Artykuł metodologiczny

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

DOI:

10.3791/53935

⸱

13 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia używane do wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wymagają metod kontrastowania drzew naczyniowych. Film ten zademonstrował delikatną technikę iniekcji zastosowaną w celu uzyskania optymalnego kontrastu drzew naczyniowych i zilustrował potencjalne korzyści wynikające ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmodyfikowana procedura wstrzykiwania silikonu została użyta do wizualizacji drzewa naczyniowego wątroby. Procedura ta polegała na wstrzyknięciu in vivo związku silikonowego za pomocą cewnika 26 G do żyły wrotnej lub wątrobowej. Po wstrzyknięciu silikonu narządy poddano eksplantacji i przygotowano do badania ex vivo mikro-CT (μCT). Procedura wstrzykiwania silikonu jest technicznie trudna. Osiągnięcie pomyślnego wyniku wymaga dużego doświadczenia mikrochirurgicznego ze strony chirurga. Jednym z wyzwań tej procedury jest określenie odpowiedniej szybkości perfuzji dla związku silikonowego. Szybkość perfuzji związku silikonowego należy określić na podstawie hemodynamiki układu naczyniowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Niewłaściwa szybkość perfuzji może prowadzić do niepełnej perfuzji, sztucznego rozszerzenia i pękania drzew naczyniowych.

Rekonstrukcja 3D układu naczyniowego opierała się na skanach tomografii komputerowej i została zrealizowana przy użyciu oprogramowania przedklinicznego, takiego jak HepaVision. Jakość zrekonstruowanego drzewa naczyniowego była bezpośrednio związana z jakością perfuzji silikonu. Następnie obliczono parametry naczyniowe wskazujące na wzrost naczyń, takie jak całkowita objętość naczyń, na podstawie rekonstrukcji naczyniowych. Kontrastowanie drzewa naczyniowego z silikonem pozwoliło na późniejsze badanie histologiczne próbki po skanowaniu μCT. Próbka może być poddana seryjnemu cięciu, analizie histologicznej i skanowaniu całego preparatu, a następnie rekonstrukcji 3D drzew naczyniowych na podstawie obrazów histologicznych. Jest to warunek wstępny do wykrycia zdarzeń molekularnych i ich rozkładu względem drzewa naczyniowego. Ta zmodyfikowana procedura wstrzykiwania silikonu może być również wykorzystana do wizualizacji i rekonstrukcji układów naczyniowych innych narządów. Technika ta może być szeroko stosowana w badaniach dotyczących anatomii i wzrostu naczyń krwionośnych w różnych modelach zwierzęcych i chorobowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regeneracja wątroby jest często określana poprzez pomiar wzrostu masy i objętości wątroby oraz poprzez ocenę szybkości proliferacji hepatocytów16. Jednak regeneracja wątroby to nie tylko regeneracja miąższu, ale także regeneracja naczyńkrwionośnych 6. W związku z tym wzrost naczyń krwionośnych powinien być dalej badany pod kątem jego roli w postępie regeneracji wątroby. Wizualizacja układu naczyniowego wątroby ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat regeneracji naczyń krwionośnych. Opracowano wiele metod pośrednich w celu zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji naczyń krwionośnych wątroby. Tradycyjnie, wykrywanie cytokin (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, VEGF)14, chemokin i ich receptorów (CXCR4/CXCR7/CXCL12)4 było podstawą badania regeneracji naczyń krwionośnych. Jednak model 3D wraz z analizą ilościową układu naczyniowego dodałby krytycznych informacji anatomicznych, aby lepiej zrozumieć ważny związek między regeneracją miąższu wątroby a regeneracją naczyń.

Aby zobrazować układ naczyniowy wątroby, który wymaga kontrastowania drzew naczyniowych, myszom wstrzyknięto środek kontrastowy z kauczuku silikonowego nieprzepuszczającego promieniowania rentgenowskiego bezpośrednio do portalu lub drzewa naczyniowego żyły wątrobowej. Po polimeryzacji silikonu i eksplantacji narządu, próbki wątroby poddano skanowaniu μCT za pomocą tomografu komputerowego. Skany zaowocowały reprezentacjami obrazu woksela próbek do wstrzykiwania silikonu9.

Dla kontroli jakości, układ naczyniowy został najpierw zobrazowany w 3D za pomocą oprogramowania przedklinicznego. Segmentację przeprowadzono poprzez ustawienie progu między intensywnością tkanek miękkich a intensywnością naczynia. Powstała maska naczynia została zobrazowana za pomocą renderingu powierzchniowego. Oprogramowanie pozwoliło również na ręczne wyznaczenie dwóch parametrów wzrostu naczyń krwionośnych: maksymalnej długości naczynia i promienia.

Przedkliniczne oprogramowanie zostało następnie użyte do rekonstrukcji 3D drzew naczyniowych i późniejszego obliczenia obszarów naczyniowych zasilających lub odprowadzających wodę13. Ponadto oprogramowanie to automatycznie określało pewne parametry wzrostu naczyń krwionośnych, takie jak całkowita długość wszystkich widocznych struktur naczyniowych, znana również jako całkowita długość krawędzi lub całkowita objętość naczynia.

Procedura perfuzji silikonu została przeprowadzona u myszy wcześniej nieleczonych oraz u myszy, które przeszły 70% częściowej hepatektomii (PH). Wątroby pobrano w różnych punktach obserwacyjnych po resekcji w celu analizy regeneracji wątroby naczyniowej i miąższowej przy użyciu wspomnianej techniki wizualizacji i kwantyfikacji.

Główne cele tego filmu to: (1) zademonstrowanie delikatnej techniki iniekcji wymaganej do uzyskania optymalnego kontrastu oraz (2) pokazanie potencjalnych korzyści wynikających ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych. Po obejrzeniu tego filmu czytelnik powinien lepiej zrozumieć, jak wstrzykiwać związek silikonowy do określonego układu naczyniowego oraz o użyteczności i możliwości zastosowania tej techniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Niemcy. Ponieważ układ żyły wrotnej był wizualizowany oddzielnie od układu żylnego wątroby, potrzebne były oddzielne zwierzęta dla różnych drzew naczyniowych.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Roztwór soli fizjologicznej heparyny
    1. Dodać 0,1 ml heparyny do 10 ml soli fizjologicznej (5 j.m./ml).
  2. Mieszanina związków silikonowych
    1. Dodaj 2 ml MV-120 do jednej probówki o pojemności 5 ml. Rozcieńczyć MV-120, dodając 3 ml rozcieńczalnika MV, dając 40% roztwór.

2. Wstrzyknięcie silikonu do układu żylnego portalu

  1. laparotomia
    1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i znieczul ją 2% izofluranem i 0,3 l/min tlenu.
    2. Przymocuj znieczuloną mysz na stole operacyjnym za pomocą taśmy z ciągłym wdychaniem 2% izofluranu i 0,3 l/min tlenu. Sprawdź odruch wycofania palca u myszy i rozpocznij pracę, jeśli odruch ten jest nieobecny.
    3. Wykonaj poprzeczne nacięcie na brzuchu za pomocą nożyczek do warstwy skóry i koagulatora elektrycznego do warstwy mięśniowej. Odsuń jelita na lewą stronę za pomocą bawełnianych końcówek i przykryj jelita gazą nasączoną solą fizjologiczną.
  2. Wprowadzenie cewnika
    1. Wypreparuj żyłę wrotną pod mikroskopem za pomocą mikrokleszczy. Umieść jeden jedwabny szew 6-0 pod żyłą wrotną zewnątrzwątrobową, w odległości około 1 mm od jej rozwidlenia i zawiąż luźno do późniejszego użycia.
    2. Przygotowany roztwór heparyny i soli fizjologicznej wstrzyknąć przez żyłę prącia (męska) lub żyłę główną dolną (żeńska) w celu heparynizacji ogólnoustrojowej przez 5 minut.
    3. Wprowadzić cewnik o rozmiarze 26 (26 G) z igłą do żyły wrotnej i zamocować go za pomocą zacisku
  3. Roztwór heparyny i soli fizjologicznej oraz perfuzja związków silikonowych
    1. Załadować roztwór heparyny i soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 5 ml i włączyć urządzenie do perfuzji. Całkowicie napełnij cewnik roztworem soli fizjologicznej heparyny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
    2. Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika i mocno je zamocuj. Perfuzję heparyny z solą fizjologiczną należy rozpocząć z szybkością perfuzji 0,4 ml/min.
    3. Wstępnie założony szew jedwabny Ligate 6-0 do podwójnego mocowania cewnika i blokowania przepływu krwi z żyły śledziony i żyły krezkowej. Eutanazja myszy przez wykrwawienie przez perfuzję w znieczuleniu.
    4. Podczas całej procedury perfuzji płucz wątrobę solą fizjologiczną, aby była wilgotna.
    5. Dodaj 0,1 ml utwardzacza do probówki MV-120. Zmień strzykawkę z heparyną i solą fizjologiczną na strzykawkę silikonową.
    6. Rozpocznij perfuzję silikonową z szybkością perfuzji 0,2 ml/min przez około 1 minutę, aby wstępnie napełnić system cewnika i wypełnić system żył wrotnych. Zatrzymaj perfuzję silikonu, gdy naczynia na powierzchni zmienią kolor na niebieski.
  4. pobieranie próbek
    1. Utrzymuj wątrobę na miejscu, aż silikon zostanie w pełni spolimeryzowany po około 15 do 30 minutach. Wypreparuj więzadła łączące wątrobę i sąsiednie narządy, uważając, aby wątroba pozostała nienaruszona. Usuń wątrobę i włóż ją do formaliny w celu utrwalenia.

3. Iniekcja silikonu do układu żylnego wątroby

  1. Wykonaj laparotomię, jak w kroku 2.1 i całkowicie odsłonić pole operacyjne.
  2. Wprowadzenie cewnika
    1. Wypreparuj żyłę wrotną pod mikroskopem za pomocą mikrokleszczy. Umieść jeden jedwabny szew 6-0 pod żyłą wrotną zewnątrzwątrobową, w odległości około 1 mm od jej rozwidlenia i zawiąż luźno do późniejszego użycia.
    2. Przygotowany roztwór heparyny i soli fizjologicznej wstrzyknąć przez żyłę prącia (męska) lub żyłę główną dolną (żeńska) w celu heparynizacji ogólnoustrojowej przez 5 minut.
    3. Wprowadzić jeden cewnik 26 G (cewnik 1) z igłą do żyły wrotnej i zamocować go za pomocą zacisku. Wprowadzić kolejny cewnik 26 G (cewnik 2) z igłą do żyły głównej dolnej i przymocować go za pomocą zacisku.
    4. Podwiązywać gałęzie żyły głównej dolnej (w tym lewą i prawą żyłę nerkową) oraz jej dystalny koniec za pomocą syntetycznego, monofilamentowego, niewchłanialnego szwu polipropylenowego 6-0.
  3. Roztwór heparyny i soli fizjologicznej oraz perfuzja związków silikonowych
    1. Załadować roztwór heparyny i soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 5 ml i włączyć urządzenie do perfuzji. Całkowicie napełnij cewnik 1 roztworem heparyny i soli fizjologicznej, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika 1 i mocno ją zamocuj. Rozpocząć perfuzję heparyny z solą fizjologiczną z szybkością 0,4 ml/min.
    2. Wstępnie założony szew jedwabny Ligate 6-0 do podwójnego mocowania cewnika i blokowania przepływu krwi z żyły śledziony i żyły krezkowej. Eutanazja myszy przez wykrwawienie przez perfuzję w znieczuleniu.
    3. Podczas całej procedury perfuzji płucz wątrobę solą fizjologiczną, aby była wilgotna. Dodaj 0,1 ml utwardzacza do probówki MV-120. Zamień strzykawkę z heparyną i solą fizjologiczną na strzykawkę silikonową.
    4. Umieść zacisk na żyle głównej nadwątrobowej dolnej, aby zablokować odpływ wątroby.
    5. Podłączyć rurkę przedłużającą do cewnika 2 i rozpocząć perfuzję silikonową z szybkością perfuzji 0,2 ml/min przez około 2 minuty, aby osiągnąć obiektywną objętość naczyniową wątroby, zgodnie z podano. Zatrzymaj perfuzję silikonu, gdy naczynia na powierzchni zmienią kolor na niebieski.
  4. pobieranie próbek
    1. Przeciąć więzadła wątrobowe, unikając uszkodzenia wątroby. Usuń wątrobę i włóż ją do formaliny w celu utrwalenia.

4. Skanowanie mikro-CT (μCT)

Aby zeskanować pobraną próbkę wątroby za pomocą μCT, potrzebne są następujące kroki.

  1. Wyjąć próbkę wątroby z roztworu utrwalającego. Umieść wątrobę na łożu μCT. Umieścić złoże μCT z próbką wątroby w μCT.
  2. Uzyskaj topogram przed rozpoczęciem skanowania. Użyj jednego skanu cząstkowego dla małej próbki wątroby i dwóch podskanów dla dużych próbek.
  3. Wybierz protokół μCT o wysokiej rozdzielczości (np. HQD-6565-390-90). Protokół ten uzyskuje 720 projekcji o wymiarach 1 032 x 1 012 pikseli podczas jednego pełnego obrotu z czasem skanowania wynoszącym 90 sekund na skanowanie podrzędne. Rozpocznij skanowanie μCT.

5. Histologiczne odcinki seryjne

  1. Osadź próbkę wątroby w parafinie jako całości po skanowaniu μCT. Pokrój całą próbkę parafiny na sekcje 4 μm, uzyskując serię od 2 000 do 2 500 sekcji.
  2. Wybarwiaj skrawki odpowiednią techniką barwienia, aby uwidocznić zdarzenia molekularne będące przedmiotem zainteresowania, takie jak Ki-67 jako marker proliferacji i HMGB1 jako marker uszkodzenia niedokrwiennego. Określ kolejność barwienia w odniesieniu do pytania naukowego.
  3. Użyj całego skanera do slajdów, aby zdigitalizować poplamione sekcje.
  4. Wykonanie rekonstrukcji 3D drzewa (drzew) naczyniowego (już wykonalne) i wizualizacja rozkładu 3D zdarzeń molekularnych w odniesieniu do drzewa naczyniowego (badania w toku).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kryteria jakości

Jakość iniekcji silikonu można ocenić gołym okiem podczas zabiegu. Małe naczynia na powierzchni wątroby stopniowo wypełniają się niebieskim związkiem. Jeśli na powierzchni wątroby zaobserwowano normalną strukturę naczyniową, jakość wtrysku kauczuku silikonowego była dobra. Jeśli objętość perfuzji była niewystarczająca, małe naczynia na powierzchni wątroby nie były w pełni wypełnione. Natomiast n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrastowanie drzewa naczyniowego za pomocą iniekcji silikonu i skanowania μCT zostało często wprowadzone w modelach nowotworów i modelach chorób neurologicznych w celu zbadania progresji angiogennej5,7,8,10. W niniejszym badaniu dokonano ulepszeń w metodologii wstrzykiwania silikonu w celu wizualizacji i ilościowego określenia wzrostu naczyń krwionośnych po częściowej hepatektomii u myszy.

Istnieje kilka krytycznych etapów, na które należy zwrócić uwagę, aby osiągnąć dobrą jakość ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy potwierdzają finansowanie przez niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF) za pośrednictwem sieci biologii systemowej "Wirtualna wątroba", numery grantów 0315743 (ExMI), 0315765 (Wielka Brytania Jena), 0315769 (MEVIS). Autorzy dziękują również Frankowi Schubertowi za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PERFUSOR® VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
PipetyGreiner606180
mikronożyczkiNarzędzia do nauki precyzyjnej (F· S· L)No. 14058-09
micro serrefineFine Science Tools (F· S· L)No.18055-05
Aplikator mikrozaciskówFine Science Tools (F· S· L)No. 18057-14
Proste mikrokleszczeFine Science Tools (F· S· L)No. 00632-11
Zakrzywione mikrokleszczeFine Science Tools (F· S· L)Nr 00649-11
uchwyt na igłęFine Science Tools (F· S· L)No. 12061-01
Strzykawka 1 mlB.Braun9161406V
Strzykawka 5 mlB.Braun4606051V
przedłużacze i przewody połączenioweB.Braun425600030 cm, wewnętrzna i ukośnik; 1,2 mm
6-0 jedwab (Perma-Hand Seide)Ethicon639H
6-0 proleneEthicon8711H
Mikroplik® Rozcieńczalnik MVFLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120FLOW TECH, INCMV - 120 (niebieski)
Utwardzacz MVFLOW TECH, INC
Heparyna 2500 I.E./5 mlRotexmedicaETI3L318-15
SalineFresenius Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics Oprogramowanie przedkliniczneEksperymentalne obrazowanie molekularne, Uniwersytet RWTH w Akwizgranie, Niemcy
HepaVisionFraunhofer MEVIS, Brema, Niemcy
NanoZoomer 2.0-HT  Cyfrowy skaner slajdówHamamatsu Electronic Press, Japonia Tomoskop C9600
Duo CT CT Imaging GmbH, Erlangen, NiemcyTomoScope®   Synergia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Vascular RegenerationHepatectomy ModelSilicone InjectionMicroCT Scanning3D Vascular ReconstructionPortal Vein InjectionHepatic Vein PerfusionWhole Slide ScannerKi 67 MarkerHepaVision Software

Powiązane artykuły