemu ligandowi LPS, ale także indukowanych przez LPS szlaków sygnałowych i mediatorów zarówno w fazie ostrej, jak i ustępującej stanu zapalnego. Może to obejmować środki mające na celu przywrócenie tolerancji endotoksyn, hipoaktywnego stanu układu odpornościowego, który wykazuje podobieństwa do krytycznego paraliżu immunologicznego wywołanego chorobą33,34 Zdolny do odtworzenia kluczowych cech zarówno ostregozapalenia 16 , jak i przewlekłego27 nie tylko na poziomie fizjologicznym/funkcjonalnym, ale także transkryptomicznym35Wydaje się, że dożylna próba endotoksyny ma do odegrania kluczową rolę w przełożeniu podstawowych przełomowych odkryć naukowych na praktykę kliniczną. W połączeniu z ukierunkowanymi badaniami na odpowiednich modelach zwierzęcych, które są w stanie dokładniej odtworzyć patofizjologiczne reakcje określonych stanów chorobowych (np. podwiązanie i punkcja kątnicy myszy oraz sepsa), ten paradygmat badawczy może być szczególnie skuteczny.

Bezpieczeństwo uczestników każdego zdrowego modelu ochotnika jest najważniejsze. Dożylnie prowokacja endotoksyną została podana w wyższym zakresie dawek 2 - 4 ng / kg tysiącom osób z, zgodnie z naszą wiedzą i wiedzą innych autorów, bez poważnych lub trwałych zdarzeń niepożądanych (komunikacja osobista, dr Anthony Suffredini)19. Warto jednak zauważyć, że pojedyncze przypadki ciężkich reakcji nerwu błędnego zostały zgłoszone36,37. Etiologia przypuszczalnie reprezentuje wysoki spoczynkowy ton nerwu błędnego, zmniejszenie objętości po całonocnym poście i uwalnianie katecholamin wraz z nadejściem gorączki, dreszczy i objawów, których kulminacją jest przesadny odruch Bezolda-Jarischa. Ryzyko to można złagodzić, wykluczając osoby z wcześniejszą synkopią wazowagalną lub dodatnim testem przechylenia oraz obciążeniem objętościowym płynami dożylnymi przed i w trakcie prowokacji endotoksynami37. Badacze stosujący prowokację endotoksyną w dużych dawkach (zwłaszcza 4 ng/kg) powinni być świadomi ryzyka bradykardii i/lub przerw w pracy serca, ostrzegać uczestników o ich rzadkim, ale potencjalnym występowaniu, stosować odpowiednie monitorowanie i mieć łatwo dostępny sprzęt do resuscytacji. Inne kryteria wykluczenia, oprócz tych opisanych w protokole, mogą być wymagane w zależności od pytania eksperymentalnego. Na przykład, podczas gdy rozsądne jest wykluczenie osób, które uczestniczyły w innych badaniach klinicznych lub doświadczyły operacji/urazu w ciągu ostatnich trzech miesięcy, ograniczenie udziału (lub zastosowanie grup równoległych, a nie projektu krzyżowego w badaniach interwencyjnych) do tych, którzy wcześniej brali udział w dożylnych próbach prowokacyjnych endotoksyn, może być również wymagane, jeśli ma być oceniona odpowiedź immunologiczna: Tolerancja endotoksyn utrzymująca się przez nieznany okres czasu in vivo38,39.

W przypadku modelu widocznych jest kilka ograniczeń. Tradycyjnie przeprowadza się go u zdrowych, młodych ochotników płci męskiej, którzy nie są reprezentatywni dla populacji klinicznej. Nie są wymagane żadne interwencje, aby fenotypowe konsekwencje podania endotoksyny ustąpiły. Oczyszczone wstrzyknięcie LPS zapewnia ekspozycję tylko na pojedynczy ligand TLR, w przeciwieństwie do kilku immunogennych ugrupowań na żywym patogenie. Z natury etycznej może być wywołana tylko stosunkowo skromna reakcja zapalna. Nie udaje się naśladować każdej patofizjologicznej cechy charakterystycznej choroby40. W związku z tym "wszelkie oczekiwania, że model w pełni odwzorowuje stan kliniczny ciężkiego, zlokalizowanego lub ogólnoustrojowego zakażenia Gram-ujemnego, są nieuzasadnione"18.

Uważamy jednak, że siła modelu nie polega na niewłaściwej ekstrapolacji na warunki kliniczne, ale na badaniu fizjologicznej, hematologicznej, immunologicznej, neuroendokrynnej i metabolicznej odpowiedzi kompetentnych komórek i układów narządów na kluczowy bodziec zapalny. Przemyślana interpretacja przejściowych zmian wywołanych podawaniem endotoksyn i ich modulacją przez prowokację farmakologiczną była i nadal będzie pomocna w projektowaniu nowych terapii i przewidywaniu ich skuteczności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Anthony'emu Suffrediniemu (Critical Care Medicine Department, National Institutes for Health Clinical Center, Bethesda, USA) za staranną recenzję manuskryptu i wiele przemyślanych sugestii. Chcielibyśmy również podziękować Narodowym Instytutom Zdrowia za bezpłatne udostępnienie Referencyjnej Endotoksyny Centrum Klinicznego zastosowanej w tym badaniu.

JNF i DWG są finansowane przez Wellcome Trust, który wsparł wygenerowanie opisanych danych i publikację tego artykułu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Referencyjne centrum kliniczne Endotoksyna (CCRE, Escherichia coli O:113:H10:K ujemny)National Institutes for Healthn/aendotoksynowe wyprodukowane przez GMP
(1  ml, 5  ml)
Woda do wstrzykiwań
0,9% chloide sodu (sterylna, klasa kliniczna)
KaniuleMiminum 20 G Francuski
ciśnieniomierzJeśli umieszczono linię dotętniczą, sprzęt do transdukcji do inwazyjnego monitorowania ciśnienia krwi
Pulsoksymetr
TermometrTypomaniczny, ustny lub grubogłowy (doodbytniczy, ustno-gardłowy)
Elektrokardiograf
ProbówkiWykorzystywane przez lokalne laboratorium kliniczne
Strzykawki dożylne do pobierania próbek

Bibliografia

  1. Nathan, C., Ding, A. Nonresolving inflammation. Cell. 140 (6), 871-882 (2010).
  2. Adhikari, N. K., Fowler, R. A., Bhagwanjee, S., Rubenfeld, G. D. Critical care and the global burden of critical illness in adults. Lancet. 376 (9749), 1339-1346 (2010).
  3. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nature medicine. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  4. Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
  5. Lorne, E., Dupont, H., Abraham, E. Toll-like receptors 2 and 4: initiators of non-septic inflammation in critical care medicine? Intensive care medicine. 36 (11), 1826-1835 (2010).
  6. Brightbill, H. D., et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science. 285 (5428), 732-736 (1999).
  7. Zhang, G., Ghosh, S. Toll-like receptor-mediated NF-kappaB activation: a phylogenetically conserved paradigm in innate immunity. J Clin Invest. 107 (1), 13-19 (2001).
  8. Lawrence, T., Gilroy, D. W. Chronic inflammation: a failure of resolution? International journal of experimental pathology. 88 (2), 85-94 (2007).
  9. Fullerton, J. N., O'Brien, A. J., Gilroy, D. W. Pathways mediating resolution of inflammation: when enough is too much. The Journal of pathology. 231, 8-20 (2013).
  10. Fullerton, J. N., O'Brien, A. J., Gilroy, D. W. Lipid mediators in immune dysfunction after severe inflammation. Trends in Immunology. 35 (1), 12-21 (2014).
  11. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  12. Zolfaghari, P. S., Pinto, B. B., Dyson, A., Singer, M. The metabolic phenotype of rodent sepsis: cause for concern. Intensive Care Medicine Experimental. 1 (6), (2013).
  13. Dyson, A., Singer, M. Animal models of sepsis: why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting. Critical care medicine. 37 (1 Suppl), S30-S37 (2009).
  14. Rittirsch, D., Hoesel, L. M., Ward, P. A. The disconnect between animal models of sepsis and human sepsis. Journal of leukocyte biology. 81 (1), 137-143 (2007).
  15. van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245(2010).
  16. Calvano, S. E., Coyle, S. M. Experimental human endotoxemia: a model of the systemic inflammatory response syndrome? Surgical infections. 13 (5), 293-299 (2012).
  17. Suffredini, A. F., Noveck, R. J. Human endotoxin administration as an experimental model in drug development. Clin Pharmacol Ther. 96 (4), 418-422 (2014).
  18. Lowry, S. F. Human endotoxemia: a model for mechanistic insight and therapeutic targeting. Shock. 24, Suppl 1. 94-100 (2005).
  19. Andreasen, A. S., et al. Human endotoxemia as a model of systemic inflammation. Current Medicinal Chemistry. 15 (17), 1697-1705 (2008).
  20. Thorn, J., et al. The inflammatory response in humans after inhalation of bacterial endotoxin: a review. Inflamm Res. 50 (5), 254-261 (2001).
  21. Basran, A., et al. Roles of neutrophils in the regulation of the extent of human inflammation through delivery of IL-1 and clearance of chemokines. Journal of leukocyte biology. 93 (1), 7-19 (2013).
  22. Plovsing, R. R., et al. Transcompartmental inflammatory responses in humans: IV versus endobronchial administration of endotoxin*. Crit Care Med. 42 (7), 1658-1665 (2014).
  23. van Eijk, L. T., et al. Gender differences in the innate immune response and vascular reactivity following the administration of endotoxin to human volunteers. Crit Care Med. 35 (6), 1464-1469 (2007).
  24. Krabbe, K. S., et al. Ageing is associated with a prolonged fever response in human endotoxemia. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (2), 333-338 (2001).
  25. Krabbe, K. S., et al. Hypotension during endotoxemia in aged humans. Eur J Anaesthesiol. 18 (9), 572-575 (2001).
  26. Engelhardt, R., Mackensen, A., Galanos, C., Andreesen, R. Biological response to intravenously administered endotoxin in patients with advanced cancer. J Biol Response Mod. 9 (5), 480-491 (1990).
  27. Patel, P. N., Shah, R. Y., Ferguson, J. F., Reilly, M. P. Human experimental endotoxemia in modeling the pathophysiology, genomics, and therapeutics of innate immunity in complex cardiometabolic diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (3), 525-534 (2015).
  28. Michie, H. R., et al. Tumor necrosis factor and endotoxin induce similar metabolic responses in human beings. Surgery. 104 (2), 280-286 (1988).
  29. van Deventer, S. J., et al. Experimental endotoxemia in humans: analysis of cytokine release and coagulation, fibrinolytic, and complement pathways. Blood. 76 (12), 2520-2526 (1990).
  30. Fong, Y. M., et al. The acute splanchnic and peripheral tissue metabolic response to endotoxin in humans. The Journal of clinical investigation. 85 (6), 1896-1904 (1990).
  31. Stephens, R. C., O'Malley, C. M., Frumento, R. J., Mythen, M. G., Bennett-Guerrero, E. Low-dose endotoxin elicits variability in the inflammatory response in healthy volunteers. Journal of endotoxin research. 11 (4), 207-212 (2005).
  32. Taudorf, S., Krabbe, K. S., Berg, R. M., Pedersen, B. K., Moller, K. Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin Vaccine Immunol. 14 (3), 250-255 (2007).
  33. Leentjens, J., et al. Reversal of immunoparalysis in humans in vivo: a double-blind, placebo-controlled, randomized pilot study. Am J Respir Crit Care Med. 186 (9), 838-845 (2012).
  34. Hamers, L., Kox, M., Pickkers, P. Sepsis-induced immunoparalysis: mechanisms, markers, and treatment options. Minerva Anestesiol. 81 (4), 426-439 (2015).
  35. Xiao, W., et al. A genomic storm in critically injured humans. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2581-2590 (2011).
  36. Williams, W. V., et al. Asystole following endotoxin administration. J Endotoxin Res. 6 (4), 303-306 (2000).
  37. van Eijk, L. T., Pickkers, P., Smits, P., Bouw, M. P., van der Hoeven, J. G. Severe vagal response after endotoxin administration in humans. Intensive Care Med. 30 (12), 2279-2281 (2004).
  38. Kox, M., et al. Differential ex vivo and in vivo endotoxin tolerance kinetics following human endotoxemia. Critical care medicine. 39 (8), 1866-1870 (2011).
  39. Draisma, A., Pickkers, P., Bouw, M. P., van der Hoeven, J. G. Development of endotoxin tolerance in humans in vivo. Critical care medicine. 37 (4), 1261-1267 (2009).
  40. Anel, R., Kumar, A. Human endotoxemia and human sepsis: limits to the model. Critical care. 9 (2), 151-152 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podawanie endotoksynmonitorowanie kliniczneoznaki ycioweuwalnianie cytokinpobieranie krwiresuscytacja p ynowabezpiecze stwo uczestnik wodpowied zapalna
Dożylne badanie endotoksyn u zdrowych ludzi: eksperymentalna platforma do badania i modulowania ogólnoustrojowego stanu zapalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.