Artykuł metodologiczny

Mysia kończyna tylna Sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego

DOI:

10.3791/53936

⸱

14 kwietnia 2016

 ,  , 
1Department of Urology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji kości długich kończyn tylnych (kości udowych i piszczelowych) od myszy laboratoryjnej. Dalej opisujemy szybką technikę izolacji szpiku kostnego od tych kości, która wykorzystuje wirowanie do usuwania szpiku kostnego z przestrzeni szpiku kostnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania kości i szpiku kostnego są kluczowe w wielu dziedzinach badawczych, w tym w podstawowej biologii kości, immunologii, hematologii, przerzutach raka, biomechanice i biologii komórek macierzystych. Pomimo znaczenia kości w stanach zdrowych i patologicznych, jest to jednak narząd w dużej mierze niedostatecznie zbadany ze względu na brak specjalistycznej wiedzy na temat rozwarstwiania kości i izolacji szpiku kostnego. Myszy są powszechnym organizmem modelowym do badania wpływu na kość i szpik kostny, co wymaga standaryzowanej i wydajnej metody rozwarstwiania długich kości i izolacji szpiku kostnego do przetwarzania dużych kohort eksperymentalnych. Opisujemy prostą procedurę preparacji w celu usunięcia kości udowej i piszczelowej, która jest odpowiednia do dalszych zastosowań, w tym między innymi do analizy histomorfologicznej i testów wytrzymałościowych. Ponadto przedstawiamy szybką procedurę izolacji szpiku kostnego z kości długich poprzez wirowanie z ograniczonym czasem obsługi, idealną do sortowania komórek, pierwotnej hodowli komórek lub ekstrakcji DNA, RNA i białek. Protokół został usprawniony pod kątem szybkiego przetwarzania próbek w celu ograniczenia błędów eksperymentalnych i jest ustandaryzowany w celu zminimalizowania zmienności między użytkownikami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie kości długich i komórek szpiku kostnego jest kluczowe dla niezliczonych dyscyplin badawczych, w tym, ale nie tylko, biologii kości, biologii raka, immunologii, hematologii i biomechaniki. Kość jest bardzo dynamicznym narządem, który wraz z chrząstką tworzy szkielet, zapewniając mechaniczne wsparcie przed obciążeniem i ochronę narządów wewnętrznych. Ponadto składniki mineralne kości są pochłaniaczem dla krytycznych cząsteczek sygnałowych wapnia i fosforu, a także innych czynników1. Wreszcie, w kościach znajduje się szpik kostny i wraz z metabolicznie czynnymi osteoblastami tworzącymi kości i osteoklastami resorbującymi kość, zapewniają niszę komórek macierzystych niezbędną do utrzymania populacji komórek krwiotwórczych i limfatycznych.

Kość i szpik kostny są dotknięte wieloma zaburzeniami, często prowadząc do dysfunkcji szpiku kostnego, silnego bólu kości i patologicznych złamań. Kość jest częstym miejscem przerzutów w wielu guzach litych, w szczególności w raku piersi i raku prostaty, gdzie komórki nowotworowe bezpośrednio angażują się w niszę szpiku kostnego, aby zainicjować błędne koło przerzutów do kości i wyprzeć krwiotwórcze komórki macierzyste2,3. Nowotwory układu krwiotwórczego, w tym szpiczak i białaczka, charakteryzują się dysfunkcją szpiku kostnego, a także deregulacją zdrowej przebudowy kości1. Inne niezłośliwe zaburzenia układu kostnego są również aktywnymi obszarami badań, takimi jak choroba zwyrodnieniowa stawów, osteoporoza, skolioza i krzywica. Nawet u skądinąd zdrowej osoby, awaria biomechaniczna kości prowadzi do bolesnego złamania. Wszystkie te zaburzenia stanowią aktywne obszary badań, których celem jest zidentyfikowanie nowych środków zapobiegawczych i schematów leczenia w celu zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności.

Aby zbadać mnogość ról kości i szpiku kostnego, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, kluczowe dla badaczy jest posiadanie prostej i efektywnej ustandaryzowanej metody preparowania kości długich myszy w celu szybkiego przetwarzania dużych eksperymentów in vivo. Przedstawiony tutaj protokół preparacji jest odpowiedni dla wszystkich analiz kości długich, w tym między innymi obrazowania ex vivo, histologii, histomorfometrii i testów wytrzymałościowych. Podobnie, standaryzowana metoda izolacji szpiku kostnego z wysoką regeneracją komórek szpiku kostnego i niską zmiennością między użytkownikami jest ważna dla analiz eksperymentalnych, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) lub ilościowy PCR (qPCR), a także dla dalszych zastosowań, takich jak pierwotna hodowla komórkowa komórek szpiku kostnego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health.

1. Rozwarstwienie kości długiej kończyny tylnej

  1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj, przypinając wszystkie cztery nogi przez poduszki łap myszy poniżej stawu skokowego.
  3. Spryskaj mysz 70% etanolem, dokładnie oblewając nogi.
  4. Wykonaj małe nacięcie na prawo od linii środkowej w dolnej części brzucha, tuż nad biodrem.
  5. Przedłuż nacięcie w dół nogi i za staw skokowy.
  6. Odciągnij skórę i odetnij mięsień czworogłowy zakotwiczony w bliższym końcu kości udowej, aby odsłonić przednią stronę kości udowej i wysunąć ją z nogi, umieszczając szpilkę pod kątem 45 stopni od deski.
  7. Trzymając ostrze nożyczek przy tylnej stronie kości udowej, odetnij ścięgna podkolanowe od stawu kolanowego.
  8. Odciągnij skórę i mięśnie ścięgien podkolanowych zakotwiczone w bliższym końcu kości udowej, aby odsłonić tylną stronę kości udowej i wysunąć ją z nogi, umieszczając szpilkę pod kątem 45 stopni od deski.
  9. Za pomocą kleszczy przytrzymaj dystalny koniec kości udowej, tuż nad stawem kolanowym. Prowadź ostrza nożyczek po obu stronach trzonu kości udowej w kierunku stawu biodrowego, uważając, aby nie przeciąć samej kości udowej.
  10. Po dotarciu do głowy kości udowej, na co wskazują lekko otwierające się nożyczki, przekręć nożyczki górnym ostrzem nożyczek przesuwając się bezpośrednio nad głową kości udowej, aby zwichnąć kość udową, uważając, aby nie zatrzasnąć kości poniżej głowy kości udowej.
  11. Chwyć szczypce górną część trzonu kości udowej, odetnij tkankę miękką od głowy kości udowej, aby uwolnić ją z panewki.
  12. Pociągnij całą kość nogi, w tym kość udową, kolano i piszczel, do góry i od ciała, ostrożnie odcinając tkankę łączną i mięsień łączący nogę ze skórą.
  13. Nadmiernie rozciągnij staw skokowy i ponownie użyj nożyczek ruchem skręcającym, aby zwichnąć kość piszczelową.
  14. Chwytając dystalny koniec kości piszczelowej, uważając, aby nie zerwać ścięgien, pociągnij kość piszczelową do góry i odsuń ją od ciała i tablicy.
  15. Przetnij pozostałą tkankę łączną łączną łączącą kość długą z myszą w kolanie.
  16. Usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej i piszczelowej.
  17. W przypadku wszelkich zastosowań, które wymagają, aby kość pozostała nienaruszona (histologia, histomorfometria, badania biomechaniczne itp.), postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami wewnętrznymi (jak w 4-7). Aby wyizolować szpik kostny, przejdź do sekcji 2.

2. Przygotowanie kości długiej do izolacji szpiku kostnego

  1. Za pomocą kleszczy chwyć kość udową rzepką skierowaną na zewnątrz i bliższym końcem (głową kości udowej) w dół.
  2. Nadmiernie rozciągnij staw kolanowy i użyj nożyczek ruchem skręcającym, aby zwichnąć kość piszczelową i udową.
  3. Przetnij tkankę łączną trzymającą razem kość udową i piszczelową.
  4. Za pomocą kleszczy chwyć kość udową przednią stroną skierowaną na zewnątrz i bliższym końcem (głową kości udowej) w dół.
  5. Poprowadź nożyczki w górę trzonu kości udowej do kłykci.
  6. Delikatnie obracaj nożyczki do przodu iz powrotem, aby usunąć kłykcie, rzepkę i nasadę, aby odsłonić przysadę.
  7. Usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej za pomocą kleszczy, nożyczek i chusteczek Kimwipe.
  8. Za pomocą kleszczy chwyć kość piszczelową przednią stroną skierowaną na zewnątrz i dystalnym końcem (końcem kostki) w dół.
  9. Jeśli nasada kości piszczelowej jest nienaruszona, poprowadź nożyczki w górę trzonu kości piszczelowej do kłykci.
  10. Delikatnie obracaj nożyczki do przodu iz powrotem, aby usunąć kłykcie i nasadę, aby odsłonić przysadę.
  11. Usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości piszczelowej za pomocą kleszczy, nożyczek i chusteczek Kimwipe.

3. Izolacja szpiku kostnego

  1. Przecisnąć igłę 18 G przez dno probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml.
  2. Umieść kości długie (maksymalnie 2 kości udowe i 2 piszczele) w rurce, kolanem w dół, końcem do dołu i zamknij pokrywę.
  3. Umieść probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować zagnieżdżone probówki o ≥10 000 x g w mikrowirówce przez 15 sekund.
  5. Sprawdzić, czy szpik kostny został wydzielony z kości poprzez oględziny. Kości powinny wydawać się białe, a w większej rurce powinna znajdować się duża wizualna osadka.
  6. Wyrzucić probówkę mikrowirówki o pojemności 0,5 ml z kośćmi.
  7. Zawiesić szpik kostny w odpowiednim roztworze (np. PBS, pożywce hodowlanej, buforze FACS) i postępować zgodnie z protokołem eksperymentalnym (izolacja DNA, RNA lub białka, analiza FACS lub pierwotna hodowla komórkowa).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem szybkiego rozwarstwienia kości udowej i piszczelowej myszy przy minimalnym uszkodzeniu tkanki kostnej. Technika ta jest odpowiednia dla wielu dalszych analiz, w tym badań biomechanicznych, histomorfometrii (ryc. 1A - B) i histologii (ryc. 1C)4,7. Reprezentatywna rekonstrukcja histomofometryczna micoCT 3D (ryc. 1A - B) pokazuje, że zarówno kość gąbczasta, jak i powłoka korowa są zachowane, co pozwala na dokładne określenie ilościowe znormalizowanych parametrów strukturalnych histomorfometrii kości, w tym liczby beleczkowej, grubości i odstępów; objętość kości; i grubość kory mózgowej, między innymi8. Reprezentatywny przekrój histologiczny pokazuje wybarwioną H&E utrwaloną formaliną i odwapnioną piszczel (ryc. 1C). Obraz pokazuje integralność zarówno zwapniałej kości, jak i komórkowego szpiku kostnego do analizy histologicznej.

Procedura izolacji szpiku kostnego zachowuje sterylność przestrzeni szpiku kostnego, jest mało obrabiana w celu zmniejszenia zanieczyszczenia i nie wymaga cięcia kości długiej, zmniejszając w ten sposób utratę wydajności szpiku kostnego. Ten szpik kostny nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym do cytometrii przepływowej5 i analiz PCR. Ponadto procedura ta może być stosowana do izolowania szpiku kostnego w celu pierwotnej hodowli komórek szpiku kostnego, w tym osteoklastów i osteoblastów (ryc. 2A - B)4,6.

figure-results-1
Rysunek 1. Analizy histomorfologiczne i histologiczne kości długiej myszy. Trójwymiarowa rekonstrukcja kości piszczelowej myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej pokazująca (A) zewnętrzną powłokę korową i (B) kość beleczkową (podziałka = 0,5 mm). (C) Histologiczne zabarwienie H&E odwapnionej i pociętej kości piszczelowej (4x). Zdjęcia dzięki uprzejmości Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Pierwotna hodowla komórek szpiku kostnego do różnicowania osteoklastów i osteoblastów. (A) Barwienie TRAP dla wielojądrowych osteoklastów po 7 dniach w pożywkach osteoklastogennych (4x). (B) Fosfataza alkaliczna (kolor fioletowy) dla osteoblastów i czerwone barwienie alizaryny (kolor czerwony) do mineralizacji po 21 dniach w pożywce osteogennej. Zdjęcia dzięki uprzejmości Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy prostą i skuteczną metodę usuwania tylnych kości długich myszy i późniejszej izolacji szpiku kostnego. Metoda ta utrzymuje wysoką integralność strukturalną i komórkową kości i szpiku kostnego oraz skraca czas obsługi, minimalizując prawdopodobieństwo złamań lub nacięć kostnych wywołanych przez użytkownika, które mogą mieć wpływ na dalsze analizy. Ponadto metoda wirowania do izolowania szpiku kostnego nie wymaga cięcia kości w celu odsłonięcia przestrzeni szpiku kostnego lub płynu w celu przepłukania szpiku kostnego, zmniejszając potencjalne punkty zanieczyszczenia. Co więcej, technika wirówki charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością i krótszym czasem pracy niż inne metody, co skraca czas przetwarzania.

Wysoka zmienność jest nieodłącznym elementem badań in vivo na myszach ze względu na dużą zmienność fenotypową między myszami. Aby zmaksymalizować wpływ kosztownych i pracochłonnych badań na myszach, kluczowe znaczenie ma zminimalizowanie technicznego błędu eksperymentalnego9,10. Czas od złożenia zwierzęcia w uśmierceniu do dalszej analizy lub utrwalenia tkanek wprowadza eksperymentalną zmienność, która może przezwyciężyć subtelne zmiany i zmniejszyć duże różnice między grupami. Dlatego szybkie przetwarzanie próbek jest niezbędne do dokładnej analizy danych. Opisane tutaj techniki rozwarstwiania długich kości i izolacji szpiku kostnego są zoptymalizowane pod kątem szybkiego przetwarzania zwierząt i próbek w celu zmniejszenia zmienności technicznej.

Protokół ten może być szeroko stosowany w wielu dziedzinach badań, w tym w badaniu samej tkanki kostnej lub badaniu komórek szpiku kostnego. Ponadto to proste podejście do sekcji długich kości umożliwi naukowcom z pokrewnych dziedzin bezpośrednie badanie wkładu kostnego w celu poszerzenia naszej wiedzy na temat dysfunkcji szpiku kostnego w niedostatecznie zbadanych patologiach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NCI nr U54CA143803, CA163124, CA093900 i CA143055 dla K.J.P. Autorzy dziękują obecnym i byłym członkom laboratorium Weilbaecher, zwłaszcza Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla i Hongju Deng, a także członkom Instytutu Urologicznego Brady'ego, zwłaszcza członkom laboratorium Pienta za krytyczną lekturę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szpilki do tablicy
korkowej
70% nożyczki
 
Kleszcze
KimwipesKimberly-Clark34120
16 G igła
1,5 ml Probówka
0,5 ml Probówka
do rozwarstwiania etanolupreparacyjnedo mikrowirówek do mikrowirówek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755(2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok wirowaniaAnaliza histomorfometrycznaPrzygotowanie hodowli kom rkowychProb wka do mikrocentryfugiUsuwanie ko ci udowej i piszczelowejPozyskiwanie szpiku kostnegoZastosowania nast pcze

Powiązane artykuły