Method Article

Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

DOI:

10.3791/53924

⸱

May 17th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD to miogenny czynnik transkrypcyjny o dużej zdolności do indukowania miogennego transdyferencjacji wielu w pełni zróżnicowanych linii komórkowych niezwiązanych z mięśniami. Mechanizmy epigenetyczne zaangażowane w tę transdyferencjację są w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy metodę oczyszczania z podwójnym powinowactwem, a następnie spektrometrię mas, aby wyczerpująco scharakteryzować partnerów MyoD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie końcówek mięśni szkieletowych zaczyna się od zaangażowania pluripotencjalnych komórek prekursorowych mezodermalnych do mioblastów. Komórki te mają nadal zdolność do namnażania się lub mogą różnicować się i łączyć w wielojądrowe miotuby, które dojrzewają dalej, tworząc włókna mięśniowe. Różnicowanie końcówek mięśni szkieletowych jest koordynowane przez skoordynowane działanie różnych czynników transkrypcyjnych, w szczególności członków czynników regulacyjnych mięśni lub MRF (MyoD, Myogenin, Myf5 i MRF4), zwanych również rodziną miogennych czynników transkrypcyjnych bHLH. Czynniki te współpracują z kompleksami przebudowującymi chromatynę w ramach skomplikowanej transkrypcyjnej sieci regulacyjnej, aby osiągnąć miogenezę szkieletu. W tym przypadku MyoD jest uważany za główny miogenny czynnik transkrypcyjny w wyzwalaniu różnicowania końcówek mięśniowych. Pogląd ten jest wzmocniony przez zdolność MyoD do przekształcania komórek niemięśniowych w komórki mięśni szkieletowych. W tym miejscu opisujemy podejście stosowane do identyfikacji partnerów białkowych MyoD w wyczerpujący sposób w celu wyjaśnienia różnych czynników zaangażowanych w różnicowanie końcówek mięśni szkieletowych. Długoterminowym celem jest zrozumienie mechanizmów epigenetycznych zaangażowanych w regulację genów mięśni szkieletowych, tj. celów MyoD. Partnerzy MyoD są identyfikowani za pomocą Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) z systemu heterologicznego sprzężonego z charakterystyką spektrometrii mas (MS), a następnie walidacji roli odpowiednich partnerów podczas różnicowania końcówek mięśni szkieletowych. Nieprawidłowe formy czynników miogennych lub ich nieprawidłowa regulacja są związane z szeregiem zaburzeń mięśni: miastenią wrodzoną, dystrofią miotoniczną, mięsakiem prążkowanokomórkowym i defektami regeneracji mięśni. W związku z tym czynniki miogenne stanowią pulę potencjalnych celów terapeutycznych w zaburzeniach mięśniowych, zarówno w odniesieniu do mechanizmów wywołujących samą chorobę, jak i mechanizmów regeneracyjnych, które mogą poprawić leczenie choroby. W związku z tym szczegółowe zrozumienie oddziaływań międzycząsteczkowych i programów genetycznych kontrolowanych przez czynniki miogenne jest niezbędne do racjonalnego projektowania skutecznych terapii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokomórkowe organizmy eukariotyczne składają się z różnych organów i tkanek. Każda funkcjonalna tkanka ma określoną ekspresję wzorca genetycznego, która jest określana na każdym etapie różnicowania. Różnicowanie komórkowe polega na aktywacji określonych genów, utrzymaniu ich ekspresji i, ogólnie, wyciszeniu zestawu genów, takich jak te zaangażowane w proliferację komórek. Różnicowanie mięśni szkieletowych, czyli miogeneza, jest zatem procesem wieloetapowym, który rozpoczyna się od wyznaczenia mezodermalnych komórek macierzystych w mioblasty, a następnie prowadzi do końcowego różnicowania tych mioblastów najpierw w miotubki jednojądrowe, a następnie wielojądrkowe. Tak więc mioblasty są "zdeterminowanymi" komórkami, które nadal są zdolne do proliferacji, ale są zaangażowane w linię mięśni szkieletowych, a zatem mogą różnicować się wyłącznie w komórki mięśni szkieletowych podczas rozwoju embrionalnego lub regeneracji mięśni dorosłych. Proces różnicowania końcówek mięśni szkieletowych jest koordynowany przez specyficzny program genetyczny, który rozpoczyna się od trwałego wyjścia z cyklu komórkowego komórek prekursorowych mioblastów, co prowadzi do ostatecznego wyciszenia genów związanych z proliferacją, takich jak geny docelowe E2F1. Rzeczywiście, podczas procesu końcowego różnicowania, zatrzymanie proliferacji mioblastów jest kluczowym krokiem, który poprzedza ekspresję genów specyficznych dla mięśni szkieletowych i fuzję mioblastów z miotubami2. Taki program pozwala dorosłym komórkom macierzystym mięśni, zwanym również komórkami satelitarnymi, różnicować się podczas procesu regeneracji po urazie mięśni szkieletowych.

Miogeneza ssaków jest krytycznie zależna od rodziny miogennych podstawowych czynników transkrypcyjnych helisa-pętla-helisa (bHLH) MyoD, Myf5, MRF4 i Myogenin, często określanych jako rodzina czynników determinacji mięśni szkieletowych lub MRF (Muscle Regulatory Factors)3. Każdy z nich odgrywa istotną rolę w specyfikacji i różnicowaniu komórek mięśni szkieletowych i ma określony wzorzec ekspresji4, 5-7. Aktywacja Myf5 i MyoD stanowi decydujący krok, który angażuje komórki do linii miogennej, a późniejsza ekspresja miogeniny wyzwala miogenezę z aktywacją genów specyficznych dla mięśni szkieletowych, takich jak MCK (kinaza kreatynowa mięśniowa). Miogenne czynniki transkrypcyjne bHLH współpracują z członkami rodziny MEF2 w aktywacji genów mięśniowych z wcześniej niemych loci8. Stymulują również transkrypcję genów mięśni szkieletowych jako heterodimery z wszechobecnymi białkami bHLH, E12 i E47, znanymi jako białka E, które wiążą tak zwane E-boxy w różnych regionach regulatorowych genów8. Twist, Id (inhibitor różnicowania) i inne czynniki negatywnie regulują ten proces, konkurując z MyoD o wiązanie białek E8.

MyoD jest uważany za głównego gracza w wywoływaniu różnicowania końcówek mięśniowych9, ponieważ ma zdolność do wywoływania miogennego programu determinacji/różnicowania (trans-dyferencjacji) w wielu w pełni zróżnicowanych układach niemięśniowych10-13. Rzeczywiście, wymuszona ekspresja MyoD indukuje trans-różnicowanie różnych typów komórek, nawet tych pochodzących z innego pochodzeniaembriologicznego12. Na przykład MyoD może przekształcać hepatocyty, fibroblasty, melanocyty, neuroblasty i adipocyty w komórki podobne do mięśni. Transróżnicujące działanie MyoD polega na nieprawidłowej aktywacji miogennego programu genetycznego (w szczególności jego genów docelowych) w środowisku niemięśniowym, co towarzyszy wyciszeniu pierwotnego programu genetycznego (w szczególności genów proliferacji).

W proliferujących mioblastach, MyoD ulega ekspresji, ale nie jest w stanie aktywować swoich docelowych genów, nawet gdy wiąże się z ich promotorami14-16. W związku z tym wymóg, aby MyoD ulegał ciągłej ekspresji w niezróżnicowanych mioblastach, pozostaje dość nieuchwytny. MyoD może tłumić swoje docelowe geny z powodu rekrutacji represyjnych enzymów modyfikujących chromatynę w proliferujących mioblastach przed załadowaniem aktywujących enzymów remodelujących chromatynę14,17. Na przykład w proliferujących mioblastach MyoD jest związany z korepresorem transkrypcji KAP-1, deacetylazami histonowymi (HDAC) i represyjnymi metylotransferazami lizyny (KMT), w tym histonem H3 lizyną 9 lub H3K9 i H3K27 KMT, i aktywnie hamuje ekspresję genów docelowych poprzez ustanowienie lokalnie represyjnej struktury chromatyny14,17. Co ważne, niedawny raport wykazał, że MyoD sam w sobie jest bezpośrednio metylowany przez H3K9 KMT G9a, co powoduje zahamowanie jego aktywności transaktywującej16.

Mechanizmy epigenetyczne związane z tym trans-różnicowaniem komórek niemięśniowych przez MyoD są w dużej mierze nieznane. Warto zauważyć, że niektóre linie komórkowe są odporne na transdyferencję indukowaną przez MyoD. Tak więc w komórkach HeLa MyoD jest albo nieaktywny, albo nawet może funkcjonować jako represor, a nie aktywator transkrypcji z powodu braku ekspresji podjednostki BAF60C kompleksu przebudowującego chromatynę SWI / SNF18. Model ten może być zatem przydatny do lepszego scharakteryzowania mechanizmów represji genów indukowanej przez MyoD. Nadaje się również do badania zdolności MyoD do indukowania represyjnego środowiska chromatyny w docelowych loci z powiązanymi partnerami, a tym samym do odkrycia zależnych od MyoD mechanizmów represyjnych w proliferujących mioblastach w celu precyzyjnego dostrojenia różnicowania końcowego.

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji partnerów MyoD za pomocą Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) sprzężonego z charakteryzacją spektrometrii mas (MS). Zastosowanie komórek HeLa-S3 stabilnie eksprymujących Flag-HA-MyoD pozwoliło uzyskać wystarczającą ilość materiału do oczyszczenia kompleksów MyoD z frakcjonowanych ekstraktów jądrowych. Po identyfikacji partnerów MyoD w systemie heterologicznym nastąpiła walidacja w odpowiednim systemie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie frakcji HeLa-S3 ekstrahowanych solą jądrową i związanych z chromatyną

  1. Zbieranie komórek
    1. Hoduj HeLa-S3 Flag-HA-MyoD i HeLa-S3 Flag-HA (kontrolna linia komórkowa) w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (pożywka wzrostowa) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
      Uwaga: Komórki HeLa-S3 stabilnie eksprymujące Flag-HA-MyoD i komórki HeLa-S3 transdukowane pustym wektorem (HeLa-S3 Flag-HA) można ustalić za pomocą protokołu opisanego w: 19,20 lub dostarczonego przez autorów.
    2. Amplifikuj komórki do 10 w pełni zlewających się 150 mm szalek każdej linii komórkowej (komórki HeLa-S3 Flag-HA-MyoD i HeLa-S3 Flag-HA).
    3. Zebrać supernatant (zawierający subpopulację nieprzylegającą) do 5-litrowej przędzarki.
    4. Przemyć przylegającą subpopulację 10 ml PBS na 150 mm naczynia, trypsynizować komórki przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (0,05% roztwór trypsyny-EDTA, 2 ml na naczynie 15 cm).
    5. Dodać 4 ml pożywki na naczynie o średnicy 150 mm i zebrać komórki do probówek o pojemności 50 ml.
    6. Połączyć supernatant z etapu 1.1.3 (w 5-litrowym wirówce) i komórki z etapu 1.1.5, dodać 500 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej dla każdej linii komórkowej.
    7. Przenieść zawiesinę komórek do 5-litrowej przędzarki i hodować komórki przez co najmniej 60 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
    8. Dodaj 500 ml świeżej pożywki i hoduj komórki przez 24 godziny.
    9. Dodaj 1 l świeżej pożywki i hoduj komórki przez 24 godziny.
    10. Pobrać 1 ml zawiesiny komórek, aby policzyć komórki i sprawdzić ich żywotność. Pokoloruj 30 μl zawiesiny komórek 30 μl 0,4% błękitu trypanowego i policz żywe (nie niebieskie) komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.
    11. Utrzymuj gęstość komórek na poziomie 2 - 6 x 105 komórek/ml, dodając codziennie świeżą pożywkę wzrostową; nie przekraczaj 1 x 106 komórek/ml. Maksymalna objętość jednej błystki obrotowej o pojemności 5 l wynosi 2,5 l.
      Uwaga: W przypadku kolejnych kroków należy postępować partiami po 2 - 2,5 l kultury o gęstości 1 x 106 komórek/ml. Powtórz kroki 1.1.12 - 1.1.14, aby zebrać około 20 l (≈ 20 g suchego osadu) każdej linii komórkowej przed przejściem do następnego kroku.
    12. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    13. Zawiesić komórki w 100 ml lodowatego PBS za pomocą pipetowania i odwirowywać przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu przepłukania osadu.
    14. Powtórzyć płukanie, ponownie zawieszając komórki 25 ml lodowatego PBS, przenosząc zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml i odwirowując przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Granulki komórkowe można zużyć natychmiast lub zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka dni.
  2. Izolacja jąder
    Uwaga: Wykonaj kroki 1.2.1 - 1.4.3 w chłodni.
    1. i homogenizatory do wstępnego schładzania.
    2. W przypadku użycia zamrożonego materiału należy szybko rozmrozić granulki komórek w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    3. Zawiesić 20 g (≈ 20 ml) komórek w 20 ml (objętość równa wielkości osadu komórkowego) hipotonicznego buforu A (Tabela 3), używając najpierw 10 ml buforu, następnie dodając 5 ml, a następnie dodając kolejne 5 ml. Dobrze umyj pipety świeżym buforem, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek.
    4. Przenieść 40 ml zawiesiny komórkowej do wstępnie schłodzonego homogenizatora za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka.
    5. Homogenizować komórki za pomocą 20 pociągnięć w homogenizatorze (20 ruchów do wewnątrz i na zewnątrz) i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.
    6. Przemyć homogenizator 7 ml buforu sacharozy (1/3 początkowej objętości komórek, tabela 3) w celu odzyskania maksymalnej liczby komórek. Zawiesinę należy szybko przenieść do probówki o pojemności 50 ml z kroku 1.2.5, aby zachować jądra i ograniczyć przeciekanie.
    7. Wybarwić 30 μl podwielokrotności 30 μl 0,4% błękitu trypanowego, przeanalizować pod mikroskopem, aby kontrolować wydajność lizy (jeśli liza się powiedzie, wszystkie jądra powinny być niebieskie). W razie potrzeby powtórzyć etap homogenizacji.
    8. Wirować przez 7 minut przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder. Zachowaj supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną.
  3. Przygotowanie frakcji ekstrahowanej solą jądrową (SE)
    1. Zawiesić osad jądra w 8 ml buforu sacharozy (objętość równa wielkości osadu jądra). Dodawać kropla po kropli, dokładnie mieszając w wirze 8 ml buforu o wysokiej zawartości soli (objętość 1 jądra osadu, Tabela 3), aby uzyskać końcowe stężenie 300 mM NaCl. Inkubować przez 30 minut na lodzie i mieszać co 5 minut.
    2. Zmniejszyć stężenie NaCl do 150 mM, dodając 8 ml (1/3 całkowitej objętości) buforu sacharozy. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant (frakcja ekstrahowana solą jądrową, SE).
      Uwaga: Albo przejść do kroku 1.3.3, albo pozostawić frakcję SE na lodzie podczas przygotowywania frakcji związanej z chromatyną, a następnie ultraodwirować obie frakcje jednocześnie.
    3. Ultrawirówka SE przez 30 minut przy 85 000 x g w temperaturze 4 °C. Weź supernatant (≈ 26 ml).
    4. Zamrozić 100 μl podwielokrotności w ciekłym azocie. Przejdź do kroku 2 "Oczyszczanie kompleksu białkowego", używając reszty ekstraktu.
      Uwaga: Podwielokrotność ma być używana jako kontrolka wejściowa w kroku 5.1.1.
  4. Przygotowanie frakcji związanej z chromatyną
    1. Zawiesić osad (z kroku 1.3.5) skrupulatnie w 7 ml (objętość równa wielkości osadu) buforu sacharozy.
    2. Dodać CaCl2 do końcowego stężenia 1 mM (28 μl z 0,5 M CaCl2 na 14 ml zawiesiny) w celu aktywacji MNazy (etap 1.4.4) i wymieszać.
    3. Podgrzewać zawiesinę przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
    4. Dodać 70 μl nukleazy mikrokokowej (MNazy), aby uzyskać końcowe stężenie 0,0025 U/μl (rozcieńczenie 1/200 z 0,5 U/μl bulionu) i wymieszać.
    5. Inkubować dokładnie 12 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać co 4 minuty.
    6. Natychmiast umieść reakcję na lodzie.
    7. Aby zatrzymać aktywność MNazy, dodaj 112 μl 0,5 M EDTA pH 8,0 (rozcieńczenie 1/125) do końcowego stężenia 4 mM. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
    8. Sonikuj 5 razy przez 1 minutę przy dużej amplitudzie, pomiędzy dwoma sonami pozwól na przerwę trwającą 1 minutę (łącznie 10 minut).
    9. Ultrawirować przez 30 minut przy 85 000 x g i 4 °C.
    10. Zebrać supernatant (frakcja wzbogacona w nukleosomy, NE, ≈ 12 ml).
    11. Zamrozić 50 μl podwielokrotności w ciekłym azocie. Przejdź do kroku 2 "Oczyszczanie kompleksu białkowego", używając reszty ekstraktu.
      Uwaga: Podwielokrotność ma być używana jako kontrolka wejściowa w kroku 5.1.1.

2. Oczyszczanie kompleksów białkowych

Uwaga: Postępuj równolegle z ekstrakcjami z każdej linii komórkowej (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD i kontrolnej, HeLa-S3 Flag-HA).

  1. Oczyszczanie oparte na flagach
    1. Żywica flagowa do mycia wstępnego. Użyj 600 μl żywicy Flag (z komercyjnego zapasu 50%) dla każdego punktu doświadczalnego (frakcje SE i NE dla każdej linii komórkowej).
    2. Przenieść żywicę do probówki o pojemności 15 ml, zawiesić w 13 ml zimnego TEGN (Tabela 3), odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g i usunąć supernatant. Powtórz 5 razy. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić żywicę Flag do równej objętości TEGN (300 μl na każdy punkt doświadczalny).
    3. Dla każdego punktu doświadczalnego wymieszać 600 μl przemytej żywicy Flag i odpowiednich ekstraktów białkowych (odpowiednio w probówce o pojemności 15 ml dla frakcji 12 ml NE i w probówce o pojemności 50 ml dla frakcji SE o pojemności 26 ml). Inkubować na obracającym się kole przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C, odłożyć supernatant i utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania wyniku badania skuteczności oczyszczania (2.2).
    5. W przypadku próbek SE należy ponownie zawiesić żywicę Flag w 4 ml TEGN i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Powtórz ten krok 3 razy, za każdym razem przenosząc do tej samej probówki o pojemności 15 ml, aby uniknąć utraty kulek. Odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g i temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    6. Żywicę Flag przemyć 7 razy w probówce o pojemności 15 ml przy użyciu 13 ml TEGN i odwirować przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C.
    7. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić w 1 ml TEGN i przenieść do 1,5 ml probówki o niskiej wiązalności. Odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g i temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    8. Zawiesić ponownie w 200 μl roztworu peptydu Flag o stężeniu 4 mg/ml i pH 7,8 dla każdego punktu doświadczalnego. Wymieszaj koraliki i peptyd. Dodać 200 μl buforu TEGN i inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny lub przez noc w celu wymycia związanych białek.
    9. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść żywicę i supernatant (eluat flagowy) do pustej kolumny wirowej umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml.
    10. Odwirować kolumnę, zebrać resztki supernatantu do probówki o pojemności 2 ml.
    11. Zebrać żywicę Flag, dodając bufor TEGN do kolumny i przejść do drugiej elucji Flag za pomocą 200 μl roztworu peptydu Flag (4 mg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C dla każdego punktu doświadczalnego.
    12. Powtórz kroki 2.1.9 - 2.1.10, aby zebrać drugą elucję. Połącz pierwsze i drugie eluaty.
  2. Test skuteczności oczyszczania
    Uwaga: W kroku 2.1.11 - 2.1.12 wykonaj SDS-PAGE i barwienie srebrem (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Pobrać 15 μl eluatów, dodać 5 μl 4x buforu ładującego i 2 μl 10x środka redukującego, gotować przez 5 min w temperaturze 96 °C i uruchomić żel SDS-poliakryloamid 4 - 12% zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Zabejcuj żel za pomocą zestawu do barwienia srebra (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta). Jeśli istnieją wyraźne różnice we wzorcach białek między eluatami Flag-HA-MyoD i Flag-HA, w szczególności pasmem Flag-HA MyoD (około 50 kDa, ryc. 1A), przejdź do następnego kroku.
  3. Oczyszczanie na bazie hemaglutyniny (HA)
    1. Przemyć żywicę HA, przenosząc ją do probówki o pojemności 15 ml, ponownie wlej do 13 ml TEGN i odwiruj przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap mycia 5 razy. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić koraliki w równej objętości bufora TEGN.
      Uwaga: Objętość należy dostosować do skuteczności oczyszczania opartego na fladze. Zacznij od 300 μl z komercyjnego zapasu 50% na każdy punkt doświadczalny.
    2. Przenieś żywicę HA dla każdego punktu doświadczalnego do 1,5 ml probówki o niskim stopniu wiązania. Odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć maksimum buforu płuczącego (tabela 3) i dodać eluaty z oczyszczania na bazie flagi do żywicy HA.
    3. Inkubować probówki na obracającym się kole przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C, odłożyć supernatant i utrzymywać w temperaturze 4 °C aż do uzyskania wyniku badania skuteczności oczyszczania (2.3.12).
    5. Zawiesić żywicę HA w 0,5 ml TEGN, przenieść do nowej probówki o niskim stopniu wiązania 1,5 ml. Powtórzyć ponowne zawieszenie, dodając do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć utraty kulek i odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g i 4 °C. Usunąć supernatant.
    6. Umyć kulki 8 razy, używając za każdym razem 1 ml TEGN, odwirować przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g i 4 °C i usunąć supernatant (unikać utraty kulek). Po ostatnim praniu przenieś koraliki do tubek o pojemności 0,5 ml.
    7. Usunąć jak najwięcej supernatantu. Dodać 100 μl roztworu peptydu wolnego od HA (4 mg/ml) o pH 7,8 na kulkach, aby wymyć związane białka. Inkubować na obracającym się kole przez noc w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Ilość peptydu HA należy dostosować w zależności od obfitości kompleksów.
    8. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść żywicę i supernatant (eluat HA) do pustej kolumny wirowej umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml.
    9. Odwirować kolumnę w celu zebrania pozostałości supernatantu w probówce o pojemności 2 ml.
    10. Przeprowadzić drugą elucję za pomocą 100 μl peptydu HA (4 mg/ml) dla każdego punktu doświadczalnego. Inkubować na obracającym się kole przez noc w temperaturze 4 °C. Powtórzyć krok 2.3.8-2.3.9 w celu zebrania drugiej elucji.
    11. Połącz pierwsze i drugie eluaty.
    12. Przetestuj skuteczność oczyszczania za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem (patrz kroki 2.2.) (Rysunek 1A).
    13. Zagęścić eluat HA do 30 μl za pomocą odśrodkowych jednostek filtracyjnych z punktem odcięcia 10 kDa (nominalna masa cząsteczkowa, NMWL) zgodnie z instrukcjami producenta.
    14. Podzielić zagęszczone próbki na dwie części: 22,5 (3/4) i 7,5 (1/4) μl. Błyskawicznie zamrozić 1/4 próbek w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Dla kroku 3.
      należy użyć części 3/4 Uwaga: Część zamrożona w stężeniu 1/4 ma być używana do potwierdzania wyników spektrometrii mas za pomocą western blot (patrz krok 5.1).

3. Analiza spektrometrii mas

Uwaga: Następujące kroki powinny być omówione z ośrodkiem Spektrometrii Mas, który przeprowadzi analizę.

  1. Uzupełnić 3/4 (22,5 μl) próbek 7,5 μl 4x buforu ładującego i 3,3 μl 10x środka redukującego i gotować przez 5 minut w temperaturze 96 °C.
  2. Załaduj próbki na żel SDS z poliakryloamidu 4 - 12%. Uruchom żel przy stałym napięciu 150 V przez 5 minut, aby wszystkie białka mogły dostać się do żelu bez separacji.
  3. Umyj żel wodą; utrwalaj przez 20 - 30 minut roztworem utrwalającym (10% kwasu octowego, 50% metanolu, 40% ultra czystej wody), a następnie umyj utrwalony żel 5 razy w ultra czystej wodzie.
  4. Przeciąć pasma zawierające białka, umieścić w 1 ml wody w probówce o pojemności 1,5 ml i wysłać do zakładu spektrometrii mas.

4. Analiza danych

Uwaga: To jest ogólne wytyczne do analizy. Dokładne kroki będą zależeć od konkretnego trybu danych podanych przez obiekt MS wykorzystany do przeprowadzenia analizy (np. 21,22).

  1. Porównać wykaz zidentyfikowanych białek w eluatach "MyoD" z wykazem otrzymanym z odpowiedniego preparatu kontroli ujemnej. Wyłączyć z analizy białka znajdujące się w obu wykazach.
  2. Usuń białka, które mają ≤2 całkowitą liczbę zidentyfikowanych peptydów z pozostałej listy.
  3. Uzyskaj dostęp do adnotacji funkcjonalnej i klasyfikacji funkcjonalnej uzyskanej listy białek za pomocą DAVID Bioinformatics Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) i sklasyfikuj listę białek23,24.
  4. (Opcjonalnie) Usunąć z listy "autostopowiczów", naładowane białka niejądrowe z silnym przypadkowym wiązaniem z ujemnie naładowanym DNA25. Zawierają one białka cytoszkieletowe, cytoplazmatyczne, mitochondrialne, błonowe i receptorowe (białka fałdowane, cytoszkieletowe i różne białka z grupy w tabelach 1 i 2).
  5. Porównaj uzyskane listy interaktorów MyoD z frakcji SE i NE, aby zidentyfikować wspólne białka i białka specyficzne dla każdej frakcji (ryc. 2).

5. Potwierdzenie zidentyfikowanych interaktorów przez Western Blot

  1. Potwierdzenie w HeLa-S3 Flag-HA-MyoD i HeLa-S3 Flag-HA
    1. Próbki otrzymane na etapie 2.3.14 (7,5 μl) rozmrozić na lodzie. Dodać 12 μl buforu TEGN, 10 μl 4x buforu ładującego i 3 μl 10x środka redukującego. Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 96 °C.
    2. Przygotuj próbki wejściowe do western blot.
      1. Rozmrozić podwielokrotności z kroków 1.3.9 i 1.4.11 i zmierzyć stężenie białka, na przykład za pomocą zestawu BCA (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).
      2. Użyj 15 μg białka na pas. Odmierzyć odpowiednią ilość ekstraktu i dostosować objętość próbki do 15 μl za pomocą buforu TEGN.
      3. Dodać 5 μl 4x bufora ładującego i 1,5 μl 10x środka redukującego. Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 96 °C.
    3. Przeprowadzić analizę western blot z przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania (specyficznymi dla kandydata na partnera zidentyfikowanego podczas analizy SM) przy użyciu 15 μl próbek eluatu. Użyj ekstraktów wejściowych jako kontroli poziomów białek endogennych (ryc. 3A).
  2. Potwierdzenie w odpowiednim systemie komórkowym
    1. Przygotowanie całkowitego ekstraktu jądrowego mysich mioblastów C2C12.
      1. Hoduj mysie mioblasty C2C12 w pożywce DMEM uzupełnionej 15% płodową surowicą cielęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. Nigdy nie przekraczaj 80% konfluencji komórek, aby utrzymać komórki w stanie proliferacyjnym.
      2. Hodować co najmniej dwie 150-milimetrowe szalki C2C12 dla jednego punktu (jednego przeciwciała) immunoprecypitacji (IP). Odessać pożywkę, przemyć komórki dwukrotnie 10 ml PBS.
      3. Zeskrob komórki i zbierz do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      4. Oszacuj objętość osadu komórkowego (=ogniwo V). Delikatnie ponownie zawiesić osad w 3 objętościach Vkomórki hipotonicznego buforu B, aby rozbić błonę cytoplazmatyczną (Tabela 3).
      5. Dodać 0,44 x objętośćkomórki V 10% NP-40, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% (v/v). Delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.
      6. Dodać 0,89 x objętośćkomórki V SR (Tabela 3), aby zachować integralność jąder. Delikatnie odwrócić probówkę kilka razy w celu homogenizacji zawiesiny i odwirować przez 5 minut przy 2,000 x g do osadzania jąder.
      7. Usunąć supernatant (frakcję cytozolową). Oszacuj objętość osadu jądrowego (=V nuc). Zawiesić osad jąder w jednym objętości Vnuc buforu sacharozy.
      8. Dodawać kropla po kropli, dokładnie mieszając na wirze jedenobjętość V buforu o wysokiej zawartości soli, aby uzyskać końcowe stężenie 300 mM NaCl i inkubować przez 30 minut na lodzie. Mieszaj co 5 minut.
      9. Dodać jedenobjętość V nuc buforu sacharozy (w celu zmniejszenia stężenia NaCl do 150 mM) i CaCl2 (stężenie końcowe 1 mM). Mieszać.
      10. Podgrzewać zawiesinę przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, dodać nukleazę mikrokokową, aby uzyskać końcowe stężenie 0,0025 U/μl (1/200 z zapasu 0,5 U/μl). Mieszać.
      11. Inkubować dokładnie 12 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać co 3 minuty.
      12. Natychmiast umieść reakcję na lodzie i dodaj EDTA (stężenie końcowe 4 mM), aby zatrzymać aktywność MNazy. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
      13. Sonikuj 5 razy przez 0,5 minuty każdy przy dużej amplitudzie. Pomiędzy dwoma sonikami należy pozostawić przerwę 0,5 minuty (łącznie 5 minut).
      14. Ultra-wirować przez 30 minut w temperaturze 85 000 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant (całkowity ekstrakt jądrowy).
      15. Zmierzyć stężenie białka w całkowitym ekstrakcie jądrowym, na przykład za pomocą zestawu BCA (postępować zgodnie z instrukcjami producenta) i natychmiast przejść do kroku 5.2.2.
    2. Immunoprecypitacja (IP) endogennego MyoD.
      1. Aby wstępnie oczyścić ekstrakty, przemyj 10 μl kulek agarozy białka G dla każdego punktu IP.
        1. Przenieść potrzebną objętość kulek agarozy białka G do probówki o pojemności 1,5 ml, ponownie zawiesić w 1,4 ml zimnego TEGN, odwirować przez 2 minuty przy 1 800 x g i usunąć supernatant. Powtórz 3 razy.
      2. Wymieszaj wstępnie umyte kulki agarozy białkowej G z odpowiednią objętością całkowitego ekstraktu jądrowego. Użyj 500 μg całkowitego białka ekstraktu jądrowego na punkt IP.
      3. Inkubować na obracającym się kole w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w celu wstępnego oczyszczenia ekstraktów.
      4. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 800 x g w temperaturze 4 °C. Przechowywać w stanie supernatantu.
      5. Wymieszać 5 μg MyoD Ab lub 5 μg króliczej IgG z 500 μg wstępnie oczyszczonych całkowitych ekstraktów jądrowych w 1,5 ml probówkach o niskim stopniu wiązania. Dodać bufor TEGN do 1 ml. Inkubować na obracającym się kole w temperaturze 4 °C przez noc.
        Uwaga: W kroku 5.2.2.3 wykonaj następujące czynności.
      6. Mycie wstępne 7,5 μl roztworu kulek białkowych A/G na punkt IP.
        1. Przenieść potrzebną objętość kulek do probówki o pojemności 1,5 ml, ponownie zawiesić kulki w 1 ml TEGN i odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. Usunąć supernatant. Powtórz 3 razy.
      7. Zawiesić kulki białkowe A/G w 1,5 ml roztworu blokującego (Tabela 3) i inkubować na obracającym się kole przez noc w temperaturze 4 °C.
      8. Odwirować całkowite ekstrakty jądrowe inkubowane z Abs (etap 5.2.2.5) w temperaturze 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant.
      9. Odwirować żywicę białkową A/G (etap 5.2.2.7) w temperaturze 1 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić ponownie w 1 ml buforu TEGN. Ponownie odwirować przy 1 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu wypłukania buforu blokującego.
      10. Zawiesić zablokowaną żywicę białkową A/G w 1 ml buforu TEGN i podwielokrotnić do nowych probówek o niskim poziomie wiązania białek, aby uzyskać 7,5 μl zablokowanej żywicy białkowej A/G na punkt IP. Wirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty i usunąć jak najwięcej supernatantu.
      11. Dodać całkowite ekstrakty jądrowe inkubowane z Abs (lub kontrolną IgG) do żywicy A/G. Mieszać i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na obracającym się kole.
      12. Odwirować zawiesinę 1 800 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml buforu do przemywania i przenieść zawiesinę do nowych probówek o niskiej zawartości wiązania. Inkubować w temperaturze pokojowej na obracającym się kole przez 5 minut.
      13. Odwirować zawiesinę w temperaturze 1 800 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, ponownie zawiesić w 1 ml buforu do przemywania i inkubować w temperaturze suchej przeróbki na obracającym się kole przez 5 minut. Powtórzyć 4 razy. Do ostatniego prania przełóż do nowej rurki o niskim wiązaniu.
      14. Usunąć maksimum supernatantu. Do kulek dodać 7 μl buforu do płukania, 7 μl 4x buforu ładującego i 3 μl 10x środka redukującego, wymieszać i gotować przez 5 minut w temperaturze 96 °C.
      15. Wykonaj analizę western blot z interesującymi przeciwciałami (specyficznymi dla kandydata na partnera dla białka wytrąconego immunologicznie). Użyj 1% (5 μg) ekstraktów wejściowych jako kontroli poziomu endogennego białka (ryc. 3B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć regulację aktywności MyoD, przeprowadziliśmy wyczerpującą charakterystykę kompleksów MyoD za pomocą oczyszczania biochemicznego, opartego na immunooczyszczaniu podwójnie oznaczonej formy MyoD, a następnie spektrometrii mas (MS). Zastosowanie linii komórkowej HeLa-S3 eksprymującej MyoD znakowanego Flag-HA oraz kontrolnej linii komórkowej eksprymującej Flag-HA pozwala uzyskać wystarczającą ilość materiału do oczyszczenia kompleksu MyoD poprzez przeprowadzenie oczyszczania Flag...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda pozwala na wyczerpującą identyfikację partnerów czynnika transkrypcyjnego MyoD. Okazało się, że partnerzy MyoD znajdują się w heterologicznym systemie odpornym na różnicowanie indukowane przez MyoD, a mianowicie w komórkach HeLa-S3. Tak więc, z definicji, zidentyfikowani partnerzy MyoD są wszechobecni. Należą do nich ogólne i specyficzne dla sekwencji czynniki transkrypcyjne, enzymy modyfikujące chromatynę, białka przetwarzające RNA, kinazy (tabele 1 i 2). Ponieważ k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium Ait-Si-Ali była wspierana przez Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot i "Kim jestem?" Laboratorium Doskonałości #ANR-11- LABX-0071 finansowane przez rząd francuski w ramach programu "Inwestycje dla przyszłości" prowadzonego przez ANR w ramach grantu #ANR-11-IDEX-0005-01. EB otrzymał wsparcie z grantu INCa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linie komórkowe
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCC CRL-1772
Sprzęt
SpinnerCorning778531
Homogenizator:  Homogenizator dounce Wheaton432-1273 i 432-1271
Mieszadło do błystekBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HemocytometrMarienfeld Superior 640610
Probówki nisko wiążąceSorenson27210
Pusta kolumna wirowaBio-Rad7326204
Odczynniki
SDS-poliakryloamid 4-12%  żelTechnologie życiaNP0336BOX
4x bufor ładowania Technologie życioweNP0007
10x środek redukującyTechnologie życiaNP0004
Zestaw do barwienia srebraLife technologiesA8592
Filtry odśrodkowe, 10KMilliporeUFC501024
Białko G kulki agarozoweSigma-AldrichP4691
Białko A/G  ŻywicaThermo Scientific53132
Żywica flagowa (żel powinowactwa anty-Flag M2-agaroza)Żywica Sigma-AldrichA2220
HA (monoklonalna agaroza anty-HA)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Peptyd bez flagi (DYKDDDDK)Ansynth Service BVNiestandardowa syntezaPonowne zawieszenie do 4 mg/ml w 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Peptyd wolny od HA (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVNiestandardowa syntezaPonowne zawieszenie do 4 mg / ml w 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Zestaw do oznaczania białek na bazie kwasu bicunchoninowego: zestaw BCAThermo Scientific23225
Inhibitory proteazySigma-AldrichS8830
Wzmocniony substrat HRP chemiluminescencji na bazie luminolu (ECL)Technologie życiowe34075
BSASigma-AldrichA9647
DNA nasienia łososia z naciętymi nóżkami (sól sodowa kwasu dezoksyrybonukleinowego z jąder łososia)Sigma-AldrichD1626
Tetrachlorowodorek sperminySigma-AldrichS1141
SpermidynaSigma-AldrichS0266
GlicerolSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS running bufferLife technologiesNP0001
DMEM (wysoki poziom glukozy)Sigma-AldrichD0822Pre-warm  przy 37 ° C przed użyciem
Trypsin-EDTA (0,05% czerwieni fenolowejLife technologies25300-054
SerumGE opieka zdrowotna nauki przyrodnicze PAA A15-102Każda partia surowicy musi być najpierw przebadana na obecność komórek.
Penicylina i Streptomycyna Technologie życiowe15140-122
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Technologie życia15250-061
Woda (sterylnie filtrowana)Sigma-AldrichW3500
Przeciwciała
HA ze szczura (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Do stosowania do western blot
MyoDSanta CruzSC-760Do stosowania do immunoprecypitacji i western blot
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Technologia sygnalizacji komórkowej8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinaSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG MyszSanta CruzSC-2025
IgG KrólikSanta CruzSC-2027
Kozia anty-szczur -HRPSigma-AldrichA9037
Koza anty-królik -HRPSigma-AldrichA6154 
Kozia anty-mysz -HRPSigma-AldrichA4416

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270(2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858(2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MyoD InteractomeTandem Affinity PurificationMass SpectrometrySkeletal Muscle DifferentiationTranscription Factor PartnersCell FractionationFLAG Tag PurificationNuclear Extract AnalysisWestern Blot ValidationProtein Complex Isolation

Related Articles