Metoda RAPID przetwarzania krwi może być stosowana u ludzi i daje wyższe poziomy peptydów, jak również pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej. Dlatego metoda ta będzie cennym narzędziem w badaniach nad peptydami.
Artykuł metodologiczny
Metoda RAPID przetwarzania krwi może być stosowana u ludzi i daje wyższe poziomy peptydów, jak również pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej. Dlatego metoda ta będzie cennym narzędziem w badaniach nad peptydami.
Badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Często obejmuje to pomiar peptydów regulujących przyjmowanie pokarmu. Aby prawidłowo określić stężenie peptydu, powinien on być stabilny podczas przetwarzania krwi. Nie dotyczy to jednak kilku peptydów, które są szybko rozkładane przez endogenne peptydazy. Niedawno opracowaliśmy metodę przetwarzania krwi wykorzystującą temperatury wywołane R, cydyfikacja A, hamowanie rotazy P, kontrole egzogenne Isotopowe i rozcieńczanie D(RAPID) do stosowania u szczurów. Tutaj ustaliliśmy tę technikę do stosowania u ludzi i zbadaliśmy regenerację, formę molekularną i stężenie krążących hormonów regulujących spożycie pokarmu. Metoda RAPID znacząco poprawiła odzysk 125znakowanych I somatostatyny-28 (+39%), glukagonopodobnego peptydu-1 (+35%), acylogreliny i glukagonu (+32%), insuliny i kisspeptyny (+29%), nesfatyny-1 (+28%), leptyny (+21%) i peptydu YY3-36 (+19%) w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (EDTA krew na lodzie, p <0,001). Wysokosprawna chromatografia cieczowa wykazała elucję endogennej greliny acylowej w oczekiwanej pozycji po przetwarzaniu RAPID, podczas gdy po standardowym przetwarzaniu 62% greliny acylowej uległo degradacji, co spowodowało wcześniejszy pik prawdopodobnie reprezentujący desacyl grelinę. Po przetwarzaniu RAPID stosunek acylo-desacylogreliny we krwi osób o prawidłowej masie ciała wynosił 1:3 w porównaniu do 1:23 po standardowym przetwarzaniu (p = 0,03). Również poziomy endogennej kisspeptyny były wyższe po badaniu RAPID w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (+99%, p = 0,02). Metoda przetwarzania krwi RAPID może być stosowana u ludzi, daje wyższe poziomy peptydów i pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej.
W świetle ogólnoświatowego wzrostu częstości występowania otyłości1,2, badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Chociaż do tej pory znany jest tylko jeden peptyd, który jest wytwarzany obwodowo i działa centralnie w celu stymulowania przyjmowania pokarmu, a mianowicie grelina3, w ciągu ostatnich dziesięcioleci zidentyfikowano szeroki zakres peptydów, które zmniejszają spożycie pokarmu, np. leptyna, peptyd YY (PYY), a także glukagonopodobny peptyd-1 (GLP-1) i insulina4, Dlatego w badaniach badających mechanizmy regulacyjne głodu i sytości często ocenia się poziomy peptydów i jednocześnie przyjmuje się, że badany peptyd jest stabilny i odzyskiwany z dużą wydajnością podczas tworzenia osocza. Jednak bardzo często tak nie jest ze względu na szybki rozpad endogenny, jak wykazano wcześniej dla np. grelina, która ulega degradacji z acylu do desacylowejgreliny 5. Dlatego niedawno opisaliśmy metodę RAPID do przetwarzania krwi u szczurów wykorzystującą temperatury wywołane R, cydizację A, hamowanie rotazy P, kontrole egzogenne Isotopowe i rozcieńczanie D6. Metoda ta poprawiła odzysk 11 z 12 testowanych peptydów i pozwoliła na określenie prawidłowej krążącej formy molekularnej w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi (EDTA krew na lodzie)6. Metoda ta została wykorzystana w kilku późniejszych badaniach7-12 do wykrywania krążącej greliny, a także czynnika uwalniającego kortykotropinę13. Dlatego metoda okazała się przydatna w badaniach peptydów u gryzoni. Ponieważ jednak badania na gryzoniach nie zawsze dają się przełożyć na inny gatunek, należy ustalić metodę do stosowania również w krwi ludzkiej.
Celem obecnego badania było przetestowanie metody RAPID do przetwarzania krwi u ludzi w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi, EDTA krwi na lodzie, która jest powszechnie zalecana14 i często stosowana zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych. Przetestowaliśmy odzyskiwanie wybranych 125peptydów znakowanych izotopem I zaangażowanych w regulację przyjmowania pokarmu, w tym peptydów o ugruntowanej pozycji, a także nowych kandydatów, którzy niedawno zasugerowano, że odgrywają rolę w regulacji żywienia (wpływ na przyjmowanie pokarmu pokazano w tabeli 1) po przetworzeniu obiema metodami. Hormony zostały również wybrane tak, aby reprezentowały peptydy o różnej długości i ładunku (Tabela 2). Ponadto w przypadku greliny badaliśmy formę molekularną (formy) molekularne zgodnie z metodą standardową i RAPID. Na koniec oceniliśmy endogenną grelinę (grelinę acylową i desacylo-grelinę), a także poziom kisspeptyny, peptydu, który również niedawno zasugerowano jako odgrywający rolę w regulacji spożycia pokarmu15,16 po RAPID lub standardowym przetwarzaniu. Ponadto zbadaliśmy również te poziomy peptydów w populacji osób o szerokim zakresie wskaźnika masy ciała (w zakresie od 10,2-67,6 kg/m2), aby zbadać możliwe różnice związane z przewlekle zmienioną masą ciała.


Diagnoza, ocena i plan:
Uczestnicy badania
Wszyscy uczestnicy badania byli nowo hospitalizowanymi pacjentami (włączenie nastąpiło w ciągu dwóch dni od przyjęcia do szpitala) Oddziału Medycyny Psychosomatycznej Charité-Universitätsmedizin Berlin i wyrazili pisemną świadomą zgodę. Aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu płci, uwzględniono tylko pacjentki. W badaniu wzięło udział 42 osoby, które podzielono na trzy grupy: normalna masa ciała (BMI 18,5-25 kg/m2, n = 12), jadłowstręt psychiczny (BMI <17,5 kg/m2, n = 15) i otyłość (BMI >30 kg/m2, n = 15). Pacjenci z anoreksją i otyłością zostali zdiagnozowani zgodnie z Międzynarodową Klasyfikacją Chorób-10 i hospitalizowani odpowiednio z powodu przyrostu masy ciała (jadłowstręt psychiczny) lub redukcji masy ciała (otyłość). Wszyscy pacjenci z prawidłową masą ciała byli hospitalizowani wyłącznie z powodu objawów somatycznych bez istotnych zaburzeń somatycznych. Wykluczono pacjentów z objawami ze strony przewodu pokarmowego lub z historią operacji przewodu pokarmowego. Kryteria wykluczenia obejmowały również wiek <18 lat, aktualną ciążę oraz nieleczone choroby psychotyczne. Pobranie krwi przeprowadzono w 2. lub 3. dniu po przyjęciu do szpitala przed rozpoczęciem leczenia dietetycznego w celu odpowiednio zwiększenia lub zmniejszenia masy ciała. Parametry antropometryczne zostały ocenione tego samego dnia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół został zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną ds. badań na ludziach (numer protokołu EA1/114/10).
1. Przetwarzanie krwi
2. Pomiary
UWAGA: Czynności opisane w tej sekcji należy wykonywać w laboratorium certyfikowanym do pracy z materiałem radioaktywnym. Należy podjąć standardowe środki ostrożności podczas pracy z 125I.
3. Analiza statystyczna
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
SZYBKIE przetwarzanie krwi zwiększa wydajność 125peptydów znakowanych radioaktywnie w ludzkiej krwi w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi.
Po standardowym przetwarzaniu krwi (krew EDTA na lodzie), odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie wynosił ~ 60% w peptydach 9/9 (w zakresie od 48-68%, Figura 1A-K). Szybkie przetwarzanie poprawiło wydajność wszystkich 125peptydów znakowanych izotopem I, a mianowicie somatostatyny-...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Informowaliśmy wcześniej, że metoda RAPID do przetwarzania krwi poprawiła odzyskiwanie peptydów 11/12 w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi u szczurów6. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że metoda ta nadaje się również do stosowania u ludzi. Po przetworzeniu RAPID odzysk 9 z 9 125testowanych peptydów znakowanych izotopem I uległ poprawie w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi (EDTA, krew na lodzie). Zaobserwowana poprawa wahała się od 19 do 39%, co może być istotne, szczególnie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą STE 1765/3-1 (A.S.) oraz niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań 03IPT614A (C.G.). Dziękujemy Reinhardowi Lommelowi i Petrze Buße za doskonałe wsparcie techniczne, a także Karin Johansson i Christinie Hentzschel za pomoc w organizacji i wykonaniu pomiarów antropometrycznych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| Antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| Leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| Chymostatyna | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 wkłady | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 i mikro; m |
| Milipor acylo-greliny | , Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioaktywny |
| GLP-1 | Milipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioaktywny |
| glikagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioaktywna |
| insulina | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioaktywna |
| leptyna | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioaktywna |
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioaktywna |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioaktywna |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | radioaktywny |
| Somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | radioaktywny |
| Kolumna ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2,1 mm x 50 mm, 1,8 i mikro; m |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, kilka komponentów, dlatego nie ma jednego numeru katalogowego | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioaktywna |
| grelina całkowita RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | radioaktywny |
| Aktywna grelina RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioaktywne |
| SigmaStat 3.1 | Systat, San Jose, CA, USA | do pobrania online |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie