Głęboka stymulacja mózgu (DBS) jest skuteczną opcją leczenia choroby Parkinsona. Opracowaliśmy projekt badania w celu zbadania nowych paradygmatów stymulacji u szczurów. Protokół opisuje zastosowanie testu schodowego i testu cylindra do oceny wyników motorycznych u szczurów z hemiparkinsonem leczonych DBS.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowatorskie podejście do oceny wyników motorycznych efektów głębokiej stymulacji mózgu u szczura z połowiczaną półparkinsonem: test schodowy i cylindryczny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Głęboka stymulacja mózgu jądra podwzgórzowego jest skuteczną opcją leczenia choroby Parkinsona. W naszym laboratorium opracowaliśmy protokół badania przesiewowego różnych wzorców neurostymulacji u szczurów z hemiparkinsonem (jednostronnymi uszkodzeniami). Polega na wytworzeniu jednostronnej zmiany w chorobie Parkinsona poprzez wstrzyknięcie 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) do prawego przyśrodkowego pęczka przodomózgowia, wszczepienie elektrod do przewlekłej stymulacji do jądra podwzgórzowego i ocenę wyników motorycznych pod koniec 24-godzinnych okresów zewnętrznej neurostymulacji podłączonej do. Stymulacja prowadzona była za pomocą stymulacji prądem stałym. Amplituda została ustawiona o 20% poniżej indywidualnego progu dla skutków ubocznych. Ocenę wyników motorycznych przeprowadzono poprzez ocenę spontanicznego użycia łapy w teście cylindrycznym według Shallerta oraz przez ocenę umiejętnego sięgania w teście schodowym według Montoyi. Protokół ten szczegółowo opisuje trening w skrzyni schodowej, test butli, a także zastosowanie obu tych metod u szczurów z hemiparkinsonem. Stosowanie obu testów jest konieczne, ponieważ test schodowy wydaje się być bardziej czuły na upośledzenie zdolności motorycznych i wykazuje większą wrażliwość na zmiany podczas neurostymulacji. Połączenie jednostronnego modelu Parkinsona i dwóch testów behawioralnych pozwala na ocenę różnych parametrów stymulacji w ustandaryzowany sposób.
Wprowadzenie
Głęboka stymulacja mózgu jądra podwzgórzowego (STN) jest skuteczną opcją leczenia choroby Parkinsona1 i innych zaburzeń ruchowych. Mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska są nadal słabo poznane i wieloczynnikowe, ale kluczową cechą jest modulacja aktywności sieci neuronalnej poprzez powtarzającą się depolaryzację aksonów w pobliżu elektrody stymulującej2-4. Stymulacja o wysokiej częstotliwości (>100 Hz) jest wymagana dla uzyskania korzystnego efektu w większości celów mózgowych i w większości wskazań DBS. Skutki uboczne głębokiej stymulacji mózgu wynikają z niezamierzonej koaktywacji innych włókien, które są pokryte objętością stymulacji i które pełnią różne funkcje, takie jak przewód piramidowy. W związku z tym pożądane byłoby opracowanie parametrów stymulacji, które preferencyjnie aktywują korzystne elementy nerwowe, unikając jednocześnie koaktywacji elementów efektu ubocznego5,6. Chociaż neurofizjologia może oferować takie opcje dostrajania DBS, postęp naukowy był minimalny w ciągu ostatnich dwóch dekad, ponieważ strategie programowania były przede wszystkim oceniane metodą "prób i błędów" u pacjentów i ograniczane przez ograniczone możliwości programowania dostępnych na rynku urządzeń DBS, zamiast wykorzystywać wgląd neurofizjologiczny i zdefiniowane ustawienia eksperymentalne do systematycznego badania pełnej przestrzeni parametrów.
Aby przezwyciężyć przeszkodę translacyjną w badaniach DBS, proponujemy protokół do badania alternatywnych parametrów stymulacji w modelach parkinsonizmu u gryzoni przed badaniami klinicznymi. Jednostronna choroba Parkinsona u szczurów jest modelowana za pomocą zastrzyków 6-hydroksydopaminy do prawego przyśrodkowego pęczka przodomózgowia7,8. Powstała zmiana, opisana dalej jako hemiparkinsonowska, jest oceniana w teście apomorfiny poprzez ocenę wyniku rotacji po wstrzyknięciu małej dawki apomorfiny i potwierdzana post mortem przez immunohistochemię hydroksylazy tyrozyny. Metoda jest łatwa w zastosowaniu i wysoce powtarzalna, a jednocześnie charakteryzuje się niską śmiertelnością i zachorowalnością. Wynikające z tego deficyty motoryczne są bardzo dyskretne7,8; Zwierzęta wykazują niewielkie upośledzenie lewej łapy po lewej stronie zarówno podczas spontanicznej eksploracji, jak i złożonych zachowań chwytnych9,10.
Aby ocenić skuteczność protokołów głębokiej stymulacji mózgu, wymagane są testy, które pozwalają na szybki i wiarygodny pomiar zmian w sprawności motorycznej i mogą być powtarzane w czasie przy różnych ustawieniach neurostymulacji. Kilka grup zaproponowało różne podejścia do stymulacji i różne testy w celu oceny funkcji motorycznych u szczurów11 z bardzo zmiennymi i niespójnymi wynikami11-14. Zmusiło nas to do wyboru zestawu testów o wysokiej trafności predykcyjnej i komplementarności. Dodatkowo, do oceny wyników motorycznych w warunkach głębokiej stymulacji mózgu, preferowano testy, które mogły być wykonywane przez zwierzęta podłączone do generatora bodźców. W tym celu stworzyliśmy naszą baterię testową składającą się z jednego testu na asymetrię użycia łap i jednego testu na umiejętne sięganie. Projekt badania przedstawiono na rysunku 1.
Dla spontanicznego użycia łap przeprowadziliśmy test cylindryczny opisany przez Shallert15, który jest powszechnie stosowanym testem na użycie łap podczas eksploracji pionowej. Szkolenie zwierzęcia nie jest wymagane. W celu oceny bardziej złożonych zachowań chwytania ustaliliśmy test schodów zgodnie z Montoya16. Nasz protokół jest zmodyfikowany zgodnie z Kloth17. Szczury są szkolone przez okres dwunastu dni w docieraniu do granulek z pudełka testowego. Po okresie treningowym test może być zastosowany do pomiaru złożonych zachowań chwytnych poprzez zliczenie wskaźnika sukcesu opisanego jako liczba zjedzonych granulek. W artykule przedstawiono szczegółowy trening w klatce schodowej oraz wykonywanie obu testów behawioralnych w warunkach naiwnej, hemiparkinsonowskiej i głębokiej stymulacji mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Uniwersytet w Würzburgu i legalne władze państwowe Dolnej Frankonii zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony zwierząt i wytycznymi Rady Wspólnot Europejskich (numer zatwierdzenia: 55.2-2531.01 76/11). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować ból czy dyskomfort wykorzystywanych zwierząt.
Uwaga: Implantacja elektrody została przeprowadzona zgodnie z opisem w innym miejscu18.
1. Test cylindra (Rysunek 2)
- Przygotuj przezroczysty cylinder z tworzywa sztucznego (wysokość: 40 cm, średnica: 19 cm), czyszcząc cylinder 0,1% roztworem kwasu octowego.
- Przygotuj karty z datą eksperymentu i numerem identyfikacyjnym każdego szczura.
- Umieść dwa lusterka pod kątem 90° za cylindrem.
- Umieść kamerę przed cylindrem tak, aby odległość między kamerą a cylindrem umożliwiała dobry widok łap.
- Umieść szczura w pudełku transportowym.
Uwaga: Zwierzęta powinny być dotykane przez eksperymentatora przed badaniem, aby uniknąć stresu. - Przetransportuj szczura z domowej klatki do cylindra za pomocą skrzyni transportowej.
- Umieść szczura w cylindrze (Rysunek 3).
- Zawsze wykonuj wszystkie testy behawioralne o tej samej porze dnia, aby uniknąć okołodobowych różnic w aktywności. Jeśli zwierzę jest podłączone do generatora bodźców za pomocą, upewnij się, że nie jest skręcony podczas eksperymentu.
- Naciśnij przycisk "nagrywaj" w aparacie. Pokaż kamerze kartę z rzeczywistą datą eksperymentu i numerem identyfikacyjnym szczura. Rozpocznij nagrywanie.
- Po pięciu minutach wyjmij zwierzę z cylindra i włóż je z powrotem do klatki domowej za pomocą skrzyni transportowej.
- Oczyść butlę 0,1% roztworem kwasu octowego.
- Oceń użycie łapy na podstawie nagranego wideo, licząc kontakty lewej i prawej ściany łapy (użycie łapy w procentach), a także wychowanie (stanie na tylnych łapach z podparciem lub bez podparcia na ścianie cylindra). Test cylindra może być również oceniany automatycznie przez odpowiednie oprogramowanie.
Uwaga: Zdrowy szczur używa obu łap jednakowo. Szczur z hemiparkinsonem w mniejszym stopniu wykorzystuje łapę dotkniętą zmianą chorobową.
2. Test klatki schodowej (Rysunek 4)
- Faza przejęcia
- Dzień przed treningiem należy zapoznać zwierzęta z granulkami używanymi w teście Staircase.
- Opcjonalnie: Aby zwiększyć motywację zwierzęcia, należy zastosować ograniczenie dietetyczne (10-15 g standardowej karmy laboratoryjnej, aby utrzymać masę ciała na poziomie 90% poziomu swobodnego żywienia16). Nie jest to jednak konieczne, aby osiągnąć pozytywny efekt treningowy. Badanie to zostało przeprowadzone bez ograniczeń żywieniowych.
- Przygotuj przezroczyste schody z tworzywa sztucznego (wysokość: 34,5 cm, długość: 35,5 cm, szerokość: 12 cm i wąska komora 6 cm), czyszcząc pudełko 0,1% roztworem kwasu octowego. Uwaga: Skrzynka schodowa jest dwukomorową skrzynką z podniesioną platformą i dwoma schodami w wąskim przedziale. Do lewych stopni na schodach w wąskim przedziale można dotrzeć tylko lewą łapą, do prawych stopni tylko prawą łapą.
Uwaga: Standardowe skrzynie schodowe składają się z dwóch komór z pokrywą, jeśli mają być używane do eksperymentów na szczurach stymulowanych za pomocą, należy użyć wysokiego pudełka bez pokrywy. - Usuń schody i napełnij studzienki na każdym stopniu ośmioma granulkami 45 mg.
- Włóż schody i umieść osiem dodatkowych granulek na podwyższonej platformie.
- Umieść szczura w pudełku transportowym.
- Przetransportuj szczura z klatki domowej do klatki schodowej za pomocą skrzyni transportowej.
- Umieść szczura w skrzynce na klatce schodowej (Rysunek 5).
- Po pięciu minutach wyjmij zwierzę z boksu na klatce schodowej i włóż je z powrotem do klatki domowej za pomocą skrzyni transportowej.
- Zwróćcie uwagę, ile granulek zostało zjedzonych z podestu i (w końcu) z prawej i lewej klatki schodowej.
- Napełnij klatkę schodową, wypełniając studzienki na każdym stopniu ośmioma granulkami 45 mg.
- Wyczyść klatkę schodową 0,1% roztworem kwasu octowego i umieść dodatkowe granulki na platformie.
- Powtórz tę procedurę (fazę akwizycji) trzy dni z rzędu.
Uwaga: Wszystkie opisane eksperymenty przeprowadzono na samcach szczurów Sprague Dawley. Czas trwania różnych modułów treningowych może się różnić u szczurów o różnym naturze, płci i sprzedawcy.
- Dzień przed treningiem należy zapoznać zwierzęta z granulkami używanymi w teście Staircase.
- Test wolnego wyboru
- Wyczyść klatkę schodową 0,1% roztworem kwasu octowego.
- Usuń schody i napełnij studzienki na każdym stopniu ośmioma granulkami 45 mg.
- Umieść szczura w pudełku transportowym.
- Przetransportuj szczura z klatki domowej do klatki schodowej za pomocą skrzyni transportowej.
- Umieść szczura w skrzynce na klatce schodowej.
- Po pięciu minutach wyjmij zwierzę z klatki schodowej i włóż je z powrotem do klatki domowej za pomocą skrzyni transportowej.
Zwróć uwagę, ile granulek zostało zjedzonych z prawej i lewej klatki schodowej. - Uwaga: Jeśli zwierzęta nadal mają problemy z chwytaniem śrutu, dodaj trochę więcej na platformie, gdzie można do nich łatwo dotrzeć.
- Napełnij klatkę schodową, wypełniając studzienki na każdym stopniu ośmioma granulkami 45 mg.
- Wyczyść klatkę schodową 0,1% roztworem kwasu octowego dla następnego zwierzęcia.
- Powtórz tę procedurę (faza wolnego wyboru) trzy dni z rzędu.
Uwaga: Przedstawione wyniki uzyskano poprzez trening przeprowadzony bez przerwy między modułami. Niektóre grupy preferują dzień odpoczynku w celu utrwalenia, aby wspomóc proces treningowy.
- Test wymuszonego wyboru
- Wyczyść klatkę schodową 0,1% roztworem kwasu octowego.
- Usunąć klatkę schodową i napełnić studzienki na każdym stopniu po lewej stronie schodowej ośmioma (pierwsze trzy dni modułu) lub czterema (kolejne trzy dni modułu) granulkami 45 mg.
- Przeprowadzić test wymuszonego wyboru po stronie, po której wystąpi utrata wartości.
Uwaga: Zmianę Parkinsona wykonujemy na prawej półkuli i dlatego trenujemy selektywnie lewą łapę.
- Przeprowadzić test wymuszonego wyboru po stronie, po której wystąpi utrata wartości.
- Umieść szczura w pudełku transportowym.
- Przetransportuj szczura z klatki domowej do klatki schodowej za pomocą skrzyni transportowej.
- Umieść szczura w skrzynce na klatce schodowej.
- Po pięciu minutach wyjmij zwierzę z boksu na klatce schodowej i włóż je z powrotem do klatki domowej za pomocą skrzyni transportowej.
- Zwróćcie uwagę, ile granulek zostało zjedzonych z lewej klatki schodowej.
- Napełnij klatkę schodową, wypełniając studzienki na każdym stopniu ośmioma lub czterema granulkami 45 mg (liczba granulek zależy od dnia treningu).
- Wyczyść klatkę schodową 0,1% roztworem kwasu octowego dla następnego zwierzęcia.
- Powtórz tę procedurę (faza wymuszonego wyboru) sześć dni z rzędu.
- Akwizycja danych
- Przeprowadź eksperyment zgodnie z opisem dla modułu wymuszonego wyboru (cztery granulki w każdej studzience na lewej klatce schodowej) przez dwa kolejne dni. Oblicz wskaźnik sukcesu (liczbę zjedzonych granulek) jako średnią z dwóch dni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
U wszystkich zwierząt przeprowadzono pośmiertną weryfikację histologiczną zarówno uszkodzenia dopaminergicznego, jak i położenia elektrody. Do sekcji wyników włączono wyłącznie zwierzęta z prawidłowym umieszczeniem elektrody w obrębie STN (Rycina 6) oraz całkowitym uszkodzeniem dopaminergicznym (>90% utraty neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej) (Rycina 7).
Test cylindra przeprowadzony...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano szczegółowy protokół treningowy dla testu cylindra i klatki schodowej. Ten ostatni ma na celu ocenę złożonych zachowań chwytnych i ruchów motorycznych spowodowanych umiejętnością sięgania u szczurów16,17. Pomiar wyniku jest wyrażony jako liczba granulek zjedzonych podczas badania, co jest pomiarem obiektywnym. Protokół może być stosowany w modelach szczurzych w chorobie Parkinsona i innych modelach chorób motorycznych. Test cylindryczny obejmuje proste podejście do oceny używania łap u s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF), Kliniki Uniwersyteckie w Würzburgu, Niemcy (projekt N-215).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Skrzynka schodowa bez pokrywy | Glas Keil, Niemcy | zamówienie | |
| Skrzynka na butle | Glas Keil, Niemcy | na zamówienie | |
| Bezpyłowe granulki precyzyjne, 45 mg | Bio Serv | F0021 |
Bibliografia
- Fasano, A., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for movement disorders: 2015 and beyond. Current opinion in neurology. , (2015).
- McIntyre, C. C., Savasta, M., Kerkerian-Le Goff, L., Vitek, J. L. Uncovering the mechanism(s) of action of deep brain stimulation: activation, inhibition, or both. Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 115, 1239-1248 (2004).
- Deniau, J. M., Degos, B., Bosch, C., Maurice, N. Deep brain stimulation mechanisms: beyond the concept of local functional inhibition. The European journal of neuroscience. 32, 1080-1091 (2010).
- Modolo, J., Legros, A., Thomas, A. W., Beuter, A. Model-driven therapeutic treatment of neurological disorders: reshaping brain rhythms with neuromodulation. Interface focus. 1, 61-74 (2011).
- Groppa, S., et al. Physiological and anatomical decomposition of subthalamic neurostimulation effects in essential tremor. Brain : a journal of neurology. 137, 109-121 (2014).
- Reich, M. M., et al. Short pulse width widens the therapeutic window of subthalamic neurostimulation. Annals of clinical and translational neurology. 2, 427-432 (2015).
- Blandini, F., Armentero, M. T., Martignoni, E. The 6-hydroxydopamine model: news from the past. Parkinsonism & related disorders. 14, Suppl 2 124-129 (2008).
- Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
- Metz, G. A., Tse, A., Ballermann, M., Smith, L. K., Fouad, K. The unilateral 6-OHDA rat model of Parkinson's disease revisited: an electromyographic and behavioural analysis. The European journal of neuroscience. 22, 735-744 (2005).
- Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 14, 7148-7158 (1994).
- Li, X. H., et al. High-frequency stimulation of the subthalamic nucleus restores neural and behavioral functions during reaction time task in a rat model of Parkinson's disease. Journal of neuroscience research. 88, 1510-1521 (2010).
- Darbaky, Y., Forni, C., Amalric, M., Baunez, C. High frequency stimulation of the subthalamic nucleus has beneficial antiparkinsonian effects on motor functions in rats, but less efficiency in a choice reaction time task. The European journal of neuroscience. 18, 951-956 (2003).
- Fang, X., Sugiyama, K., Akamine, S., Namba, H. Improvements in motor behavioral tests during deep brain stimulation of the subthalamic nucleus in rats with different degrees of unilateral parkinsonism. Brain research. 1120, 202-210 (2006).
- Lindemann, C., Krauss, J. K., Schwabe, K. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus in the 6-hydroxydopamine rat model of Parkinson's disease: effects on sensorimotor gating. Behavioural brain research. 230, 243-250 (2012).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience. 36, 219-228 (1991).
- Kloth, V., Klein, A., Loettrich, D., Nikkhah, G. Colour-coded pellets increase the sensitivity of the staircase test to differentiate skilled forelimb performances of control and 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain research bulletin. 70, 68-80 (2006).
- Fluri, F., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. JoVE. , (2015).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotactic coordinates. , (2008).
- Nikkhah, G., Rosenthal, C., Hedrich, H. J., Samii, M. Differences in acquisition and full performance in skilled forelimb use as measured by the 'staircase test' in five rat strains. Behavioural brain research. 92, 85-95 (1998).
- Angelov, S. D., Dietrich, C., Krauss, J. K., Schwabe, K. Effect of Deep Brain Stimulation in Rats Selectively Bred for Reduced Prepulse Inhibition. Brain stimulation. , (2014).
- de Haas, R., et al. Wireless implantable micro-stimulation device for high frequency bilateral deep brain stimulation in freely moving mice. Journal of neuroscience methods. 209, 113-119 (2012).
- Heo, M. S., et al. Fully Implantable Deep Brain Stimulation System with Wireless Power Transmission for Long-term Use in Rodent Models of Parkinson's Disease. Journal of Korean Neurosurgical Society. 57, 152-158 (2015).
- Gut, N. K., Winn, P. Deep brain stimulation of different pedunculopontine targets in a novel rodent model of parkinsonism. J. Neurosci. 35, 4792-4803 (2015).
- Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behavioural brain research. 145, 221-232 (2003).
- Honndorf, S., Lindemann, C., Tollner, K., Gernert, M. Female Wistar rats obtained from different breeders vary in anxiety-like behavior and epileptogenesis. Epilepsy research. 94, 26-38 (2011).
- Jadavji, N. M., Metz, G. A. Sex differences in skilled movement in response to restraint stress and recovery from stress. Behavioural brain research. 195, 251-259 (2008).
- Kucker, S., Tollner, K., Piechotta, M., Gernert, M. Kindling as a model of temporal lobe epilepsy induces bilateral changes in spontaneous striatal activity. Neurobiology of disease. 37, 661-672 (2010).
- Smith, L. K., Metz, G. A. Dietary restriction alters fine motor function in rats. Physiology & behavior. 85, 581-592 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
