Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Streszczenie

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół wykrywania miRNA w tkance raka piersi za pomocą hybrydyzacji in situ z sondą LNA (Locked Nucleic Acid) znakowaną digoksygeniną. Sonda została rozpoznana na podstawie przeciwciał fosfatazy alkalicznej anty-DIG, a następnie opracowana przy użyciu substratu fosfatazy alkalicznej wytwarzającego sygnały fluorescencyjne. Tutaj wykorzystaliśmy technikę hybrydyzacji miRNA in situ (MISH) do analizy ekspresji miR-489 w tkankach pacjentów z rakiem piersi. Technika ta może wykryć lokalizację miRNA będącego przedmiotem zainteresowania w poszczególnych próbkach tkanek. Technika ta może być wykorzystana do porównania ekspresji pożądanego miRNA w tkance nowotworowej z ekspresją w sąsiedniej normalnej tkance oraz do identyfikacji specyficznych struktur odpowiedzialnych za ekspresję tego miRNA. Technika ta może być bardzo przydatna w udzielaniu odpowiedzi na niektóre pytania kliniczne, takie jak rola specyficznego miRNA w rozwoju raka. Nasze wyniki wskazują, że komórki nabłonka sutka wyrażają znacznie wyższe poziomy miR-489 niż sąsiednie komórki nowotworowe.

Wprowadzenie

Rak piersi jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych dotykających populację kobiet na całym świecie. Każdego roku na całym świecie odnotowuje się ponad 1,3 miliona przypadków raka piersi^1,2. Chociaż komórki nowotworowe są tradycyjnie uważane za biologicznie jednorodne i wysoce proliferacyjne, stało się oczywiste, że rak piersi jest genetycznie i klinicznie niejednorodny. Oporność na powszechne leki przeciwnowotworowe jest cechą charakterystyczną zaawansowanego raka piersi, prowadząc do śmiertelności u większości pacjentek poprzez ułatwienie progresji raka i przerzutów na odległość³.

MikroRNA (miRNA) to klasa małych cząsteczek RNA o długości około 22 nukleotydów, które regulują ekspresję genów poprzez blokowanie translacji mRNA lub pośredniczenie w degradacji mRNA⁴. Do tej pory u ludzi zidentyfikowano ponad 2000 różnych miRNA, które są powiązane z chorobami u ludzi⁵. Coraz więcej badań wykazało, że miRNA mogą funkcjonować jako onkogeny i supresory nowotworów i często są rozregulowane w nowotworach⁶. miRNA silnie wpływają na całą pierwotną nowopłodność, kontrolując główne regulatory progresji cyklu komórkowego, starzenia się, apoptozy i autofagii, a także ruchliwości komórek nowotworowych, inwazji i przerzutów⁷.

Nieprawidłowa ekspresja miRNA została również powiązana z implikacjami klinicznymi, takimi jak stadium, różnicowanie, rokowanie i odpowiedź na terapię adiuwantową⁸. W szczególności zwiększona ekspresja miR-146 jest skorelowana ze złym rokowaniem u pacjentów z rakiem płuc⁹. Inne badanie wykazało, że utrata ekspresji miRNA-let7b jest związana ze złośliwymi fenotypami, a w konsekwencji ze słabym przeżyciem⁶. Zrozumienie typów komórek i struktur, które wyrażają miRNA, jest ważną częścią zrozumienia mechaniki, poprzez którą zmiany w ekspresji miRNA wpływają na fenotypy komórek i tkanek¹⁰. Niektóre miRNA, które są wydzielane w komórkach zrębu, są pobierane przez komórki nabłonkowe i specyficznie działają na swoje cele. W tym samym duchu miR-212 i miR-132 są wydzielane przez zrąb i regulują interakcje nabłonkowo-zrębowe wymagane do przerostem przewodowym podczas rozwoju gruczołu sutkowego¹¹. Ogólnym celem tego artykułu jest wyjaśnienie szczegółowego protokołu wykrywania ekspresji miRNA w tkankach raka piersi poprzez hybrydyzację miRNA in situ. Zoptymalizowaliśmy wszystkie warunki, aby oznaczyć poziomy ekspresji miRNA-489 w próbkach pacjentów z rakiem piersi. W tym celu w naszym eksperymencie użyliśmy sondy z zablokowanym kwasem nukleinowym (LNA) oznaczonej znakiem DIG. Niektóre z jego nukleotydów miały modyfikację LNA, czyli mostek metylenowy łączący 2' atom tlenu i 4' atom węgla szkieletu rybozy, który utrwala nukleotyd tak, że pozostaje "zablokowany na miejscu" po hybrydyzacji. W rezultacie zhybrydyzowanemu kompleksowi znacznie trudniej jest denaturować^12,13.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Chonnam National University Hwasun Hospital i University of South Carolina. Próbki TMA składające się z raka piersi i dopasowanych do sąsiednich normalnych tkanek piersi zostały dostarczone przez Biobank Szpitala Narodowego Uniwersytetu Chonnam w Hwasun, członka Korea Biobank Network.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotuj 1 l wody wolnej od DNaz i RNaz. Wszystkie roztwory chemiczne należy przygotować przy użyciu wody uzdatnionej przez dietylopirowęglan (DEPC). Potraktuj 1 l wody 500 μl DEPC i inkubuj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Autoklaw wody, aby dezaktywować DEPC.
   Uwaga: Nie wdychać DEPC, ponieważ jest on znany jako rakotwórczy.
2. Przygotuj 1x PBS z 10x PBS przy użyciu uzdatnionej wody DEPC.
3. Przygotować 20x SSC (rozpuść 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu w 800 ml wody, dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 14 N roztworu HCl i dostosuj objętość do 1 L wodą), 4% paraformaldehydu, 95% etanolu, 80% etanolu używając wody uzdatnionej DEPC.
4. Dodać 8 ml trietanoloaminy i 1,05 ml HCl do 590 ml wody uzdatnionej DEPC i dodać 1,5 ml bezwodnika octowego do acetylacji.
5. Przygotować 50 μg/μl proteinazy K w buforze (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 w wodzie uzdatnionej DEPC).
6. Przygotować bufor hybrydyzacyjny składający się z 500 μl formamidu, 250 μl 20x SSC, 100 μl 50x roztworu Denhardta, 12,5 μl t-RNA, 2,5 μl DNA plemników śledzia, 30 μl RVC, 0,02 g odczynnika blokującego i 50 μl wody DEPC. Przygotuj świeże.

2. Skrawki tkanki piersi

1. Wyciąć 5 μm skrawki zatopione w parafinie utrwalonym w formalinie za pomocą mikrotomu i nałożyć sekcję na szkiełko nasadowe¹⁴.
   Uwaga: Użyta tutaj tkanka piersi została wcześniej przygotowana z Korea Biobank Network.

3. Przygotowanie tkanek

1. Usuń parafinę z tkanki, zanurzając szkiełka w słoiku Coplin 2x w świeżym ksylenie na 10 minut każdy i ponownie nawodnij sekcję tkanki przez 5 minut inkubacji w zmniejszających się stężeniach etanolu (100%, 95% i 80%) w ddH₂O. Wykonaj ten krok w dygestorium.
2. Zanurz chusteczkę w wodzie uzdatnionej DEPC na 5 minut. W tym momencie wyznacz granice wokół przekroju tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
3. Utrwal tkankę 4% PFA przez 15 minut, a następnie przemyj PBS.
4. Zanurz chusteczkę w 0,3% Triton X-100/PBS na 10 minut, a następnie przemyj PBS.
5. Inkubować próbkę w 50 μg/μl roztworu proteinazy K przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie inkubować skrawki tkanek z trietanoloaminą i bezwodnikiem octowym przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać PBS. Nie jest wymagane płukanie PBS między leczeniem proteinazą K a leczeniem trietanoloaminą/bezwodnikiem octowym.

4. Hybrydyzacja

1. Dokładnie umyj tkankę i inkubuj wycinek tkanki z buforem hybrydyzacyjnym przez 2 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj 120 μl buforu hybrydyzacyjnego wystarcza do pokrycia wycinka tkanki.
2. Rozcieńczyć sondę LNA znakowaną 5'-DIG do końcowego stężenia 3 pM w 120 μl roztworu hybrydyzacyjnego. Ponieważ stężenie wyjściowe wynosi zwykle 40 ng/μl, dodać 3 μl bulionu do 120 μl buforu hybrydyzacyjnego i inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Inkubować wycinek tkanki za pomocą sondy przez noc w temperaturze 54 °C (Tm) w wilgotnej komorze. Zazwyczaj 120 μl wystarcza na pokrycie jednego odcinka. Stwórz wilgoć za pomocą dwóch mokrych ręczników papierowych. Idealny rozmiar komory to 10 cali na 8 cali.
4. Uwaga: Tm może być różne dla różnych miRNA. 54 °C jest wspomniane dla miR-489.

5. Pranie surowości

1. Myj tkankę 5x SSC przez 7 minut (po etapie hybrydyzacji warunki wolne od RNazy nie są już wymagane).
2. Przemyć wycinek chusteczki 1x SSC przez 7 minut dwa razy w temperaturze 57 °C.
3. Przemyć wycinek tkanki 0,2x SSC przez 7 minut w temperaturze 57 °C.
4. Myć wycinek chusteczki 0,2x SSC przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować wycinek tkanki w PBS przez 10 minut.

6. Blokowanie

1. Inkubować wycinek tkanki z buforem blokującym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w wilgotnej komorze (Aby uzyskać bufor blokujący, dodać 2 ml FBS, 10 μl Tween-20 i 3 μl BSA w 18 m PBS. Przechowywać bufor blokujący w temperaturze 4 °C).

7. Inkubacja i rozwój przeciwciał pierwotnych

1. Rozcieńczyć przeciwciało anty-DIG-AP w stosunku 1:300 w buforze blokującym i inkubować wycinek tkanki z przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc.
2. Przemyć sekcje buforem do płukania 3 razy, po 5 minut każdy (bufor dostarczany przez zestaw rozwojowy).
3. Rozwiń sekcję tkankową za pomocą komercyjnego zestawu do fosfatazy alkalicznej, która wytwarza światło fluorescencyjne CY-3.
4. Przemyć sekcję buforem do przemywania przez 5 minut. Część bejcowania 100 μl 2,5 ng/μl barwnika Hoechst przez 5 minut, a następnie przemyć 5 minut buforem do płukania.
5. Zamontuj sekcję z odbojem montażowym zgodnie z protokołem producenta. Użyj 15 μl na fragment tkanki i przetrzyj nadmiar roztworu montażowego chusteczką higieniczną. Uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci, aby zapobiec przeciekaniu.
6. Obserwuj przekrój mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą soczewki 10X, tak aby całkowite powiększenie wynosiło 100X.

Wyniki

Do oznaczenia ekspresji miRNA-489 wykorzystano ludzką tkankę raka piersi. Stwierdzono, że w przewodach gruczołu mlekowego oraz komórkach nabłonkowych u dwóch pacjentek występuje znacznie wyższy poziom miRNA-489 niż w przyległej tkance nowotworowej (Rysunek 1A i 1B). Wyraźnie pokazuje to, że w tkance nowotworowej utracono ekspresję miRNA-489, co sugeruje aktywność supresorową miRNA-489. Aby dodatkowo potwierdzić te wyniki, porównano tkankę nowotworową z pr...

Dyskusja

Celem tego badania było określenie poziomu ekspresji miRNA w tkankach raka piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ . Należy zauważyć, że w tym eksperymencie wszystkie warunki zostały zoptymalizowane pod kątem tkanki raka piersi. W przypadku innych typów tkanek może być wymagana dalsza optymalizacja. Wszystkie roztwory muszą być wykonane z wodą DEPC, a wszystkie pojemniki, które mają być używane, należy przepłukać wodą uzdatnioną DEPC, a następnie sterylizować w autoklawie. Nawet niewielkie zanieczyszczenie R...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Technologia ELF-97	Life	E6604
50x Denhard't	Technologia życiowa
t-RNA	Roche	109541	Rozpuszcza się w wodzie DEPC
DNA plemników śledzia	Promega	D1815
Roche Blokowanie	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	Przed użyciem odkręć go przy 16.1 RCF i weź supernatant
Sonda miR-489	Exiqon	38599-01
Bez nukleaz BSA	Roche
Przeciwciało pierwotne anty DIG	Roche
Pirowęglan dietylu	Sigma	1609478

75001871145411093274910