Wykorzystanie techniki laminowania do wykonania mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka

Summary

Ludzka tkanka twardówki to głównie kolagen; dlatego nie jest łatwo wykorzystać ją do celów immunohistochemicznych. Aby osiągnąć cel, jakim było wykonanie immunohistochemii do mikroskopii konfokalnej tkanki twardówki, zastosowano technikę laminowania.

Abstract

Twardówka to gęsta tkanka łączna, która pokrywa i chroni oko. Składa się głównie z gęstych wiązek kolagenowych (typy I, III, IV, V, VI i VII). Ze względu na swoją autofluorescencję, nieprzezroczystość i grubość, nie został uznany za odpowiedni do mikroskopii konfokalnej. Alternatywne podejście do przedstawionego tutaj, które wykorzystuje do immunohistochemii twardówkę utrwaloną w parafinie osadzoną w parafinie, wiąże się z wyzwaniami technicznymi, zwłaszcza podczas wstępnego podgrzewania tkanki w celu pobrania antygenu. Ponieważ twardówka jest stosunkowo uboga zarówno w komórkach, jak i naczyniach, zbadano użycie większych próbek tkanek, aby zapobiec przeoczeniu komórek i zrozumieć ich lokalizację w stosunku do naczyń i innych miejsc anatomicznych. Aby umożliwić analizę większych próbek tkanek pod mikroskopem konfokalnym, przeprowadzono technikę laminowania w celu stworzenia cienkich warstw twardówki. Po analizie wyników badań naczyń krwionośnych CD31 i komórek dodatnich receptora hialuronowego 1 śródbłonka naczyń limfatycznych (LYVE1), dla których uzyskano zgodę do badań naukowych, omówiono zalety i ograniczenia tej metody.

Introduction

Twardówka to sztywna zewnętrzna warstwa pokrywająca oko, która jest wykonana z gęstej tkanki łącznej. Pomaga chronić struktury wewnątrzgałkowe i utrzymywać ciśnienie wewnątrzgałkowe. Tak więc twardówka jest niezbędna do jasnego widzenia. Jest pozbawiony naczyń limfatycznych ^1,2, a tym samym tworzy zewnętrzną, wolną od limfy granicę między nim a wolnym od limfy okiem wewnętrznym ^3-7. Zapewnia również miejsca przyczepu mięśni zewnątrzgałkowych, dzieląc w ten sposób anatomiczne podobieństwa ze ścięgnami. Ponieważ twardówka składa się głównie z gęstych wiązek kolagenu typu I i ma mniejszą liczbę kolagenu typu III, IV, V, VI, VIII ^8,9 i elastyny ^10,11, tkanka ta nie jest łatwa do wykorzystania w immunohistochemii.

Anatomicznie, twardówkę można podzielić na trzy główne warstwy: (1) powierzchownie unaczynioną twardówkę, znajdującą się pod spojówką i torebką czopa oraz w kierunku boków i tyłu oka skierowanego w stronę oczodołu; (2) zrąb twardówki, główna część twardówki; oraz (3) blaszka fusca, która jest cienką, pigmentowaną warstwą znajdującą się bezpośrednio nad błoną naczyniową oka. Nasza wiedza anatomiczna na temat twardówki wywodzi się głównie z pierwszej połowy^{XX wieku.} W tym czasie naukowcy badali anatomię naczyń krwionośnych głównie za pomocą iniekcji z tuszu indyjskiego ¹² i odlewu naczyniowego ^13-15. Później badano go w badaniach angiograficznych ^16-19.

Od tego czasu starsze techniki zostały ulepszone i opracowano nowe, które pozwoliły nam uzupełnić dotychczasową wiedzę anatomiczną. Na przykład minęło zaledwie około dziesięciu lat, odkąd mamy tak wiarygodne markery limfatyczne, jak receptor hialuronowy specyficzny dla śródbłonka naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) ²⁰ lub podoplanina ²¹. Mikroskopia konfokalna oferuje nowe możliwości badania cech anatomicznych różnych tkanek oka. Pozwala na wykorzystanie wielu barwień do różnicowania markerów komórek lub do lokalizacji komórek w odniesieniu do naczyń krwionośnych i innych struktur anatomicznych. Zapewnia przegląd, gdy próbka ma większy rozmiar i pozwala nam przeskanować próbkę w poszukiwaniu określonego typu komórki. Dzięki technologii Z-Stack mikroskopia konfokalna może być stosowana do próbek o wielkości do 100-200 μm. Twardówka różni się grubością od 0,3 mm za przyczepami mięśniowymi i 1 mm na tylnym biegunie ¹¹. Zarówno ze względu na swoją grubość, jak i nieprzezroczystość twardówka nie nadaje się do mikroskopii konfokalnej przy użyciu tradycyjnych metod.

Aby temu zaradzić, tkanki twardówki zostały zalaminowane, aby umożliwić ich analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technologia ta jest przydatna do lepszego zrozumienia zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych sytuacji w twardówce człowieka.

Protocol

Stosowanie tkanek ludzkich musi zostać poddane przeglądowi i zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną lub równoważną instytucję. Opisana tutaj praca została zatwierdzona przez lokalną komisję etyczną i uzyskała zgodę na badania naukowe. Prace te zostały wykonane zgodnie z Deklaracją Helsińską. Próbki twardówki ludzkiej pobrano z oczu dawców globusów (maksymalny czas pośmiertny 24 godziny) w Banku Oczu Wydziału Okulistyki Uniwersytetu w Kolonii w Niemczech.

1. Przygotowanie do eksperymentu

1. Przygotuj 96% etanol i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w różnych probówkach. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciała w zalecanym rozcieńczeniu PBS zawierającym 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i utrzymać wszystkie roztwory na lodzie. Przygotować 100 μl na próbkę.
2. Wyczyść wszystkie narzędzia i użyj ostrych skalpeli. Po wielokrotnym cięciu tym samym skalpelem należy wymienić skalpel.
3. Zaopatrz się w 1-2 kleszczyki do colibri, proste nożyczki do mikropreparowania, skalpel #10 lub mikropióro skalpela okulistycznego i cztery igły 26 G.
4. Owiń folię aluminiową wokół płyty polistyrenowej lub użyj płytki korkowej, aby przymocować chusteczkę. Pracuj pod lornetkowym mikroskopem stereoskopowym. W razie potrzeby pracuj sterylnie pod laminarnym przepływem powietrza.

2. Przygotuj twardówkę

1. Delikatnie przytrzymaj bańkę i wykonaj trepanację perforacyjną na części korowo-twardówkowej, a następnie obróć trepan. Obróć trepan ostrożnie i równomiernie na powierzchnię, aby wykonać równie okrągłe cięcie. Użyj trepana o rozmiarze 15.5 mm. Wytnij pozostałe nasadki zakrzywionymi nożyczkami. Usunąć trepanację rogówkowo-twardówkową. Spowoduje to otwarcie żarówki z przodu.
   1. Połóż twardówkę na waciku otwartą częścią do góry. Usuń siatkówkę i błonę naczyniową oka, używając kleszczyków colibri, aby ściągnąć obie warstwy (siatkówkę i błonę naczyniową oka) z twardówki. Nie pozostawiaj pigmentowanej błony naczyniowej oka na wewnętrznej twardówce. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby usunąć siatkówkę i błonę naczyniową oka z brodawki. Usuń pozostałą spojówkę, mięśnie zewnątrzgałkowe i torebkę czopa z twardówki powierzchownej.
2. Usuń próbkę twardówki w wymaganym rozmiarze za pomocą prostych nożyczek i kleszczy colibri. Pobrać próbki twardówki^{o wielkości około} 2 cm z różnych lokalizacji. Ze względu na mały rozmiar, delikatnie przytrzymaj twardówkę i wytnij wymagany rozmiar jako kwadraty za pomocą prostych nożyczek. Trepanacja korneotwardówkowa określa przedni brzeg próbek twardówki.
   1. Unikaj wielokrotnego chwytania kleszczami, ponieważ obszar, w którym tkanka została złapana, nie nadaje się do analiz mikroskopowych konfokalnych. Przygotować wymaganą liczbę próbek w zależności od rodzaju eksperymentu (np. z przodu lub z tyłu, porównaj rysunek 1) i ilości użytych przeciwciał.
3. Umieścić próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml do późniejszego wykorzystania. Utrwalić próbki w 1,5 ml 96% etanolu przez 15 minut, a następnie umyć je trzy razy przez 5 minut w 1,5 ml PBS na wytrząsarce. Jeśli pracujesz z zamrożoną tkanką, wykonaj ten krok przed zamrożeniem.
4. Użyj świeżej chusteczki. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy zamrozić twardówkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Jeśli pracujesz z zamrożoną tkanką, rozmroź ją przed użyciem. Unikaj powtarzających się cykli rozmrażania i zamrażania.
5. Każdą próbkę należy przechowywać w PBS zawierającym 1,5 ml 5% BSA w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Ten etap indukuje pęcznienie próbki, które jest pomocne w laminowaniu, a także zapobiega niespecyficznemu wiązaniu.
6. Po spęcznieniu próbek przygotuj kwadraty twardówki do laminowania. Pracuj pod mikroskopem, np. lornetkowym mikroskopem stereoskopowym. Próbki twardówki tylnej części ciała należy przymocować do membrany polistyrenowej owiniętej folią aluminiową lub płytką korkową za pomocą igieł o masie 26 G.
7. Zegnij krawędzie igieł, aby nie zakłócały pola widzenia pod mikroskopem.
8. Zalaminuj próbki twardówki o pełnej grubości.
   1. Najpierw przytrzymaj przednią krawędź twardówki za pomocą kleszczyków colibri. Następnie ostrożnie odetnij cienką warstwę powierzchownej twardówki za pomocą skalpela #10, mikropiórka skalpela okulistycznego lub ostrza szpatułki. Trzymaj skalpel poziomo i odetnij powierzchowną warstwę tak cienko, jak to możliwe, od warstwy spodniej.
   2. Wytnij cienką warstwę twardówki z kwadratu twardówki. Metoda ta jest porównywalna ze standardowymi technikami chirurgicznymi mającymi na celu przygotowanie płata podczas trabekulektomii i powinna skutkować warstwami o grubości 30-80 μm (porównaj ryc. 2).
9. Zapobiegaj wysuszeniu twardówki poprzez dodanie niewielkich ilości PBS do tkanki, np. 50 μl PBS za pomocą pipety.
10. Umieść pocięte warstwy w 100 μl PBS na płytce 96-dołkowej i oznacz zarówno orientację (w kierunku zewnętrznym i wewnętrznym), jak i warstwę (powierzchowną i głęboką), np. wodoodpornym kolorem.
11. Powtarzaj kroki 2.7-2.9, aż tkanka zostanie całkowicie laminowana.

3. Wykonaj immunohistochemię

1. Dodać 100 μl wymaganych przeciwciał pierwszorzędowych do zalecanego rozcieńczenia. W tym przypadku należy np. użyć CD 31 (monoklonalny mysi anty człowiek) i przeciwciała LYVE1 (królicze przeciwciało antyludzkie), oba w rozcieńczeniu 1:100 w PBS (zawierającym 2% BSA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Aby zmienić pożywkę w płytce 96-dołkowej, przyłóż pipetę do ścianki studzienki i usuń płyn.
2. Następnego dnia przemyj próbki trzy razy przez 5 minut za pomocą 200-300 μl PBS na wytrząsarce. Dodać 100 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych; tutaj użyj koziego izotiocyjanianu fluoresceiny przeciwko myszom (FITC) i kozich barwników cyjaninowych przeciw królikom 3 (Cy3) i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:300 w PBS zawierającym 2% surowicy koziej.
3. Próbki należy ponownie przepłukać trzykrotnie przez 5 minut w 200-300 μl PBS na wytrząsarce.
4. Przeprowadzić barwienie jądra, np. 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (rozcieńczenie 1:2,000, 100 μl w każdym dołku i inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej), a następnie ponownie przemyć 2 razy w 200-300 μl PBS na wytrząsarce.
5. Przenieść próbki na szkiełka mikroskopowe, zanurzyć je w 1-2 kroplach fluorescencyjnego podłoża mocującego, dodać szkiełko nakrywkowe, uszczelnić je, pokrywając krawędzie przezroczystym lakierem i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia lub bezpośrednio zbadać szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego.
6. Użyj mikroskopu konfokalnego (lub jego odpowiednika) do analizy próbek. Użyj żądanego powiększenia, np. powiększenie 10-40X.
7. Aby zweryfikować grubość próbek, należy dokonać pomiaru za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu Z-Stacks. Ilość możliwych przekrojów twardówki zależy od lokalizacji twardówki, ponieważ grubość różni się równikowo i tylnie (porównaj wprowadzenie).

Results

W reprezentatywnych eksperymentach przeprowadzonych tutaj, istnieją wyraźne korzyści płynące z zastosowania tej konkretnej techniki laminowania. Pierwszy eksperyment ilustruje zróżnicowaną sieć splotu naczynia krwionośnego nadtwardówkowego na trzech reprezentatywnych obrazach (ryc. 3). Naczynia są dodatnie dla CD31.

Drugi eksperyment pokazuje komórki odpornościowe, w szczególności komórki LYVE1 + twardówki i ich...

Discussion

Laminowanie ludzkiej twardówki jest metodą wykonywania mikroskopii konfokalnej na tej tkance. Krytycznym krokiem w tym procesie jest użycie etanolu zamiast formaliny do mocowania tkanki. Z naszego doświadczenia wynika, że lepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu etanolu zamiast formaliny do utrwalania. skalpele pogarszają procedurę i należy ich unikać. Podobnie należy unikać wysychania twardówki, ponieważ komplikuje to procedurę i obniża jakość obrazów.

Jeśli chodzi o barwienie immunohistochemic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% etanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Niemcy	P075.4
	Motic, Hongkong, Chiny	n.a
Igły 26 G	Terumo, Leuven, Belgia	303800
Trepan 15,5 mm	Geuder, Heidelberg, Niemcy	n.a no.10
skalpel	Pióro, pfm medical, Osaka, Japonia	2E+08
skalpel okulistyczny mikro pióro	Feather, pfm medical, Osaka, Japonia	nr 7657BR
Przeciwciało CD 31 (monoklonalne mysie przeciwciało antyludzkie)	Dako, USA	Przeciwciało IR610
LYVE1  (poliklonalny królik anty człowiek)	Zytomed, Niemcy	RBK014-05
kozie przeciwciało anty myszy FITC	Sigma Aldrich, Steinheim, Niemcy	F0257
kozie przeciwciało anty królicze Cy3	Dianova, Niemcy	111-165-003
Kozia surowica normalna	Dako, Glostrup, Dania	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy	Mikroskop 6335.1
Slajdy	Engelbrecht, Edermü nde, Niemcy	WC7695002
Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Niemcy	7695026
DAKO Medium do montażu fluorescencyjnego	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510	Carl Zeiss AG, Jena, Niemcy	n.d