Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

DOI:

10.3791/53958

⸱

11 maja 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCBL1, UMR/CNRS 5822, Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire Moléculaire, Université de Lyon, 2Hospices-Civils-de-Lyon, Centre Hospitalier Lyon-Sud

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo postępów w zrozumieniu progresji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), pięcioletni wskaźnik przeżycia pozostaje niski z powodu miejscowego nawrotu i odległych przerzutów. Jedną z hipotez wyjaśniających ten nawrót jest obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC), które wykazują wrodzoną oporność na chemo- i radioaktywność. W celu opracowania nowych strategii terapeutycznych konieczne jest posiadanie modeli eksperymentalnych, które potwierdzają skuteczność terapii celowanych, a tym samym posiadanie wiarygodnych metod identyfikacji i izolacji CSC. W tym celu przedstawiamy protokół izolacji CSC z ludzkich linii komórkowych HNSCC, który opiera się na połączeniu dwóch kolejnych sortowań komórek przeprowadzanych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Pierwsza z nich opiera się na właściwości CSC do nadekspresji białek transportowych kasety wiążącej ATP (ABC), a tym samym wykluczania m.in. ważnych barwników DNA, takich jak Hoechst 33342. Komórki posortowane tą metodą są identyfikowane jako "populacja boczna" (SP). Ponieważ komórki SP stanowią niewielki procent (<5%) komórek rodzicielskich, konieczna jest faza wzrostu, aby zwiększyć ich liczbę przed drugim sortowaniem komórek. Kolejny krok pozwala na selekcję komórek, które posiadają dwie inne cechy komórek macierzystych HNSCC, tj. wysoki poziom ekspresji markera powierzchniowego komórki CD44 (wysoki poziom CD44) oraz nadekspresję dehydrogenazy aldehydowej (wysoki ALDH). Ponieważ zastosowanie pojedynczego markera wiąże się z licznymi ograniczeniami i pułapkami w izolacji CSC, połączenie markerów SP, CD44 i ALDH zapewni użyteczne narzędzie do izolowania CSC do dalszych testów analitycznych i funkcjonalnych wymagających żywych komórek. Podobne do łodygi cechy CSC zostały ostatecznie potwierdzone in vitro poprzez tworzenie się nowotworów i ekspresję β-kateniny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest powszechnym nowotworem złośliwym na całym świecie i pomimo postępu w obecnych terapiach, pacjenci z zaawansowaną chorobą mają złe rokowania. Całkowity 5-letni wskaźnik przeżycia pacjenta wynosi około 30%, pomimo połączenia podejść terapeutycznych, w tym chirurgii, chemioradioterapii i terapii celowanych. Ostatnie badania przypisują miejscowy nawrót i odległe przerzuty przeżyciu nowotworowych komórek macierzystych (CSC) po terapiach przeciwnowotworowych1. Istnieje coraz więcej dowodów potwierdzających istnienie komórek wykazujących właściwości komórek macierzystych (niezróżnicowany status, zdolności do samoodnawiania się i różnicowania oraz aktywność telomerazy) w różnych guzach litych, w tym piersi, mózgu, prostaty, płuc, jelita grubego, trzustki, wątroby i skóry2-10. Pochodzenie CSC pozostaje jednak niejasne11,12. Mogą one wynikać ze złośliwej transformacji prawidłowych komórek macierzystych3,13 lub odróżnicowania komórek nowotworowych, które nabywają cechy podobne do CSCs14,15. W związku z tym zrozumienie charakterystycznych szlaków związanych z CSC zapewni wgląd we wczesną diagnostykę i leczenie opornego HNSCC.

Zaproponowano, że CSC posiadają również odporne fenotypy, które unikają standardowej chemioterapii i radioterapii, co powoduje nawrót nowotworu w porównaniu do większości komórek nowotworowych16-19 i są zlokalizowane w niszach niedotlenienia20. Zaproponowano wiele czynników wyjaśniających tę oporność CSC, takich jak skłonność do spoczynku, zwiększona naprawa DNA, regulowane w górę mechanizmy kontroli cyklu komórkowego i wymiatanie wolnych rodników21. Co więcej, kilka onkogennych szlaków molekularnych może być specyficznie aktywowanych w CSCs17. Aby poszerzyć wiedzę na temat CSC dla dalszych terapii celowanych, potrzebujemy wiarygodnych metod identyfikacji i izolacji CSC, ze względu na niejednorodność markerów związanych z komórkami macierzystymi w różnych typach nowotworów22.

W HNSCC, komórki inicjujące guz macierzysty zostały wyizolowane z pierwotnych guzów pacjenta poprzez sortowanie komórek wyrażających różne biomarkery CSC (takie jak ekspresja transporterów wypływu leku23, CD44wysoka, CD24niska CD133wysoka, fenotyp c-Met+ 10,24,25, lub ALDHwysoka aktywność26) lub hodowla pierwotnego guza pacjenta w celu utworzenia łuskowatych sfer o właściwościach CSC. Niemniej jednak liczba łuskowatych zmniejsza się dramatycznie po dwóch przejściach, co daje niewielką liczebność próby do dalszych badań charakteryzacyjnych27. W związku z tym testy in vitro rozpoczynające się od dobrze ugruntowanych linii komórkowych są łatwiejszym rozwiązaniem do projektowania eksperymentów w celu poszerzenia wiedzy na temat CSC.

Celem tego artykułu jest zaproponowanie metody izolowania CSC z linii komórkowych HNSCC za pomocą wieloparametrycznej analizy cytometrycznej przepływu i sortowania komórek. Ekspresja CD44 w korelacji z kilkoma właściwościami CSC, w tym aktywnością ALDH, fenotypem populacji bocznej (SP), zdolnością do tworzenia sferoidów i rakotwórczością, wykorzystuje się do wyizolowania i scharakteryzowania tej subpopulacji CSC. CD44, glikoproteina na powierzchni komórki, bierze udział w adhezji i migracji komórek. CD44 ulega silnej ekspresji w wielu guzach litych CSCs28, w tym w modelach raka głowy i szyi29-31. Co więcej,wysokie komórki CD44 mogą generować in vivo heterogenny guz, podczas gdyniskie komórki CD44 nie mogą10. Test SP opiera się na zróżnicowanym potencjale komórek do wypływu barwnikaHoechst 22 przez rodzinę białek transportowych wiążących ATP (ABC) z nadekspresją w błonie CSC. Test ten obejmuje zastosowanie inhibitorów transportera ABC, takich jak werapamil w próbkach kontrolnych. Dehydrogenaza aldehydowa (ALDH) jest enzymem wewnątrzkomórkowym, który bierze udział w przekształcaniu retinolu w kwas retinowy podczas wczesnego różnicowania komórek macierzystych25,26. Komórki, które wykazują wysoką aktywność ALDH, wykazują zachowanie podobne do komórek macierzystych w HNSCC26, a bardzo niewielka liczba komóreko wysokiej zawartości ALDH jest w stanie generować guzy in vivo26,32.

Kombinacja tych markerów i właściwości została z powodzeniem wykorzystana przez Bertrand et al. do zbadania odporności in vitro i in vivo tych CSC na promieniowanie fotonowe i jony węgla19. Ich wyniki wyraźnie pokazały, że połączenie różnych markerów i właściwości komórek jest bardziej selektywne dla użytecznych badań na populacjach CSC HNSCC niż podejścia oparte na pojedynczych markerach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Wszystkie szczegóły tego badania zostały zatwierdzone przez CECCAPP, francuską komisję etyczną.

1. Wybór populacji bocznej (SP) za pomocą testu wypływu barwnika Hoechst

  1. Barwienie 50 milionów komórek barwnikiem Hoechst 33342.
    1. Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 15 ml ze stożkowym dnem: jedną probówkę oznaczoną "Hoechst" i jedną oznaczoną "Hoechst i Werapamil". Przygotować 10 ml 5 mM roztworu chlorowodorku werapamilu w sterylnej wodzie. Przygotuj pożywkę hodowlaną (CM) dla komórek macierzystych.
      1. Aby przygotować CM dla CSC (CM-CSC), połącz następujące elementy: zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco: F12 (1:3, v:v), 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,04 mg/l hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny, 0,1 g/l streptomycyny i 20 μg/l naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR).
    2. Pod okapem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,5 g/l) do kolby o powierzchni 75 cm². Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie pożywki używanej do macierzystej linii komórkowej. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
      1. Aby przygotować CM dla rodzicielskiej linii komórkowej (CM-P), należy uzupełnić DMEM 10% FCS, 0,4 mg/L hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/L streptomycyny).
    3. Rozcieńczyć zawiesinę komórek otrzymaną w kroku 1.1.2 w celu uzyskania10-7 komórek/ml w CM-P. Podziel zawiesinę komórek w 2 przygotowanych probówkach: umieść 100 μl (106 komórek) w probówce "Hoechst i Werapamil" i 4 ml (4 x 107 komórek) w probówce "Hoechst".
    4. Do próbki "Hoechst i Werapamil" dodać 10 μl 5 mM roztworu chlorowodorku werapamilu (stężenie końcowe: 0,5 mM) i delikatnie wymieszać. Dodać 5 μl 1 g/l roztworu Hoechsta (końcowe stężenie: 0,1 g/l). Do próbki "Hoechst" dodać 5 μl 1 g/l roztworu Hoechsta na 10-6 komórek (łącznie 200 μl). Odtąd należy chronić próbki przed bezpośrednim narażeniem na działanie światła za pomocą folii aluminiowej.
    5. Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę 30 min. Mieszać delikatnie co 15 minut, aby zapobiec osadzaniu się komórek.
    6. Probówki wirówkowe o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę z 2 ml 1x PBS.
    7. Probówki wirować o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Zawiesić osad "Hoechst i Werapamil" w 500 μl 5 mg/l jodku propidyny (PI) rozcieńczonego w buforze PBS, a osad "Hoechst" w 4 ml 5 mg/l PI rozcieńczonego w buforze PBS.
    8. Przenieść roztwory próbek przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm w celu usunięcia agregatów i zebrania pojedynczych komórek w probówkach w celu pobrania próbki na cytometr przepływowy. Próbki należy przechowywać na lodzie i chronić przed bezpośrednim nasłonecznieniem za pomocą folii aluminiowej.
  2. Izolacja populacji bocznej z wyłączeniem barwnika Hoechst przez sortowanie komórek.
    1. Przeprowadzić ujemną separację komórek Hoechsta na sortowniku cytometrii przepływowej o następujących parametrach: laser UV (355 nm), 2 detektory na ścieżce lasera UV z niebieskimi filtrami Hoechsta (450/50 BP) i czerwonym filtrem Hoechsta (610/20 BP) oraz 2 kolektory.
      1. Najpierw przeanalizuj próbkę "Hoechst", która służy jako kontrola pozytywna do barwienia i ustawienia cytometru przepływowego.
      2. Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres punktowy" (piąty obrazek w prawym górnym rogu) i utwórz wykres w arkuszu globalnym. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz FSC-A (rozproszenie do przodu), a na odciętych, SSC-A (rozproszenie boczne) (Rysunek 1A). W ten sam sposób utwórz wykres punktowy SSC-W i SCC-H. Na tym drugim wykresie kropkowym, aby utworzyć region P1, kliknij "Brama wielokątna" (czternaste zdjęcie w prawym górnym rogu) (Rysunek 1B)33.
        Uwaga: Region P1 będzie obejmował pojedyncze komórki i dyskryminujące dublety.
      3. Opcjonalnie: Wyklucz komórki PI dodatnie, tworząc FSC-A i PI bramkowane na P1. Na tym wykresie kropkowym wybierz populację dodatnich komórek PI (P2), aby wykluczyć martwe komórki dodatnie PI.
      4. Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres kropkowy" i utwórz wykres w globalnym arkuszu. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz niebieski Hoechst-A, a na odciętych, czerwony Hoechst-A. Klikając prawym przyciskiem myszy na populację, wybierz "Pokaż populację" i P1. Na tym wykresie kropkowym utwórz region (P2), aby wybrać ujemne komórki populacji po stronie barwnika Hoechsta (SP), które pojawiają się jako boczne ramię po lewej stronie głównej populacji komórek (Rysunek 1C).
    2. Przeanalizuj próbkę "Hoechst" i zbierz 10 000 zdarzeń. Aby upewnić się, że bramka P2, która reprezentuje populację SP, jest dobrze ustawiona, przeanalizuj próbkę "Hoechst i Verapamil" (10 000 zdarzeń), aby zaobserwować zanik populacji SP (Figura 1D).
    3. Zebrać ujemne komórki barwnika SP Hoechst w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml CM-CSC przygotowanej w ppkt 1.1.1.1.
    4. Pod koniec sortowania komórek odwirować zawiesinę komórek o sile 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml CM-CSC. Policzyć liczbę posortowanych komórek za pomocą licznika komórek i przenieść odpowiednią liczbę komórek do kolby hodowlanej (patrz tabela 1). Dodać CM-CSC i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze CO2 .
    5. Utrzymywać komórki w hodowli w tych samych warunkach przez maksymalnie 2 pasaże, aż do uzyskania minimalnych 5 x 107 komórek (patrz krok 3, "Metoda hodowli komórkowej").

2. Wybór subpopulacjiCD44 wysokiej/ALDHwysokiej w populacji bocznej posortowanej

  1. Barwienie 50 milionów komórek SP za pomocą zestawu do wykrywania ALDH i przeciwciała CD44.
    1. Przygotuj siedem sterylnych probówek o pojemności 15 ml oznaczonych w następujący sposób: "Niebarwiona" (Probówka a), "CD44-APC" (Probówka b), "IgG1-APC" (Probówka c), "ALDH" (Probówka d), "ALDH i DEAB" (Probówka e), "ALDH i CD44-APC" (Probówka f), "ALDH, DEAB i CD44-APC" (Probówka g). Podczas barwienia wszystkie probówki i odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować bufor A z 4,5 ml buforu 1 (zawartego w zestawie) i 45 μl przeciwciała CD44-APC (allofikocyjaniny) (rozcieńczenie 1:100). Przygotować bufor B ze 100 μl buforu 1 i 1 μl przeciwciała IgG1-APC (rozcieńczenie 1:100). Przygotować bufor C z 4 ml buforu 1 i 20 μl odczynnika z zestawu.
    3. Przygotować zawiesinę komórek z uprzednio posortowanych komórek (etap 1.2.5) w stężeniu 10-7 komórek/ml. Dodać 100 μl (10-6 komórek) zawiesiny komórek do probówek a, b i c, a następnie 4 ml (4 x 107 komórek) do probówki f. Na razie nie wkładaj komórek do probówek d, e i g.
    4. Odwirować probówki zawierające komórki o masie 250 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w probówkach a, b i c w 100 μl buforu 1. Dodać 5 μl aldehydu dietyloaminobenzynowego (DEAB), inhibitora ALDH do probówek e i g.
      1. Zawiesić komórki w probówce f z 4 ml odczynnika C i natychmiast przenieść 100 μl do probówek d, e i g. Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut i chronić przed bezpośrednim nasłonecznieniem za pomocą folii aluminiowej. Po 15 minutach delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, wirując, aby zapobiec osadzaniu się komórek.
    5. Od tego momentu trzymaj rurki na lodzie i chroń przed bezpośrednim działaniem światła za pomocą folii aluminiowej. Odwirować wszystkie probówki o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    6. Zawiesić probówkę f w 4 ml oraz probówki b i g ze 100 μl buforu A. Zawiesić probówkę c ze 100 μl buforu B. Do pozostałych probówek dodać 100 μl buforu 1. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Odwirować wszystkie probówki o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Przepłukać raz 1 ml buforu 1 (4 ml dla probówki f) i ponownie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Zawiesić probówkę f w granulkach w 4 ml, a wszystkie inne probówki w 1 ml buforu 1.
    8. Przenieść roztwory próbek przez sitka do komórek o wielkości 70 μm w celu usunięcia agregatów i zebrać pojedyncze komórki w odpowiednich probówkach w celu pobrania próbki na cytometrze przepływowym.
  2. Izolacja populacji komóreko wysokim poziomie CD44 / ALDH przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.
    1. Sortowanie wysokokomórkowe CD44high/ALDH należy wykonać na sortowniku cytometrii przepływowej o następujących parametrach: laser niebieski (488 nm) i laser czerwony (633 nm), 1 detektor na ścieżce lasera niebieskiego z filtrem FITC (530/30), 1 detektor na ścieżce lasera czerwonego z filtrem APC (660/20) i 2 kolektory.
    2. Korzystając z oprogramowania cytometru, kliknij "Wykres punktowy" (piąty obrazek w prawym górnym rogu), aby utworzyć wykres punktowy FSC-A w porównaniu z SSC-A, jak opisano w sekcji 1.2.1.2, aby sprawdzić morfologię komórek i wybrać populację złożoną z pojedynczych komórek z wykresem kropkowym SSC-W w i SSC-H.
    3. Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres kropkowy" i utwórz wykres w globalnym arkuszu. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz APC-A, a na odciętych, FITC-A, aby wybrać podwójnie zabarwioną populację. Utwórz bramkę za pomocą rurek d i e, aby wybraćwysokie komórki ALDH (rysunek 2A). Uwaga: Komórki dodatnie znikają w probówce e potraktowanej DEAB (ryc. 2B).
      1. Na tym samym wykresie utwórz drugą bramkę za pomocą rurek b i c, aby wybraćwysokie komórki CD44 (rysunek 2C i 2D). Komórki dodatnie znikają w probówce zawierającej IgG1-APC. Przeanalizuj probówki f i g i utwórz trzecią bramkę, którazawiera wysokie komórki CD44/ ALDH (rysunek 2E i 2F).
        Uwaga: Jeśli w probówce zawierającej IgG1-APC (Figura 2D) obecne są komórki dodatnie, interakcja między komórkami a przeciwciałem barwionym APC nie jest specyficzna.
    4. Zebrać komórkio wysokim poziomie CD44/ALDH do 15 ml probówki zawierającej 1 ml CM-CSC. Zebrać również CD44low/ALDHlow do 15 ml probówki zawierającej 1 ml CM19. Uwaga: Przygotuj CM-CSC zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.1.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad 1 ml CM-CSC. Policz liczbę posortowanych komórek.

3. Metoda hodowli komórkowej

  1. Po dwukrotnym sortowaniu komórek, jak opisano powyżej, należy umieścić posortowane komórki w odpowiedniej kolbie hodowlanej (tabela 1) z CM-CSC w temperaturze 37 °C przy 5 % CO2 . Po 18-24 godzinach sprawdź, czy komórki się przykleiły i zmień pożywkę hodowlaną. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 3 dni, aż rozszerzające się kolonie będą większe niż 50% zlewania się.
  2. Użyj odpowiedniej objętości trypsyny 0,5 g/L - EDTA (Tabela 1) do trypsynizacji komórek z kolby hodowlanej. Inkubować komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać odpowiednią objętość CM-CSC (Tabela 1), aby zatrzymać działanie trypsyny.
  3. Policz liczbę otrzymanych komórek i umieść 4 x 105 komórek w kolbie hodowlanej o powierzchni 175 cm² za pomocą CM-CSC. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Przy tym stężeniu komórki o czasie podwojenia wynoszącym 24 godziny będą w 70% zlewać się w ciągu 7 dni.
  4. Do eksperymentów in vitro lub in vivo należy stosować CSC przed poddaniem ich 3 pasażom.

4. Potwierdzenie potencjału nowotworowego i charakterystyki CSC

  1. Tworzenie kuli nowotworowej w celu potwierdzenia potencjału nowotworowego komórek owysokim poziomie CD44 / ALDH.
    1. Trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w 3.2. Dodać 1 x 106 komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 250 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w podłożu DMEM:F12 (3:1) wolnym od FCS, 20 ng/ml rhEGF, 4 mg/l heparyny i 1x B27. Inkubować komórki w 6-dołkowej kolbie hodowlanej z niskimi płytkami kotwiczącymi w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      Uwaga: Użyj pożywki DMEM: F12 (3:1) zawierającej 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / L heparyny i 1x B27, jeśli komórka nie rośnie bez FCS.
    2. Obserwuj tworzenie się kuli guza za pomocą mikroskopu optycznego od 4 do 10 dni po wysiewie (ryc. 3A).
      Uwaga: Średnica kuli guza powinna być większa niż 35 μm. Wysokie komórki CD44 / wysokie ALDH będą wykazywać szybsze i bardziej wzmocnione tworzenie kuli nowotworowej pod względem liczby i wielkości w porównaniu do CD44o niskim / niskim ALDH.
  2. Ocena rakotwórczości in vivo po podskórnym wstrzyknięciu komóreko wysokim poziomie CD44 / ALDH u myszy NOD-SCID.
    1. Po posortowaniu ponownie zawiesić komórki w PBS w trzech różnych stężeniach (10,4 komórki/ml, 10,5 komórek/ml i 10,6 komórek/ml). Wstrzyknąć podskórnie 100 μl 104 komórek/ml (103 komórek) w obszar prawego boku 6 myszy. Zrób to samo dla 105 komórek/ml (104 komórek) i 106 komórek/ml (105 komórek).
      Uwaga: Można przetestować mniejsze rozcieńczenie niż 103 komórek.
    2. Wstrzyknąć to samo stężeniekomórek CD44 o niskim poziomie /ALDH w obszarze lewej flanki. Monitoruj myszy, którym wstrzyknięto do 10 tygodni, aby zobaczyć progresję guza19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja CSCs z linii komórkowych HNSCC wymagała dwóch kolejnych sortowań ze względu na bardzo niski odsetek CSC w rodzicielskiej linii komórkowej. Pierwsze sortowanie opierało się na zdolności CSC do wykluczania barwnika Hoechst przez transportery wypływu leków. Spowodowało to pozyskanie 1-5% całej posortowanej populacji komórek (ryc. 1). Podczas sortowania komórek za pomocą barwnika Hoechsta sprawdź rozmiar i granulację posortowanych komórek, patrząc na wykres punktowy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje niezawodną metodę udanej izolacji CSC z określonej linii komórkowej, która ma zastosowanie do innych linii komórkowych HNSCC. Izolowane CSC głowy i szyi nadają się następnie do dalszej charakterystyki molekularnej in vitro i walidacji funkcjonalnej poprzez przeszczepienie u myszy z niedoborem odporności19. Jednak niektóre modyfikacje można przetestować w zależności od populacji bocznej lubwysokiego procentu CD44/ ALDH obecnego w rodzicielskiej linii komórkowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Thibault Andrieu i Sebastienowi Dussurgey'emu z Platformy Cytometrii Przepływowej UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) za ich rady i pomoc podczas naszego sortowania. Prace te zostały zrealizowane w ramach naukowych ETOILE i Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Surowica płodu cielęcego GoldGE HealthcareA15-151
Hydrokortyzon rozpuszczalny w wodzieSigma-AldrichH0396-100MG
Penicylina/Streptomycyna 100xDominique DutscherL0022-100
DMEMGibco61965-026
F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-IGibco31765-027
EGFPromegaG5021Roztwór należy przygotować tuż przed użyciem, ponieważ jest bardzo niestabilny
HeparynaStemcellTM Technologies7980
B-27 Suplement (50x), bez witaminy AGibco12587-010
Hoechst 33342Sigma-Aldrich14533, ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna) kategoria 4
ChlorowodorekwerapamiluSigma-AldrichV-4629Toksyczność ostra (doustna, skórna, wziewna) kategoria 3
Jodek propidynySigma-AldrichP4170Toksyczność ostra (doustna, skórna, inhalacyjna) kategoria 4
Zestaw ALDEFLUORKomórka macierzysta1700
CD44-APC, przeciwciało ludzkieMiltenyi Biotech130-095-177
IgG1-APC, przeciwciało ludzkieMiltenyi Biotech130-093-189
Cząstka redlicy Z1Beckman Coulter6605698
Mikroskop optycznyOlympus CKX31
SQ20BPrezent od Johna Little' sLaboratorium-FaDu
linia komórkowaATCCHTB-43
Płyty o niskim zakotwiczeniuThermo Fischer Scientific145383
Oprogramowanie BD FACSDiva v8.0.1BD Biosciences-
Linia komórkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
  2. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  3. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  4. Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
  5. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
  6. Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
  7. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
  9. Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
  10. Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
  11. Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
  12. Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
  13. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
  14. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
  15. Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
  16. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  17. Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67(2006).
  18. Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
  19. Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
  20. Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
  21. Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
  22. Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064(2009).
  23. Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
  24. Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
  25. Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
  26. Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
  27. Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
  28. Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
  29. Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
  30. Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
  31. Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
  32. Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
  33. Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
  34. Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
  35. Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
  36. Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
  37. Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
  38. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rakowe kom rki macierzysterak g owy i szyipopulacja bocznawysoka ekspresja CD44wysoka aktywno ALDHsortowanie kom rek aktywowane fluorescencjefekt wyp ywu barwnika Hoechsttworzenie sfer nowotworowychekspresja beta kateninypo ywka dla rakowych kom rek macierzystych

Powiązane artykuły