Artykuł metodologiczny

SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

DOI:

10.3791/53959

⸱

28 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Division General Internal and Psychosomatic Medicine, Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, 2Department of Internal Medicine, Institute of Neurogastroenterology and Motility, Martin-Luther Hospital, Academic Teaching Institution of Charité Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Molecular Cancer Research Center (MKFZ), Campus Virchow-Klinikum, Charité-Universitätsmedizin Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda RAPID przetwarzania krwi może być stosowana u ludzi i daje wyższe poziomy peptydów, jak również pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej. Dlatego metoda ta będzie cennym narzędziem w badaniach nad peptydami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Często obejmuje to pomiar peptydów regulujących przyjmowanie pokarmu. Aby prawidłowo określić stężenie peptydu, powinien on być stabilny podczas przetwarzania krwi. Nie dotyczy to jednak kilku peptydów, które są szybko rozkładane przez endogenne peptydazy. Niedawno opracowaliśmy metodę przetwarzania krwi wykorzystującą temperatury wywołane R, cydyfikacja A, hamowanie rotazy P, kontrole egzogenne Isotopowe i rozcieńczanie D(RAPID) do stosowania u szczurów. Tutaj ustaliliśmy tę technikę do stosowania u ludzi i zbadaliśmy regenerację, formę molekularną i stężenie krążących hormonów regulujących spożycie pokarmu. Metoda RAPID znacząco poprawiła odzysk 125znakowanych I somatostatyny-28 (+39%), glukagonopodobnego peptydu-1 (+35%), acylogreliny i glukagonu (+32%), insuliny i kisspeptyny (+29%), nesfatyny-1 (+28%), leptyny (+21%) i peptydu YY3-36 (+19%) w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (EDTA krew na lodzie, p <0,001). Wysokosprawna chromatografia cieczowa wykazała elucję endogennej greliny acylowej w oczekiwanej pozycji po przetwarzaniu RAPID, podczas gdy po standardowym przetwarzaniu 62% greliny acylowej uległo degradacji, co spowodowało wcześniejszy pik prawdopodobnie reprezentujący desacyl grelinę. Po przetwarzaniu RAPID stosunek acylo-desacylogreliny we krwi osób o prawidłowej masie ciała wynosił 1:3 w porównaniu do 1:23 po standardowym przetwarzaniu (p = 0,03). Również poziomy endogennej kisspeptyny były wyższe po badaniu RAPID w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem (+99%, p = 0,02). Metoda przetwarzania krwi RAPID może być stosowana u ludzi, daje wyższe poziomy peptydów i pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W świetle ogólnoświatowego wzrostu częstości występowania otyłości1,2, badania w dziedzinie regulacji spożycia żywności zyskują na znaczeniu. Chociaż do tej pory znany jest tylko jeden peptyd, który jest wytwarzany obwodowo i działa centralnie w celu stymulowania przyjmowania pokarmu, a mianowicie grelina3, w ciągu ostatnich dziesięcioleci zidentyfikowano szeroki zakres peptydów, które zmniejszają spożycie pokarmu, np. leptyna, peptyd YY (PYY), a także glukagonopodobny peptyd-1 (GLP-1) i insulina4, Dlatego w badaniach badających mechanizmy regulacyjne głodu i sytości często ocenia się poziomy peptydów i jednocześnie przyjmuje się, że badany peptyd jest stabilny i odzyskiwany z dużą wydajnością podczas tworzenia osocza. Jednak bardzo często tak nie jest ze względu na szybki rozpad endogenny, jak wykazano wcześniej dla np. grelina, która ulega degradacji z acylu do desacylowejgreliny 5. Dlatego niedawno opisaliśmy metodę RAPID do przetwarzania krwi u szczurów wykorzystującą temperatury wywołane R, cydizację A, hamowanie rotazy P, kontrole egzogenne Isotopowe i rozcieńczanie D6. Metoda ta poprawiła odzysk 11 z 12 testowanych peptydów i pozwoliła na określenie prawidłowej krążącej formy molekularnej w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi (EDTA krew na lodzie)6. Metoda ta została wykorzystana w kilku późniejszych badaniach7-12 do wykrywania krążącej greliny, a także czynnika uwalniającego kortykotropinę13. Dlatego metoda okazała się przydatna w badaniach peptydów u gryzoni. Ponieważ jednak badania na gryzoniach nie zawsze dają się przełożyć na inny gatunek, należy ustalić metodę do stosowania również w krwi ludzkiej.

Celem obecnego badania było przetestowanie metody RAPID do przetwarzania krwi u ludzi w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi, EDTA krwi na lodzie, która jest powszechnie zalecana14 i często stosowana zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych. Przetestowaliśmy odzyskiwanie wybranych 125peptydów znakowanych izotopem I zaangażowanych w regulację przyjmowania pokarmu, w tym peptydów o ugruntowanej pozycji, a także nowych kandydatów, którzy niedawno zasugerowano, że odgrywają rolę w regulacji żywienia (wpływ na przyjmowanie pokarmu pokazano w tabeli 1) po przetworzeniu obiema metodami. Hormony zostały również wybrane tak, aby reprezentowały peptydy o różnej długości i ładunku (Tabela 2). Ponadto w przypadku greliny badaliśmy formę molekularną (formy) molekularne zgodnie z metodą standardową i RAPID. Na koniec oceniliśmy endogenną grelinę (grelinę acylową i desacylo-grelinę), a także poziom kisspeptyny, peptydu, który również niedawno zasugerowano jako odgrywający rolę w regulacji spożycia pokarmu15,16 po RAPID lub standardowym przetwarzaniu. Ponadto zbadaliśmy również te poziomy peptydów w populacji osób o szerokim zakresie wskaźnika masy ciała (w zakresie od 10,2-67,6 kg/m2), aby zbadać możliwe różnice związane z przewlekle zmienioną masą ciała.

figure-introduction-1

figure-introduction-2

Diagnoza, ocena i plan:
Uczestnicy badania
Wszyscy uczestnicy badania byli nowo hospitalizowanymi pacjentami (włączenie nastąpiło w ciągu dwóch dni od przyjęcia do szpitala) Oddziału Medycyny Psychosomatycznej Charité-Universitätsmedizin Berlin i wyrazili pisemną świadomą zgodę. Aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu płci, uwzględniono tylko pacjentki. W badaniu wzięło udział 42 osoby, które podzielono na trzy grupy: normalna masa ciała (BMI 18,5-25 kg/m2, n = 12), jadłowstręt psychiczny (BMI <17,5 kg/m2, n = 15) i otyłość (BMI >30 kg/m2, n = 15). Pacjenci z anoreksją i otyłością zostali zdiagnozowani zgodnie z Międzynarodową Klasyfikacją Chorób-10 i hospitalizowani odpowiednio z powodu przyrostu masy ciała (jadłowstręt psychiczny) lub redukcji masy ciała (otyłość). Wszyscy pacjenci z prawidłową masą ciała byli hospitalizowani wyłącznie z powodu objawów somatycznych bez istotnych zaburzeń somatycznych. Wykluczono pacjentów z objawami ze strony przewodu pokarmowego lub z historią operacji przewodu pokarmowego. Kryteria wykluczenia obejmowały również wiek <18 lat, aktualną ciążę oraz nieleczone choroby psychotyczne. Pobranie krwi przeprowadzono w 2. lub 3. dniu po przyjęciu do szpitala przed rozpoczęciem leczenia dietetycznego w celu odpowiednio zwiększenia lub zmniejszenia masy ciała. Parametry antropometryczne zostały ocenione tego samego dnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną ds. badań na ludziach (numer protokołu EA1/114/10).

1. Przetwarzanie krwi

  1. Krew żylną należy pobrać między godziną 07:00 a 08:00 po całonocnym poście z żyły przedramienia i obrać ją zgodnie ze standardową procedurą lub metodą RAPID. Poinstruuj badanych, aby nie ćwiczyli ani nie palili przed pobraniem krwi.
  2. W przypadku standardowego przetwarzania należy zebrać krew do schłodzonych probówek zawierających EDTA i odwirować w ciągu 10 minut przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania za pomocą testu radioimmunologicznego.
  3. W przypadku przetwarzania RAPID należy natychmiast rozcieńczyć krew (w ciągu 1 minuty po pobraniu krwi) w stosunku 1:10 w lodowatym buforze (pH 3,6) zawierającym 0,1 M octanu amonu, 0,5 M NaCl i inhibitory enzymów (diprotyna A, E-64-d, leki przeciwbólowe, leupeptyna, chymostatyna, 1 μg/ml). Następnie odwirować w ciągu 10 minut przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant za pomocą pipety w probówkach polipropylenowych, jak opisano wcześniej u szczurów6.
    1. Naładować wkłady chromatograficzne (360 mg, 55-105 μm) 100% acetonitrylem (szybkość 10 ml/min), zrównoważyć 0,1% trifluorooctanem (TFA, szybkość 10 ml/min) i załadować supernatantem ze stałą szybkością 1 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej.
    2. Następnie przemyć wkłady 3 ml 0,1% TFA (szybkość 10 ml/min) i powoli eluować 2 ml 70% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (2 ml/min).
    3. Wysuszyć eluowane próbki za pomocą wirowania próżniowego i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania za pomocą testu radioimmunologicznego.
      UWAGA: Przeprowadź wszystkie etapy w probówkach polipropylenowych (przetwarzanie RAPID) i borokrzemianowych (test radioimmunologiczny), które wykazują znacznie niższe właściwości wiązania powierzchniowego, a tym samym minimalizują utratę peptydów dla większości peptydów badanych przed26.

2. Pomiary

UWAGA: Czynności opisane w tej sekcji należy wykonywać w laboratorium certyfikowanym do pracy z materiałem radioaktywnym. Należy podjąć standardowe środki ostrożności podczas pracy z 125I.

  1. Odzyskiwanie peptydów znakowanych radioaktywnie
    1. Otrzymaj 125znakowanych radioaktywnie peptydów ludzkich (np. acylo-greliny, GLP-1, glukagonu, insuliny, kisspeptyny, leptyny, nesfatyny-1, PYY3-36 i somatostatyny-28).
    2. Trzymaj peptydy w postaci proszku do czasu eksperymentu, a następnie świeżo rozcieńcz w 0,1% kwasie octowym (~ 100 000 cpm na ml).
    3. W przypadku standardowego przetwarzania krwi, bezpośrednio po pobraniu krwi do schłodzonych probówek zawierających EDTA, należy przenieść 1 ml krwi do probówki z 50 μl radioznacznika zawierającego 3000-6000 cpm (liczonego bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu).
    4. W przypadku przetwarzania metodą RAPID należy przenieść 1 ml krwi zawierającej EDTA do probówki zawierającej 9 ml buforu RAPID (dla składu patrz 1.3) i 500 μl radioznacznika zawierającego 30 000-60 000 cpm. Ze względu na rozcieńczenie 1:10 należy użyć 10-krotnie większej objętości radioznacznika do SZYBKIEGO przetwarzania.
    5. Następnie należy przetworzyć próbki zgodnie z opisem w krokach od 1.2 do 1.3.2.
    6. W przypadku doświadczeń z odzyskiem nie suszyć próbek przez wirowanie próżniowe i nie przechowywać ich w temperaturze -80 °C. Zamiast tego należy ocenić odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie bezpośrednio po tym procesie za pomocą licznika gamma.
    7. Zmierz cały supernatant w próbkach wzorcowych, natomiast w próbkach RAPID przeanalizuj 1/10 całkowitej objętości, aby uzyskać porównywalność ilości użytego znaku radioaktywnego. W celu pomiaru przenieś supernatant do probówek pasujących do licznika gamma i oceń liczbę na minutę
    8. Jako 100% standardu należy użyć dwóch próbek zawierających 50 μl 125I-znakowanego radioaktywnie peptydu, które nie są poddawane przetwarzaniu. Mierzyć w tym samym czasie z innymi próbkami, jak opisano w ppkt 2.1.7.
    9. Wykonaj eksperyment pięć do sześciu razy dla każdego peptydu.
  2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa znakowanej radioaktywnie greliny
    1. Pobrać krew ze schłodzonych probówek zawierających EDTA i przenieść 1 ml do probówek zawierających 200 μl znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej 15 000-20 000 cpm (liczonej bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu).
    2. W przypadku przetwarzania RAPID przenieść 1 ml krwi do probówki zawierającej 9 ml buforu RAPID (dla składu patrz 1.3) i 200 μl znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej 15 000-20 000 cpm.
    3. Następnie należy przetworzyć próbki zgodnie z opisem w krokach od 1.2 do 1.3.2.
    4. W celu dalszej analizy za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, bezpośrednio załadować próbki do kolumny C18 o stabilnym wiązaniu (2,1 mm x 50 mm, 1,8 μm) zrównoważonej 17% acetonitrylem w wodzie (oba uzupełnione 0,1% TFA).
    5. Po 5 minutach równowagi należy użyć gradientu od 17-40% acetonitrylu, aby wymyć próbkę w ciągu 40 minut (natężenie przepływu 1 ml/min).
    6. Zbieraj frakcje 1 ml co minutę i analizuj radioaktywność za pomocą licznika gamma.
    7. W oddzielnym eksperymencie załadować 200 μl znakowanej radioaktywnie greliny acylowej zawierającej 15 000-20 000 cpm bezpośrednio na kolumnę i przeprowadzić HPLC zgodnie z opisem w krokach 2.2.4 do 2.2.6.
  3. Test radioimmunologiczny
    1. W przypadku testu radioimmunologicznego rozmrażać zamrożone supernatanty (standardowe przetwarzanie) i suszony próżniowo proszek (metoda RAPID) w temperaturze pokojowej.
    2. Bezpośrednio przed testem radioimmunologicznym należy ponownie zawiesić suche próbki RAPID w podwójnie destylowanymH2Ozgodnie z pierwotną objętością osocza (500 μl).
    3. Ocenić kisspeptynę i całkowitą (w tym zarówno desacyl, jak i acyl grelinę), a także acyl grelinę, jak opisano wcześniej12,27, przy użyciu komercyjnych testów radioimmunologicznych zgodnie z protokołami producentów. Używaj rurek borokrzemianowych, które umożliwiają stabilne tworzenie granulek.
      1. Pierwszego dnia należy inkubować próbki z buforem do oznaczania i pierwszorzędowym przeciwciałem (np. antygreliną) w rozcieńczeniu dostarczonym przez producenta przez okres 24 godzin.
      2. W drugim dniu dodać znacznik 125I (np. 125I-greliny), odwirować i inkubować przez okres 24 godzin.
      3. Trzeciego dnia dodać odczynnik strącający, odwirować i inkubować zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie odwirować probówki o stężeniu 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty i policzyć radioaktywność w granulkach za pomocą licznika gamma
    4. Obliczyć desacyl grelinę jako różnicę całkowitej minus acyl greliny. Ocenić stosunek acylu/desacylogreliny, dzieląc acyl przez desacyl grelinę dla każdej pojedynczej próbki.
    5. Przetwarzaj wszystkie próbki – jeśli to możliwe – w jednej partii, aby uniknąć zmienności między testami. Zmienność wewnątrztestowa w niniejszym doświadczeniu wynosiła <8% dla kisspeptyny, <7% dla całkowitej i <9% dla acyl greliny.

3. Analiza statystyczna

  1. Określ rozkład danych za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Wyraż dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).
  2. Oceń różnice między dwiema grupami za pomocą testu t. Oceń różnice między wieloma grupami za pomocą wszystkich procedur wielokrotnego porównania parami (test post hoc Tukeya) lub dwukierunkowej ANOVA, a następnie metody Holma-Sidak.
  3. Uznaj p <0,05 za istotne i wykonuj analizy za pomocą programu statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZYBKIE przetwarzanie krwi zwiększa wydajność 125peptydów znakowanych radioaktywnie w ludzkiej krwi w porównaniu do standardowego przetwarzania krwi.
Po standardowym przetwarzaniu krwi (krew EDTA na lodzie), odzysk peptydów znakowanych radioaktywnie wynosił ~ 60% w peptydach 9/9 (w zakresie od 48-68%, Figura 1A-K). Szybkie przetwarzanie poprawiło wydajność wszystkich 125peptydów znakowanych izotopem I, a mianowicie somatostatyny-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informowaliśmy wcześniej, że metoda RAPID do przetwarzania krwi poprawiła odzyskiwanie peptydów 11/12 w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi u szczurów6. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że metoda ta nadaje się również do stosowania u ludzi. Po przetworzeniu RAPID odzysk 9 z 9 125testowanych peptydów znakowanych izotopem I uległ poprawie w porównaniu ze standardowym przetwarzaniem krwi (EDTA, krew na lodzie). Zaobserwowana poprawa wahała się od 19 do 39%, co może być istotne, szczególnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą STE 1765/3-1 (A.S.) oraz niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań 03IPT614A (C.G.). Dziękujemy Reinhardowi Lommelowi i Petrze Buße za doskonałe wsparcie techniczne, a także Karin Johansson i Christinie Hentzschel za pomoc w organizacji i wykonaniu pomiarów antropometrycznych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Diprotin APeptides International, Louisville, KY, USAIDP-4132
E-64-dPeptides International, Louisville, KY, USAIED-4321-v
AntipainPeptides International, Louisville, KY, USAIAP-4062
LeupeptinPeptides International, Louisville, KY, USAILP-4041
ChymostatynaPeptides International, Louisville, KY, USAICY-4063
Sep-Pak C18 wkładyWaters Corporation, Milford, MA, USAWAT051910360 mg, 55-105 i mikro; m
Milipor acylo-greliny, Billerica, MA, USA9088-HKRadioaktywny
GLP-1Milipore, Billerica, MA, USA9035-HKRadioaktywny
glikagonMillipore, Billerica, MA, USA9030Radioaktywna
insulinaMillipore, Billerica, MA, USA9011SRadioaktywna
leptynaMillipore, Billerica, MA, USA9081-HKRadioaktywna
Kisspeptin-10Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USAT-048-56Radioaktywna
Nesfatin-1Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USAT-003-26Radioaktywna
PYY3-36Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USAT-059-02 radioaktywny
Somatostatin-28Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USAT-060-16 radioaktywny
Kolumna ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA822700-9022,1 mm x 50 mm, 1,8 i mikro; m
Agilent 1200 LC Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USAHPLC, kilka komponentów, dlatego nie ma jednego numeru katalogowego
Kisspeptin  RIAPhoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA# RK-048-56Radioaktywna
grelina całkowita RIAMillipore, Billerica, MA, USA# GHRT-89HK radioaktywny
Aktywna grelina RIAMillipore, Billerica, MA, USA# GHRA-88HKRadioaktywne
SigmaStat 3.1Systat, San Jose, CA, USAdo pobrania online
oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992(2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Peptide RecoveryProtease InhibitionAcidificationDilutionRadioimmunoassayHPLC AnalysisPeptide DegradationAcyl Ghrelin

Powiązane artykuły