SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

Podsumowanie

Metoda RAPID przetwarzania krwi może być stosowana u ludzi i daje wyższe poziomy peptydów, jak również pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej. Dlatego metoda ta będzie cennym narzędziem w badaniach nad peptydami.

Streszczenie

Badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Często obejmuje to pomiar peptydów regulujących przyjmowanie pokarmu. Aby prawidłowo określić stężenie peptydu, powinien on być stabilny podczas przetwarzania krwi. Nie dotyczy to jednak kilku peptydów, które są szybko rozkładane przez endogenne peptydazy. Niedawno opracowaliśmy metodę przetwarzania krwi wykorzystującą temperatury wywołane R, cydyfikacja A, hamowanie rotazy P, kontrole egzogenne Isotopowe i rozcieńczanie D(RAPID) do stosowania u szczurów. Tutaj ustaliliśmy tę technikę do stosowania u ludzi i zbadaliśmy regenerację, formę molekularną i stężenie krążących hormonów regulujących spożycie pokarmu. Metoda RAPID znacząco poprawiła odzysk ¹²⁵znakowanych I somatostatyny-28 (+39%), glukagonopodobnego peptydu-1 (+35%), acylogreliny i glukagonu (+32%), insuliny i kisspeptyny (+29%), nesfatyny-1 (+28%), leptyny (+21%) i peptydu YY_3-36 (+19%) w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (EDTA krew na lodzie, p <0,001). Wysokosprawna chromatografia cieczowa wykazała elucję endogennej greliny acylowej w oczekiwanej pozycji po przetwarzaniu RAPID, podczas gdy po standardowym przetwarzaniu 62% greliny acylowej uległo degradacji, co spowodowało wcześniejszy pik prawdopodobnie reprezentujący desacyl grelinę. Po przetwarzaniu RAPID stosunek acylo-desacylogreliny we krwi osób o prawidłowej masie ciała wynosił 1:3 w porównaniu do 1:23 po standardowym przetwarzaniu (p = 0,03). Również poziomy endogennej kisspeptyny były wyższe po badaniu RAPID w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (+99%, p = 0,02). Metoda przetwarzania krwi RAPID może być stosowana u ludzi, daje wyższe poziomy peptydów i pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej.

Wprowadzenie

W świetle ogólnoświatowego wzrostu częstości występowania otyłości^1,2, badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Chociaż do tej pory znany jest tylko jeden peptyd, który jest wytwarzany obwodowo i działa centralnie w celu stymulowania przyjmowania pokarmu, a mianowicie grelina³, w ciągu ostatnich dziesięcioleci zidentyfikowano szeroki zakres peptydów, które zmniejszają spożycie pokarmu, np. leptyna, peptyd YY (PYY), a także glukagonopodobny peptyd-1 (GLP-1) i insulina⁴, Dlatego w badaniach badających mechanizmy regulacyjne głodu i sytości często ocenia się poziomy peptydów i jednocześnie przyjmuje ....

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną ds. badań na ludziach (numer protokołu EA1/114/10).

1. Przetwarzanie krwi

1. Krew żylną należy pobrać między godziną 07:00 a 08:00 po całonocnym poście z żyły przedramienia i obrać ją zgodnie ze standardową procedurą lub metodą RAPID. Poinstruuj badanych, aby nie ćwiczyli ani nie palili przed pobraniem krwi.
2. W przypadku standardowego przetwarzania należy zebrać krew do schłodzonych probówek zawierających EDTA i odwirować w ciągu 10 minut przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania za pomocą ....

Wyniki

SZYBKIE przetwarzanie krwi zwiększa wydajność ¹²⁵peptydów znakowanych radioaktywnie w ludzkiej krwi w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi.
Po standardowym przetwarzaniu krwi (krew EDTA na lodzie), odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie wynosił ~ 60% w peptydach 9/9 (w zakresie od 48-68%, Figura 1A-K). Szybkie przetwarzanie poprawiło wydajność wszystkich ¹²⁵peptydów znakowanych izotopem I, a mianowicie somatostatyny-.......

Dyskusja

Informowaliśmy wcześniej, że metoda RAPID do przetwarzania krwi poprawiła odzyskiwanie peptydów 11/12 w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi u szczurów⁶. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że metoda ta nadaje się również do stosowania u ludzi. Po przetworzeniu RAPID odzysk 9 z 9 ¹²⁵testowanych peptydów znakowanych izotopem I uległ poprawie w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi (EDTA, krew na lodzie). Zaobserwowana poprawa wahała się od 19 do 39%, co może być istotne, szczególnie .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Diprotin A	Peptides International, Louisville, KY, USA	IDP-4132
E-64-d	Peptides International, Louisville, KY, USA	IED-4321-v
Antipain	Peptides International, Louisville, KY, USA	IAP-4062
Leupeptin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ILP-4041
Chymostatyna	Peptides International, Louisville, KY, USA	ICY-4063
Sep-Pak C18 wkłady	Waters Corporation, Milford, MA, USA	WAT051910	360 mg, 55-105 i mikro; m
Milipor acylo-greliny	, Billerica, MA, USA	9088-HK	Radioaktywny
GLP-1	Milipore, Billerica, MA, USA	9035-HK	Radioaktywny
glikagon	Millipore, Billerica, MA, USA	9030	Radioaktywna
insulina	Millipore, Billerica, MA, USA	9011S	Radioaktywna
leptyna	Millipore, Billerica, MA, USA	9081-HK	Radioaktywna
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-048-56	Radioaktywna
Nesfatin-1	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-003-26	Radioaktywna
PYY3-36	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-059-02	radioaktywny
Somatostatin-28	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-060-16	radioaktywny
Kolumna ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	822700-902	2,1 mm x 50 mm, 1,8 i mikro; m
Agilent 1200 LC	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA		HPLC, kilka komponentów, dlatego nie ma jednego numeru katalogowego
Kisspeptin  RIA	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	# RK-048-56	Radioaktywna
grelina całkowita RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRT-89HK	radioaktywny
Aktywna grelina RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRA-88HK	Radioaktywne
SigmaStat 3.1	Systat, San Jose, CA, USA	do pobrania online