Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Podsumowanie

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Streszczenie

Wykazano, że klasa Leukocyty wątroby z marginesem (MH) (leukocyty przylegające do sinusoid wątroby) wykazują unikalny skład i cechy w porównaniu z leukocytami innych kompartmentów immunologicznych. W szczególności dowody sugerują wyraźny profil pro- i przeciwzapalny populacji MH-leukocytów oraz wyższą cytotoksyczność komórek NK specyficznych dla wątroby (a mianowicie komórek pit) w porównaniu z krążącymi lub śledzionowymi immunocytami zarówno u myszy, jak i szczurów. Przedstawiona metoda umożliwia selektywne pobieranie leukocytów MH poprzez wymuszoną perfuzję wątroby u myszy i szczurów. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do ekstrakcji leukocytów wątroby, w tym rozdrabniania tkanek i degradacji biologicznej, ta metoda daje wyłącznie leukocyty z sinusoid wątroby, niezanieczyszczone komórkami z innych przedziałów wątrobowych. Ponadto technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MH, oszczędzając znane reakcje fizjologiczne na przetwarzanie tkankowe. Ponieważ wiele krążących komórek nowotworowych i zakażonych komórek jest zatrzymywanych podczas przechodzenia przez sinusoidy wątroby, fizycznie oddziałując z komórkami śródbłonka i leukocytami rezydentnymi, unikalna populacja leukocytów MH jest strategicznie zlokalizowana, aby wchodzić w interakcje, identyfikować i reagować na nieprawidłowe krążące komórki. Tak więc selektywne zbieranie MH-leukocytów i ich badanie w różnych warunkach może pogłębić nasze zrozumienie biologicznego i klinicznego znaczenia leukocytów MH, szczególnie w odniesieniu do krążących nieprawidłowych komórek i chorób związanych z wątrobą oraz przerzutów nowotworowych.

Wprowadzenie

Sinusoidy wątroby zawierają liczne podtypy leukocytów o różnych aktywnościach immunologicznych krytycznych dla organizmu. Na przykład komórki NK (Natural Killer) wątroby z marginesacją (MH), znane również jako komórki pit, są scharakteryzowane morfologicznie jako limfocyty o dużych ziarnistych limfocytach (LGL) i funkcjonalnie jako leukocyty o spontanicznej zdolności cytotoksycznej, umożliwiającej oporność wątroby na tworzenie przerzutów nowotworowych przenoszonych przez krew. Celem przedstawionej w niniejszym artykule metody jest umożliwienie selektywnego pozyskiwania leukocytów MH w celu zbadania tej ważnej i unikalnej populacji komórek (i kompartmentu immunologicznego) oraz wyjaśnienia wpływu różnych manipulacji (np. aktywacji immunologicznej) na te specyficzne komórki.

Pomimo niepowodzenia odporności w eliminacji rozwijającego się guza pierwotnego, dowody u pacjentów z rakiem i modelach zwierzęcych wskazują, że układ odpornościowy może kontrolować krążące komórki nowotworowe, mikroprzerzuty i choroby resztkowe poprzez odporność komórkową (CMI). Istnieje jednak wyraźna niespójność między tymi możliwościami in vivo a badaniami in vitro na ludziach i zwierzętach, które wykazują, że większość autologicznych komórek nowotworowych jest odporna na cytotoksyczność przez krążące lub śledzioniczne leukocyty^1,2. Niespójność tę można przypisać, przynajmniej częściowo, istnieniu in vivo odrębnej subpopulacji leukocytów, a mianowicie leukocytów wątroby z marginesem (sinusoidami) i ich subpopulacji aktywowanych komórek NK, a mianowicie komórek pit³. Rzeczywiście, niepublikowane dane z naszego laboratorium wskazały, że u szczurów F344 syngeniczne komórki nowotworowe (MADB106), które okazały się odporne na leukocyty krążące i śledzionowe, były lizowane przez komórki MH-NK⁴. Tak więc komórki nowotworowe, które są rzekomo "oporne" na krążące leukocyty, mogą być kontrolowane przez komórki MH-NK. Warto zauważyć, że u myszy zwiększona aktywność MH-NK jest widoczna dopiero po stymulacji immunologicznej in vivo (np. poprzez zastosowanie Poly I:C lub CpG-C)⁵.

Komórki NK specyficzne dla wątroby (MH-NK) znajdują się wewnątrz światła sinusoidalnego, przylegając do komórek śródbłonka i komórek Kupffera. Komórki MH-NK charakteryzują się wyłącznie kulistymi, gęstymi granulkami i pęcherzykami z rdzeniem^{pręcikowym 6}, które zawierają kwaśną fosfatazę jako enzymy lizosomalne oraz perforynę i granzymy jako substancje bioaktywne^7,8. W porównaniu z krążącymi komórkami NK, komórki MH-NK wykazują większą liczbę i wielkość granulek i pęcherzyków^9-11. W warunkach zapalnych wykazano, że komórki MH-NK wykazują wyższą ekspresję LFA-1¹² w porównaniu z krążącymi komórkami NK. Ta zwiększona ekspresja może stanowić mechanizm, dzięki któremu komórki MH-NK są bardziej cytotoksyczne wobec niektórych komórek nowotworowych niż krążące komórki NK ^13,14. Co ciekawe, po inkubacji in vitro z interleukiną (IL)-2, komórki MH-NK ulegają powiększeniu, a ich liczba i rozmiar granulek wzrastają, z których wszystkie są zgodne z profilem komórek zabójcy aktywowanych limfokiną (LAK)¹⁵.

Aktywne leukocyty MH nie mogą być uzyskane wyłącznie za pomocą standardowych metod pozyskiwania leukocytów wątrobowych, które opierają się na mieleniu i biologicznej degradacji tkanki. Nasze podejście perfuzyjne opisane w niniejszym dokumencie ma dwie główne zalety w porównaniu z podejściami standardowymi. Po pierwsze, podejście perfuzyjne selektywnie zbiera leukocyty MH, zapobiegając zanieczyszczeniu przez inne leukocyty z innych przedziałów wątroby. Po drugie, technika perfuzji lepiej zachowuje integralność, aktywność i środowisko fizjologiczne leukocytów MH, w przeciwieństwie do podejść do przetwarzania tkanek, które uszkadzają komórki lub zmieniają ich morfologię, a z powodu uszkodzenia tkanek indukują uwalnianie różnych czynników, które wyraźnie modulują aktywność immunologiczną.

Wątroba jest głównym organem docelowym dla przerzutów nowotworowych i różnych infekcji¹⁶. Ponieważ komórki MH wykazują unikalne cechy, ważne jest, aby badać tę specyficzną populację w różnych warunkach w odniesieniu do tych patologii. Na przykład warto zauważyć, że wykazano, że ogólnoustrojowa aktywacja immunologiczna przez różne BRM (np. poli I:C lub CpG-C) aktywuje MH-leukocyty bardziej niż krążące leukocyty⁵.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Tel-Awiwie.

1. Protokół dla szczurów

1. Preparaty
   1. Przygotować heparynizowany roztwór PBS (30 jednostek/ml) do użycia w temperaturze pokojowej (RT), dodając 30 jednostek heparyny wolnej od konserwantów na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Oblicz 35 ml na zwierzę.
   2. Przepuścić heparynizowany PBS przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
   3. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne – 2 pary nożyczek, kleszcze o krawędziach, 2 hemostatyki i kleszczyki do tkanek zębów (autoklaw w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w ustawieniu grawitacyjnym (na sucho)).
2. Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
   1. Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieścić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem wokół głowy szczura, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.
   2. Otworzyć jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania. Unikaj krwawienia przez ten proces.
      1. W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.
   3. W ciągu około minuty zbierz jak najwięcej krwi (~6 ml od zwierzęcia o wadze 250 g) z prawej komory do strzykawki.
   4. Zacisnąć żyłę główną ogona hemostatem jak najbliżej serca, aby umożliwić zebranie perfuzatu.
   5. Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.
   6. Wprowadzić cewnik dożylny 25 G, podłączony do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej, jak to możliwe, ale rostralnie do żyły śledzionowej.
   7. Wprowadzić igłę motylkową o pojemności 25 g, połączoną ze strzykawką o pojemności 5 ml, do żyły głównej dolnej, doogonowej do hemostatu.
   8. Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać do strzykawki pierwszy ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią. Kontynuuj, aż kolor perfuzatu zmieni kolor na bladoczerwony (około 3-5 ml). Zauważ, że kolor wątroby zmienia się w kierunku jasnobrązowego.
   9. Nie zatrzymując pompy perystaltycznej, wymienić strzykawkę o pojemności 5 ml na strzykawkę o pojemności 20 ml i pobrać co najmniej 20 ml perfuzatu wątrobowego, stosując większą prędkość perfuzji (do 4 ml/min). Stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbiorczej i unikać zbyt silnego podciśnienia (które może zatkać igłę poprzez zapadnięcie się ścianek żyły głównej).
   10. Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni się na jasnobrązowy.
3. Ekstrakcja leukocytów
   1. Odwirować perfuzat przez 10 minut w temperaturze 400 x g, 24 °C.
   2. Odessać supernatant
   3. Dodać 10 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać sklarowany sklaratant. W oparciu o cele badania, należy zastosować preparat w takiej postaci, w jakiej jest, lub przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie (np. separację od gradientu gęstości).
      1. W szczególności należy nałożyć 4 ml perfuzatu na 4 ml masy separacji o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 cm3. Wirować probówki o gramaturze 754 x RT przez 30 minut z odrywaniem.
      2. Otrzymać warstwy jednojądrzaste na granicy faz separacja-gradient gęstości-supernatant za pomocą ręcznego pipetowania, przemyć w PBS i włożyć do probówki o pojemności 5 ml.

2. Protokół myszy

1. Preparaty
   1. Przygotować heparynizowany roztwór PBS (30 jednostek/ml) do użycia w temperaturze pokojowej (RT), dodając 30 jednostek heparyny wolnej od konserwantów na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Oblicz 20 ml na zwierzę.
   2. Przepuścić heparynizowany PBS przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
   3. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne – 2 pary nożyczek, kleszcze o krawędziach, 2 hemostatyki i kleszczyki do tkanek zębów (autoklaw w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w ustawieniu grawitacyjnym (na sucho)).
2. Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
   1. Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieść wokół głowy myszy probówkę o pojemności 15 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.
   2. Przymocuj kończyny myszy do łóżka.
   3. Otwórz jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania, pozostawiając dolną część przepony w stanie nienaruszonym (aby stworzyć drenującą kałużę klatki piersiowej). Unikaj krwawienia przez ten proces.
      1. W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.
   4. Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.
   5. Wprowadzić igłę o wadze 30 g, podłączoną do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej rostralnej do żyły śledziony.
   6. Przeciąć żyłę główną dolną powyżej przepony, aby umożliwić drenaż i zebranie perfuzatu z jamy klatki piersiowej.
   7. Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać pierwsze 3 ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią z kałuży klatki piersiowej.
   8. Odrzuć ten perfuzat. W razie potrzeby powtórz takie mycie ponownie, używając soli fizjologicznej, a dopiero potem zacznij zbierać perfuzat wątroby.
   9. Ponownie rozpocząć perfuzję z prędkością do 4 ml/min i pobrać 10 ml perfuzatu z jamy klatki piersiowej za pomocą motylka podłączonego do strzykawki.
   10. Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni się na jasnobrązowy.
3. Ekstrakcja leukocytów
   1. Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 x g.
   2. Odessać supernatant.
   3. Dodać 10 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać supernatant W oparciu o cele badania, należy zastosować preparat w takiej postaci, w jakiej jest, lub przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie (np. separację w gradinie gęstości).
      1. W szczególności co 4 ml perfuzatu nakładać na 4 ml masy separacyjnej o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 cm3. Wirować probówki o gramaturze 754 x RT przez 30 minut z odrywaniem.
      2. Otrzymać warstwy jednojądrzaste na granicy faz separacja-gradient gęstości-supernatant za pomocą ręcznego pipetowania, przemyć w PBS i włożyć do probówki o pojemności 5 ml.

Wyniki

U szczurów F344 porównaliśmy cytotoksyczność komórek MH-NK (pozyskanych z zatok wątrobowych poprzez wymuszoną perfuzję wątroby) z cytotoksycznością całej populacji komórek wątroby po mechanicznym rozcieraniu tkanki wątrobowej oraz z cytotoksycznością krążących leukocytów. Wszystkie preparaty komórkowe przemyto co najmniej 3 razy, zgodnie z rutyną w badaniach immunologicznych, a jako linie komórek docelowych wykorzystano allogeniczną linię YAC-1 lub syngeniczną linię MADB106. Jak wskazano ...

Dyskusja

Przedstawiona w niniejszym artykule metoda perfuzji wątroby umożliwia selektywne pobieranie i badanie unikalnej populacji leukocytów wątrobowych z marginesem. Komórki NK wątroby, zwane również komórkami PIN³, stanowią charakterystyczną populację komórek NK, które znajdują się w sinusoidach wątroby. Występują u szczurów, myszy¹⁷ i u ludzi^18,19. W porównaniu z izolowanymi obwodowymi komórkami NK, komórki pit wykazywały wyższą cytotoksyczność wobec docelowych linii komórkowych YAC-1 i CC531<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Autoclud Pompa
Igła motylkowa	OMG		26 G
Igła motylkowa	OMG		21 G*3/4"
Strzykawka	roztwór		1 ml
Strzykawka	roztwór		2,5 ml
Strzykawka	roztwór		5 ml
Strzykawka	Roztwór		10 ml
Strzykawka	Roztwór		25 ml
			krawędziach
Nożyczki
hemostat
Kleszcze
22 W Fluorescencyjna lampa

perystaltycznaKleszcze odo tkanek lupa do światła dziennego