Artykuł metodologiczny

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53919

⸱

10 marca 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych. Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Streszczenie

Opracowano protokoły generowania populacji kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych, ale zazwyczaj dają one komórki o mieszanych fenotypach. Naukowcy zainteresowani prowadzeniem badań obejmujących określone podtypy miocytów wymagają bardziej ukierunkowanego podejścia różnicującego. Poprzez traktowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES) Grem2, wydzielanym antagonistą BMP, który jest niezbędny do tworzenia komory przedsionkowej in vivo, można wygenerować dużą liczbę komórek serca o fenotypie przedsionkowym. Zastosowanie zmodyfikowanej linii pluripotencjalnych komórek macierzystych Myh6-DSRed-Nuc pozwala na identyfikację, selekcję i oczyszczanie kardiomiocytów. W tym protokole ciała zarodkowe są generowane z komórek Myh6-DSRed-Nuc przy użyciu metody wiszącej kropli i utrzymywane w zawieszeniu do 4 dnia różnicowania (d4). W d4 komórki są traktowane Grem2 i powlekane na płytkach pokrytych żelatyną. Pomiędzy k8-d10 w kulturach obserwuje się duże obszary kurczenia się, które kontynuują ekspansję i dojrzewanie do d14. Analizy molekularne, histologiczne i elektrofizjologiczne wskazują, że komórki w komórkach poddanych działaniu Grem2 uzyskują cechy podobne do przedsionków, zapewniając model in vitro do badania biologii kardiomiocytów przedsionkowych i ich odpowiedzi na różne czynniki farmakologiczne.

Wprowadzenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste są potężnym narzędziem do generowania i badania komórek z wielu trudno dostępnych tkanek do badań podstawowych i przedklinicznych, szczególnie u ludziw wieku 1-5 lat. Właściwa modulacja rozwojowych szlaków sygnałowych może skierować różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do pożądanego losu fenotypowego. Opracowano wiele protokołów generowania kardiomiocytów (CM) z pluripotencjalnych komórek macierzystych6-14. Protokoły te na ogół obejmują modulację nadrodziny TFGβ (aktywina, BMP i TGFβ) i szlaków Wnt poprzez czasowe dodawanie egzogennych czynników wzrostu i / lub małych cząsteczek10,12-15. Protokoły te są na ogół skuteczne w zwiększaniu odsetka komórek, które stają się CM, ale brakuje im swoistości, generując mieszaną populację komórek reprezentujących linie układu przedsionkowego, komorowego i węzłowego/przewodzącego. W celu zbadania określonych podtypów serca konieczne jest bardziej ukierunkowane podejście różnicujące.

Gremlin2 (Grem2, zwany także Białko Związane z Dan i Cerberusem lub w skrócie PRDC) jest wydzielanym antagonistą BMP, który jest niezbędny do prawidłowego różnicowania serca i tworzenia komory przedsionkowej podczas rozwoju serca u danio pręgowanego16. Traktowanie różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych Grem2 w 4 dniu różnicowania, tuż po szczytowej ekspresji mezodermalnych markerów T-Brachyury i Cerberus takich jak 1, zwiększa wydajność CM i generuje pulę komórek głównie linii przedsionkowej14.

Rekombinowany Grem2 jest używany do leczenia różnicujących się komórek i może być wytwarzany przy użyciu standardowych technik produkcji białek17 lub może być zakupiony komercyjnie. Jest dobrze rozpuszczalny w roztworach wodnych i może być dodawany egzogennie do kultur w pożądanym punkcie czasowym.

Różnicowanie można śledzić za pomocą RT-qPCR do ilościowego określenia ekspresji markerów reprezentatywnych dla komórek progenitorowych układu sercowo-naczyniowego, progenitorów sercowych i zaangażowanych CMs. Immunofluorescencja może być również wykorzystana do identyfikacji i wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia typów komórek serca.

Aplikacje, które wymagają czystych populacji, są łatwiej realizowane, gdy używa się systemu reporterowego do identyfikacji i izolowania CM. W tym celu wprowadziliśmy konstrukt αMHC-DsRedNuc do mysiej linii komórkowejCGR8 ES 14. Komórki CGR8 rosną i pozostają pluripotencjalne bez komórek zasilających, co ułatwia testy ekspansji i różnicowania18. Linia komórkowa ES zawiera sekwencję kodującą białko fluorescencyjne DSR z sygnałem lokalizacji jądrowej pod specyficznym dla serca promotorem genu łańcucha ciężkiego alfa miozyny (αMhc lub Myh6). Korzystając z tych komórek, CM można łatwo zidentyfikować i wyizolować w celu oceny ilościowej, sortowania komórek, elektrofizjologii, badań przesiewowych leków i badania mechanizmów różnicowania przedsionków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych, roztworów i odczynników.

  1. Przygotować 500 ml pożywki z mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) przez mieszanie i sterylne filtrowanie (wielkość porów 0,2 μm) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml 100X skoncentrowany zamiennik L-glutaminy, 5 μl rekombinowanego mysiego czynnika hamującego białaczkę (LIF) w dawce 1 x 107 jednostek na ml, i 1,43 μl ß-merkaptoetanolu (stężenie końcowe wynosi 50 μM). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
  2. Przygotuj 500 ml pożywki różnicującej ciało zarodka (EB), mieszając i sterylnie filtrując: 391 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 100 ml inaktywowanego termicznie FBS, 5 ml 100X skoncentrowanego zamiennika L-glutaminy, 5 ml 100X skoncentrowanych aminokwasów endogennych (NEAA) i 2,86 μl ß-merkaptoetanolu (końcowe stężenie wynosi 100 μM). Przechowywać w temperaturze 4°C do momentu przygotowania do użycia.
  3. Przygotować 0,2% m/v roztwór żelatyny, mieszając 1 g sproszkowanej żelatyny ze skóry świń z 500 ml przefiltrowanego, destylowanegoH2O. Sterylizować w autoklawie. Należy pamiętać, że żelatyna może nie być całkowicie rozpuszczalna w wodzie w temperaturze pokojowej. Po autoklawowaniu żelatyna powinna być całkowicie rozpuszczona. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
  4. Przygotować rekombinowane podwielokrotności białka Grem2 przez rozpuszczenie 50 μg osadu liofilizowanego Grem2 w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 0,1 % BSA w celu uzyskania 0,5 μg/μl roztworu podstawowego. Podzielić 20 μl tego roztworu podstawowego na pięć sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  5. Przygotować PBS zgodnie z opublikowanymi protokołami lub zakupić jako zapas 10X i rozcieńczyć 1:10 przefiltrowanym, destylowanymH2O, aby uzyskać 1X robocze rozcieńczenie19. Przed użyciem wysterylizuj PBS przez autoklawowanie. Przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. W niektórych krokach stosuje się DPBS bez Ca2+ i Mg2+. Jest to kupowane jako rozwiązanie 1X. Informacje dotyczące zamawiania znajdują się w tabeli odczynników.

2. Przygotowanie 10 cm pokrytych żelatyną naczyń do kultur tkankowych

  1. Do wysterylizowanego kaptura do hodowli tkankowych dodać 5 ml 0,2 % roztworu żelatyny do każdego 10 cm naczynia do hodowli tkankowej w celu otoczenia. Umieścić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut lub do 4 dni.

3. Przygotowanie 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych pokrytych żelatyną

  1. Do wysterylizowanego kaptura do hodowli tkankowej dodać 1 ml 0,2 % żelatyny do każdego dołka na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut lub do 4 dni.

4. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych

  1. Rozmrażanie mESC
    1. Przygotować pożywkę mESC, ogrzewając ją do temperatury cieplnej w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkankowych. Dodaj 10 ml pożywki RT do pokrytego żelatyną naczynia o średnicy 10 cm.
    2. Wyjąć 1 fiolkę z mESC zawierającymi około 1 x 106 komórek z kriomagazynowania. Trzymając kriowial szczypcami, umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Delikatnie obracać, aż zawiesina komórek rozmrozi się i w środku fiolki pozostanie tylko mały kryształek lodu. Osusz fiolkę jednorazową, niestrzępiącą się chusteczką i wysterylizuj 70% EtOH.
    3. W sterylnym kapturze do hodowli tkankowej usunąć rozmrożone komórki za pomocą końcówki P1000 z kriowialu i przenieść do 10 cm naczynia przygotowanego w 4.1.1).
    4. Umieścić 10-centymetrowe naczynie w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i równomiernie rozprowadzić komórki, delikatnie przesuwając płytkę od przodu do tyłu, a następnie z boku na bok. Pozwól komórkom przymocować się do płytki O/N lub co najmniej 6 godzin.
    5. Pierwszą rzeczą, jaką jest następny poranek, sprawdź komórki pod kątem przyczepienia za pomocą mikroskopu jasnego pola. W pożywce będą obserwowane niektóre szczątki komórek i martwe komórki. To normalne. Odessać pożywkę z szalek i zastąpić ją 10 ml świeżej pożywki z mESC.
    6. Kontynuuj codzienną wymianę pożywki w komórkach, aby zapobiec różnicowaniu.
  2. Pasażujące mESC
    1. Przejście komórek, gdy 60-70% zlewa się. Przygotować komórki do pasażowania poprzez zasysanie pożywki i płukanie 5 ml sterylnego 1X DPBS bez MgCl2 i CaCl2. Dodaj 2 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
    2. Podczas inkubacji komórek przygotuj nowe 10-centymetrowe naczynie, odsysając roztwór żelatyny i dodając 10 ml pożywki RT mESC. Po 5 minutach sprawdź, czy komórki nie są odłączone. Jeżeli komórki pozostają połączone, należy kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, aż do całkowitego odłączenia.
    3. Ugasić trypsynę-EDTA, dodając 3 ml pożywki mESC. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut do osadzania. Odessać pożywkę z osadu i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki mESC.
    4. W zależności od pożądanego stosunku podziału, dodaj 0,5-1,0 ml zawiesiny komórkowej do każdego dania przygotowanego w kroku 4.2.2). Umieść naczynie w inkubatorze i równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie przesuwając się z powrotem do przodu, a następnie z boku na bok. Pozwól komórkom przyłączyć się O/N lub przez co najmniej 12 godzin.
      UWAGA: Współczynnik podziału 1:10 - 1:20 jest powszechny dla większości linii mESC. Stosunek ten może się różnić w zależności od użytej linii, numeru przejścia i pożądanej konfluencji na nowym talerzu. Aby uzyskać podział w stosunku 1:10, przenieś 1 ml zawiesiny komórek do 9 ml pożywki mESC i płytki w świeżo przygotowanym naczyniu pokrytym żelatyną o średnicy 10 cm.

5. Przygotowanie ciał embrionalnych

UWAGA: Wszystkie etapy, z wyjątkiem wirowania, są wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkanek.

  1. Przygotowanie zawiesiny komórek w pożywkach EB
    1. Po 70% konfluencji (zwykle 24-48 godzin po pasażu) użyj komórek do tworzenia EB. Przygotować komórki do tworzenia EB poprzez odłączenie i granulowanie zgodnie z sekcjami 4.2.1) - 4.2.3).
      Uwaga: Najlepiej jest pasażować komórki co najmniej jeden raz po rozmrożeniu i sprawdzić stan zdrowia (np. bardzo mała śmierć komórek, brak zanieczyszczenia, prawidłowa morfologia) i solidny wzrost (np. podwojenie populacji występujące co 24-48 godzin) przed użyciem do wytwarzania EB.
    2. Zawiesić osad w 5 ml pożywki EB. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    3. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w wymaganej objętości pożywki EB, aby uzyskać końcowe stężenie 25 komórek/μl (lub 2,5 x 104 komórek/ml). Należy pamiętać, że każda pokrywka szalki Petriego zawiera około 60 EB i wymaga około 1,3 ml zawiesiny komórek. Na tym etapie przygotuj wystarczającą objętość zawiesiny komórek, aby wytworzyć pożądaną liczbę EB. Na przykład, jeśli do eksperymentu wymagane jest 240 EBs, przygotuj 5,2 ml przy 2,5 x 104 komórkach/ml.
      UWAGA: mESC, które nie są używane do tworzenia EB, mogą być używane w przyszłych eksperymentach poprzez odwirowanie, ponowne zawieszenie w pożywce mESC i posiew, jak opisano w sekcji 4.2.
  2. Tworzenie ciał embrionalnych
    1. Przygotuj sterylne 10 cm bakteryjne szalki Petri do zawieszania kropli, dodając 2 ml 1X PBS na dno każdej z nich.
    2. Przenieść zawiesinę EB z kroku 5.1) do miski na sterylny roztwór.
    3. Zdejmij pokrywkę z przygotowanej szalki Petriego i ostrożnie nałóż sześćdziesiąt 20 μl kropli zawiesiny EB na wewnętrzną powierzchnię. Można to osiągnąć w efektywny sposób za pomocą pipety wielokanałowej wyposażonej w 6 końcówek. Każda kropla o objętości 20 μl ma teraz 500 komórek.
    4. Delikatnie załóż pokrywkę na dolną połowę bakteryjnej szalki Petriego, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli. Umieścić szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C. Po 2 dniach komórki są gotowe do przepłukania, jak opisano w ppkt 5.3).
  3. Mycie ciał zarodkowych
    Uwaga: Wszystkie etapy zmywania są wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
    1. Po 2 dniach EB są gotowe do mycia i przenoszenia na 6 cm bakteryjne szalki Petriego. Podgrzej 3 ml pożywki EB na szalkę Petriego do temperatury rynkowej. Każda 6 cm bakteryjna szalka Petriego może skutecznie pomieścić 2 pokrywki wiszących kropli.
      Uwaga: Do tego kroku należy użyć niepowlekanej szalki Petriego (patrz tabela materiałów). Nie używaj naczynia do hodowli tkankowej ani żadnej innej powierzchni, która sprzyja adhezji komórek. EB powinny pozostać zawieszone w pożywce do czasu, gdy będą gotowe do posiewu, jak opisano w sekcji 6.
    2. Wyjąć 10 cm szalki Petriego z inkubatora i umieścić w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. Ostrożnie zdejmij pokrywę z EB i przechyl pod kątem 45 stopni.
    3. Używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml zawierającej 3 ml pożywki RT EB, delikatnie przemyć EB do kałuży na dnie pokrywki. Dokładnie sprawdź pokrywę pod kątem EB, które przykleiły się do powierzchni i ponownie spłucz, jeśli to konieczne.
    4. Po umyciu wszystkie EB przenieść na szalkę Petriego o średnicy 6 cm.
    5. Powtórz kroki 5.3.2)-5.3.4) dla wszystkich EB. Każda 6 cm szalka Petriego powinna zawierać EB z dwóch 10-centymetrowych pokrywek. Umieść wszystkie naczynia z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na kolejne dwa dni.
      UWAGA: EB, które są zbyt blisko siebie w zawiesinie, mogą sklejać się ze sobą i tworzyć duże agregaty. Może to negatywnie wpłynąć na sprawność różnicowania serca, a także znacznie zmniejszyć liczbę dostępnych EB. Aby zapobiec agregacji, EB powinny być sprawdzane każdego dnia i rozdzielane, delikatnie przesuwając się do przodu iz powrotem, a następnie z boku na bok. Stosowanie szalek bakteryjnych we wczesnych etapach różnicowania jest konieczne, aby zapobiec przyczepianiu się EB do szalki i umożliwić wzrost EB w zawiesinie.

6. Poszycie i obróbka EB za pomocą Grem2

  1. Przygotować pożywkę do zabiegu Grem2, dodając wystarczającą objętość materiału wyjściowego (0,5 μg/μl) Grem2 do pożywki RT EB w celu końcowego rozcieńczenia 1-5 μg/ml.
    UWAGA: Skuteczne stężenie w leczeniu EB różni się w zależności od linii komórkowej i specyficznej aktywności obecnej partii Grem2. Zaleca się, aby przed użyciem dawkę dostosować w celu uzyskania maksymalnej skuteczności. W przypadku linii CGR8 mESC rutynowo używamy 3-5 μg/ml Grem2. Skuteczne stężenia Grem2 do wytwarzania miocytów przedsionkowych wytworzą szybko kurczące się komórki między 7 a 8 dniami, które są szeroko rozpowszechnione w każdym dołku. Jeżeli w kulturach poddanych działaniu substancji nie obserwuje się fenotypu zarażania, zaleca się dostosowanie dawki Grem2 we wskazanym zakresie.
  2. Przygotować 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, odsysając żelatynowy roztwór powlekający z każdej studzienki i dodając 2 ml pożywki RT Grem2 do zabiegu. Usunąć EB z inkubatora i umieścić w sterylnym kapturze do hodowli tkanek.
  3. Za pomocą P1000 ustawionego na 100 μl przenieś 30 EB z 6-centymetrowych szalek Petriego do każdej studzienki. Umieść EB w inkubatorze i równomiernie rozproszyj, delikatnie przesuwając płytkę z powrotem do przodu, a następnie z boku na bok.
    1. Po przyłączeniu EB do studzienek pokrytych żelatyną, wymieniaj pożywkę Grem2 co dwa dni do 10 dnia. Po 10 dniu należy przerwać leczenie Grem2 i dodawać świeże podłoże EB co dwa dni, aby utrzymać zdrowe komórki.
      UWAGA: Po zamocowaniu EB spłaszczą się wzdłuż powierzchni powlekanej płyty.

7. Dysocjacja komórek w analizie RT-qPCR

  1. Dysocjacja komórek za pomocą trypsyny-EDTA
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki i przepłukać dwukrotnie 1 ml na studzienkę sterylnego DPBS minus Ca2+ i Mg2+.
    2. Dodaj 0,5 ml 0,25% sterylnego roztworu trypsyny-EDTA do każdej studzienki, z której zostaną pobrane komórki.
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
    4. Po 5 minutach sprawdź komórki pod kątem dysocjacji. Jeśli komórki nadal pozostają przymocowane do dna studzienki, delikatnie stuknij, aby poluzować. Jeśli stukanie nie poluzuje komórek, umieść je z powrotem w inkubatorze i monitoruj co 2 minuty, aż komórki zostaną całkowicie odłączone.
    5. Zneutralizuj roztwór trypsyny-EDTA, dodając 0,5 ml pożywki EB do każdej studzienki.
    6. Przenieść cały 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki z mikrowirówką o pojemności 1,5 ml.
    7. Granulki komórek przez wirowanie w wirówce stołowej przez 5 minut przy 300 x g.
    8. Odessać pożywkę z granulatu i natychmiast przejść do lizy lub przechowywać osad w temperaturze -70 °C, aż będzie gotowy do lizy. Długotrwałe przechowywanie granulek nie jest zalecane, ponieważ może to prowadzić do degradacji RNA.
  2. Liza komórek i analiza molekularna
    1. W tym momencie komórki są gotowe do izolacji RNA przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji kolumnowej lub przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producentów (patrz tabela materiałów). Po wyizolowaniu odwrotnej transkrypcji RNA i użyciu cDNA do analizy RT-qPCR przy użyciu standardowych technik20, 21,
      UWAGA: Startery używane przez to laboratorium do RT-qPCR są wymienione w Tabeli 1. Tożsamość przedsionków potwierdza się za pomocą kombinacji RT-qPCR w celu zbadania ekspresji genów przedsionków i komór oraz elektrofizjologii w celu zarejestrowania czasu trwania potencjału czynnościowego (patrz punkt 8). Wybór genów jest uwzględniony w tym protokole jako przykład wiarygodnych markerów przedsionkowych i komorowych. Więcej informacji na temat ekspresji genów przedsionkowych i komorowych w kontekście różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych znajduje się w piśmiennictwie 14.

8. Analiza elektrofizjologiczna

  1. Dysocjacja komórek za pomocą kolagenazy
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki i przepłukać dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS na studzienkę.
    2. Dodać 0,5 ml roztworu kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml do każdego dołka.
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut.
    4. Po 5 minutach sprawdź komórki pod kątem dysocjacji. Jeśli komórki nadal pozostają połączone ze sobą lub z dnem studzienki, delikatnie stuknij, aby się poluzować. Dalej dysocjuj komórki przez delikatne rozcieranie za pomocą P1000.
      UWAGA: Aby ułatwić zapis za pomocą zacisku krosowego, komórki należy rozcierać, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
    5. Dodać 0,5 ml pożywki EB do każdej studzienki i wymieszać pipetując.
    6. Przenieść cały 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki z mikrowirówką o pojemności 1,5 ml.
    7. Granulki komórek przez wirowanie w wirówce stołowej przez 5 minut przy 300 x g.
    8. Zasysać pożywkę z granulek komórkowych.
    9. Ponownie zawieś komórki w 500 μl PBS z 10% FBS, upewniając się, że rozpleść się do zawiesiny pojedynczej komórki.
  2. Charakterystyka elektrofizjologiczna.
    UWAGA: W tym czasopiśmie opublikowano wiele doskonałych protokołów dotyczących stosowania pojedynczego zacisku krosowego do pomiaru potencjałów błony komórkowej. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykonywania zacisku krosowego z pojedynczą komórką, początkujący czytelnik jest odsyłany do tych protokołów21-24. Poniżej znajdują się szczegółowe informacje dotyczące tego protokołu, które pomogą doświadczonemu elektrofizjologowi przygotować i obchodzić się z CM pochodzącymi z mESC do charakterystyki podtypów.
    1. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy składający się z następujących składników: 10 mM buforu HEPES, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM glutaminianu potasu, 10 mM KCl i 10 mM NaCl. Doprowadzić roztwór do pH 7,2 za pomocą NaOH.
    2. Przygotować zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu (kąpieli) składający się z następujących składników: 2 mM HEPES, 10 mM glukozy, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5,4 mM KCl i 137 mM NaCl. Dostosować roztwór do pH 7,4 za pomocą NaOH.
    3. Przygotuj szklaną pipetę, która mierzy rezystancję 2-5 MΩ po napełnieniu roztworem nagrywającym przy użyciu standardowego szkła borokrzemianowego z żarnikiem.
    4. Przenieść 100 μl zawieszonych komórek do komory rejestracyjnej zawierającej zewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy za pomocą P200.
      UWAGA: Komórki mogą być łatane w zawiesinie lub, w celu ułatwienia obchodzenia się z nimi i stosowania do leczenia farmakologicznego i/lub testów perfuzyjnych, mogą być wysiewane na szkiełko nakrywkowe pokryte żelatyną, jak opisano w ppkt 8.2.5).
    5. Przygotować szkiełka nakrywkowe ze szkła pokrytego żelatyną, umieszczając szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm w każdym dołku płytki 6-dołkowej i przykrywając roztworem żelatyny, jak opisano w sekcji 3.1) niniejszego protokołu.
      1. Po upływie co najmniej 30 minut odessać roztwór żelatyny i dodać 100 μl zawieszonych komórek bezpośrednio do szkiełka nakrywkowego i umieścić całą 6-dołkową płytkę w inkubatorze na co najmniej 2 godziny lub do momentu, gdy komórki się zgrzebią. Po połączeniu komórek zdjąć szkiełko nakrywkowe i umieścić w komorze rejestracyjnej z zewnątrzkomórkowym roztworem rejestrującym.
        UWAGA: W przypadku korzystania z fluorescencyjnej linii reporterowej mESC αMHC-DsRed, CM można zidentyfikować na podstawie ich czerwonych jąder fluorescencyjnych. Jeśli nie korzysta się z linii reportera sercowego, można obserwować spontanicznie kurczące się komórki i izolować je do pomiarów. Pluripotencjalne CM pochodzące z komórek macierzystych są zwykle mniejsze i bardziej zaokrąglone, pozbawione charakterystycznej prostokątnej morfologii w pełni ukształtowanych dorosłych miocytów serca.
    6. Wszystkie nagrania należy wykonywać w temperaturze 37 °C. Łatać pojedyncze ogniwa za pomocą cęgowania całego ogniwa w trybie cęgów prądowych za pomocą pipety ze szkła borokrzemianowego o rezystancji 2-5 MΩ. Użyj delikatnego podciśnienia, aby uzyskać uszczelnienie gigaomowe przed uzyskaniem dostępu do całej komórki. Zastosuj szybkie podciśnienie, aby zerwać błonę i uzyskać dostęp do całej komórki przed zarejestrowaniem potencjałów błonowych.
    7. Wywoływanie potencjałów czynnościowych za pomocą 4 ms iniekcji prądu depolaryzującego.
      UWAGA: W przypadku CM pochodzących z PSC ilość prądu wymagana do powtarzalnego wyzwolenia potencjałów czynnościowych może się różnić. Aby znaleźć optymalny prąd progowy, należy zacząć od stosunkowo niskiego prądu i stopniowo zwiększać amplitudę prądu wyzwalającego, aż do uzyskania powtarzalnych potencjałów czynnościowych.
      UWAGA: Czas trwania potencjału czynnościowego dla miocytów przedsionków indukowanych przez Grem2 wynosi zwykle 20-40 ms i nie ma fazy plateau (Figura 6B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed różnicowaniem pluripotencjalne komórki macierzyste powinny być zwarte i wolne od spontanicznego różnicowania. Komórki przedstawione na Rysunku 1A są gotowe do dysocjacji i wykorzystania w metodzie wiszących kropel, zgodnie z opisem w punkcie 5.1 sekcji protokołu. Komórki przedstawione na Rysunku 1B ulegają spontanicznemu różnicowaniu i nie powinny być stosowane do przygotowania wiszących kropel.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten rutynowo wytwarza kultury z wysokim odsetkiem CM, które są charakterystyczne dla linii przedsionkowej. Podobnie jak w przypadku każdego protokołu różnicowania, należy zwrócić szczególną uwagę na jakość mESC przed różnicowaniem. mESC powinny być rutynowo monitorowane pod kątem prawidłowej morfologii (ryc. 1A). Jakiekolwiek spontaniczne różnicowanie, które występuje przed utworzeniem EB, poważnie ograniczy skuteczność kardiogenezy i powinno zostać usunięte przed pasażowaniem (ryc. 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy tego manuskryptu nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH HL083958 i HL100398 (A.K.H.) oraz 2T32HL007411-33 "Program in Cardiovascular Mechanisms: Training in Investigation" (J.B.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GMEMLife Technologies11710
FBSLife Technologies10082
GlutamaxLife Technologies35050
LIFEMD MilliporeESG1107
ß-MerkaptoetanolSigmaM3148
IMDMSigmaI3390
Aminokwasy endogenneSigmaM7145
10 cm Płytki do hodowli tkankowychSarstedt83.3902
10 cm Bakteryjne szalki PetriegoVWR25384-342
6 cm Bakteryjne szalki PetriegoVWR25384-092
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychSarstedt83.3920
Rekombinowane białko Gremlin 2R& Amp; D Systems2069-PR-050
Sterylne jednostki filtrująceThermo Fisher09-741-02
Żelatyna (ze skóry wieprzowej)SigmaG1890
10X PBS, SterylnaSigmaP5493
BSA Sigma5470
0,05% roztwór trypsyny-EDTALife Technologies25300054
DPBS, bez wapnia, bez magnezuLife Technologies14200

Bibliografia

  1. Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
  2. Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
  3. Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  4. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  5. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
  6. Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  8. Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
  9. Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).
  10. Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
  11. Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  14. Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
  15. Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  16. Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
  17. Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
  18. Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).
  19. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
  22. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  23. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  24. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  25. Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  26. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
  27. Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
  28. Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  29. Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
  30. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Traktowanie Grem2tworzenie cia embrionoidalnychmetoda wisz cej kroplipowlekanie elatynlinia Myh6 DSRed Nucr nicowanie kardiogennefenotyp przedsionkowyanaliza elektrofizjologiczna

Powiązane artykuły