Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Streszczenie

Syntetyzowane w procesie niesterowanym przez matryce przez enzymy zwane glikozylotransferazami, glikany są kluczowymi graczami w różnych znaczących zdarzeniach wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Wiele stanów patologicznych, w szczególności rak, wpływa na ekspresję genów, co z kolei może deregulować względną obfitość i poziom aktywności hydrolazy glikozydowej i enzymów glikozylotransferazy. Unikalne, nieprawidłowe całe glikany powstające w wyniku rozregulowanej glikozylotransferazy są często obecne w śladowych ilościach w złożonych biopłynach, co utrudnia ich wykrycie, a czasem jest stochastyczne. Jednak przy odpowiednim przygotowaniu próbki, jedna z najstarszych form spektrometrii mas (chromatografia gazowa ze spektrometrią mas, GC-MS) może rutynowo wykrywać zbiór monosacharydów specyficznych dla punktu rozgałęzienia i wiązania ("węzłów glikanowych") obecnych w złożonych płynach biologicznych. Podejście omawiane w niniejszym dokumencie, uzupełniające tradycyjne techniki glikomiczne typu top-down, polega na zbieraniu i kondensacji każdego węzła składowego glikanu w próbce w jeden niezależny sygnał analityczny, który dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych i ilościowych na temat zmian w glikotransferazie jako całości i ujawnia potencjalnie rozregulowane glikozylotransferazy. Ulepszenia permetylacji i kolejnych etapów ekstrakcji ciecz/ciecz przedstawione w niniejszym dokumencie zwiększają odtwarzalność i ogólną wydajność, ułatwiając minimalne narażenie permetylowanych glikanów na alkaliczne warunki wodne. Modyfikacje etapu acetylacji dodatkowo zwiększają zakres reakcji i ogólną wydajność. Pomimo ich odtwarzalności, wykazano, że ogólna wydajność częściowo permetylowanych octanów aldytolu (PMAA) N-acetyloheksozaminy (HexNAc) jest z natury niższa niż ich oczekiwana wartość teoretyczna w stosunku do heksozy PMAA. Obliczanie stosunku obszaru pod wyekstrahowanym chromatogramem jonowym (XIC) dla każdego pojedynczego PMAA heksozy (lub HexNAc PMAA) do sumy takich obszarów XIC dla wszystkich heksoz (lub HexNAcs) zapewnia nową metodę normalizacji, która ułatwia względną kwantyfikację poszczególnych węzłów glikanu w próbce. Chociaż metoda ta jest obecnie ograniczona pod względem bezwzględnych granic wykrywalności, przyspiesza analizę klinicznych płynów biologicznych i jest bardzo obiecująca jako podejście uzupełniające do tradycyjnej glikomiki odgórnej.

Wprowadzenie

Glikolipidy, glikoproteiny, proteoglikany i glikozaminoglikany stanowią cztery główne klasy złożonych, heterogenicznych węglowodanów, znanych jako glikany. Jako wszechobecne i integralne składniki błony komórkowej, glikokaliksu oraz macierzy i płynów zewnątrzkomórkowych, glikany biorą udział w tak różnorodnych procesach biochemicznych, jak endocytoza, transport wewnątrzkomórkowy, ruchliwość komórek, transdukcja sygnału, rozpoznawanie molekularne, aktywacja receptorów, adhezja komórek, interakcja gospodarz-patogen, komunikacja międzykomórkowa, nadzór immunologiczny i inicjacja odpowiedzi immunologicznej. ¹ Enzymy znane jako glikozylotransferazy, które budują polimery glikanów, obecne w prawie każdej dziedzinie życia, działają w tandemie z hydrolazami glikozydów (znanymi również jako glikozydazy, które rozkładają glikany) w celu budowy, przebudowy i ostatecznie wytworzenia sfinalizowanych polimerów glikanowych ². Chociaż każda glikozylotransferaza może działać na różnych glikokoniugatach, glikozylotransferaza na ogół tworzy wiązanie glikozydowe specyficzne dla wiązania i anomeru, przenosząc ugrupowanie monosacharydowe określonego aktywowanego donora cukru nukleotydowego (np. GDP-fukozy) do określonej kategorii akceptorów nukleofilowych (np. lipidu, polipeptydu, kwasu nukleinowego lub rosnącego oligosacharydu). Szacuje się, że ponad 50% białek (zwłaszcza białek błonowych i wydzielniczych) jest modyfikowanych potranslacyjnie przez glikozylację. ³ Podstawowe obliczenia kombinatoryczne pozwalają docenić znaczną zmienność, wszechstronność i specyficzność przyznaną glikoproteinom przez glikozylację; Na przykład, jeśli substrat polipeptydowy ma tylko 10 miejsc glikozylacji, a każde miejsce może tworzyć wiązanie glikozydowe z 1 z zaledwie 3 różnych końców redukujących monosacharydy, to teoretycznie końcowa glikoproteina może przyjąć 3¹⁰ = 59 049 różnych tożsamości. W glikoproteinach wiązania glikozydowe często tworzą się z azotem o łańcuchu bocznym reszt asparaginy w sekwencji Asn-X-Ser / Thr (X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny), aby uzyskać N-glikany² i hydroksyle łańcucha bocznego reszt seryny i treoniny, aby uzyskać O-glikany ⁴. Skład glikudu komórkowego (tj. jego uzupełnienia produktów glikozylacji) jest unikalny i ograniczony, ponieważ, z nielicznymi wyjątkami, glikozylotransferazy wykazują ścisłą specyficzność donorową, akceptorową i wiązania. ⁵ Ważne i obfite glikoproteiny osocza krwi ulegają nieprawidłowej glikozylacji jako dalszej konsekwencji nieprawidłowej ekspresji i aktywności glikozylotransferazy z powodu wielu stanów patologicznych, zwłaszcza raka i chorób zapalnych. ^6-24

Rozdział

Głównie ze względu na czynniki epigenetyczne, glicome jest znacznie bardziej różnorodny, dynamiczny i złożony niż proteom i transkryptom. ^Podczas gdy około 1% genomu ssaków koduje tworzenie, modyfikację i składanie glikanów,27 glikozylacja przebiega w sposób niezależny od matrycy - co stanowi wyraźny kontrast z biosyntezą polipeptydów i kwasów nukleinowych. Wzajemne oddziaływanie między względną ilością i aktywnością enzymów glikozylacji a takimi czynnikami środowiskowymi, jak dostępność składników odżywczych i prekursorów, ostatecznie określa charakter, szybkość i zakres glikozylacji. ^5,28 Embriogeneza (np. determinacja i różnicowanie), aktywacja komórkowa i progresja w cyklu komórkowym wpływają na ekspresję genów (tj. transkrypcję i translację) oraz zmieniają tożsamość i ilość dostępnych glikozylotransferaz, których aktywność jest bezpośrednim wyznacznikiem profilu glikanowego komórki. Ponieważ (niektóre) właściwości proliferacyjne, adhezyjne i inwazyjne komórek rakowych przypominają zwykłe komórki embriogenne, specyficzne zmiany w szlakach biosyntezy glikanów (np. akumulacja prekursorów, rozregulowana ekspresja, nieprawidłowa modyfikacja, skrócenie struktury lub tworzenie powieści) służą jako uniwersalne biomarkery raka, które wskazują na różne etapy powstawania guza, progresji, migracji i inwazji. ²⁹ Chociaż glikozylacja jest bardzo złożona, najwyraźniej tylko nieliczne zmiany w glikozylacji mogą umożliwić kancerogenezę i przerzuty; Wygląda na to, że niektóre "nieprawidłowe" produkty glikozylacji rzeczywiście przynoszą korzyści komórkom rakowym, umożliwiając im unikanie rozpoznania immunologicznego i przetrwanie wymagań migracji w niegościnnych środowiskach wewnątrznaczyniowych i przerzutowych. ^28,30,31 Nic dziwnego, że eksperymenty wykazały, że zakłócanie lub zapobieganie wzorcom zmienionej ekspresji genów i nieprawidłowemu tworzeniu glikanów może zatrzymać nowotwór. ²⁹ Niemniej jednak nieprawidłowe glikany wykryte w próbce płynu biologicznego (np. moczu, śliny i osocza krwi lub surowicy) mogą nie być bezpośrednimi wskaźnikami raka (lub innej choroby), ale raczej dalszymi wynikami subtelnych, ale znaczących zmian w układzie odpornościowym lub wymiernymi konsekwencjami szkodliwego stanu w nieprzewidywalnym narządzie. ^{Rozdział 32}

Chociaż dostarczają uniwersalnych informacji o glikomie, wiele technik glikomicznych opartych na oddziaływaniach molekularnych (np. matryce lektyny/przeciwciała i znakowanie metaboliczne/kowalencyjne) zależy od wykrywania całych struktur glikanów i nie dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych o poszczególnych glikanach. W przeciwieństwie do tego, spektrometria mas (MS) może pomóc w identyfikacji i ilościowym określeniu poszczególnych struktur glikanów oraz ujawnieniu takich informacji strukturalnych, jak miejsca przyłączenia do rdzeni polipeptydowych. Rozregulowana ekspresja lub aktywność tylko jednej glikozylotransferazy może zainicjować kaskadę szkodliwych zdarzeń molekularnych w wielu szlakach glikozylacji. Ponieważ każda glikozylotransferaza może działać na więcej niż jednym podłożu glikokoniugatu i na różnych rosnących polimerach glikanów, zderegulowane kaskady biosyntezy dają nieproporcjonalnie zwiększone ilości tylko jednego produktu glikanowego, ale kilka niejednorodnych klas nieprawidłowych glikanów w płynach wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych. ³³ Jednakże takie unikalne nieprawidłowe glikany są czasami uważane za niepraktyczne jako biomarkery raka lub innych patologii wpływających na glikany, ponieważ w porównaniu z dużą pulą dobrze regulowanych glikanów te nieprawidłowe glikany stanowią bardzo małą frakcję, która często może pozostać niewykrywalna nawet przy użyciu tak bardzo czułych technik, jak spektrometria mas. Na przykład w wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych płynach ustrojowych szerokie spektrum stężenia białek (które obejmuje osiem rzędów wielkości) może zapobiec wykryciu rzadkich glikoprotein, które są maskowane przez liczniejsze gatunki. ³² Ponadto określenie aktywności glikozylotransferazy pozostaje poważnym wyzwaniem praktycznym i teoretycznym, ponieważ wiele glikozylotransferaz jest nieobecnych w klinicznych płynach biologicznych lub staje się nieaktywnych ex vivo. Pomimo trudności w konsekwentnym wykrywaniu i ilościowym określaniu ultra-maleńkich ilości unikalnych całych glikanów, praktycy spektrometrii mas poczynili ogromne postępy w kierunku wykorzystania nienaruszonych glikanów jako markerów klinicznych. Niedawno opracowaliśmy komplementarne podejście do analizy nienaruszonych glikanów, które, wykorzystując GC-MS, ułatwia wykrywanie wszystkich składowych monosacharydów specyficznych dla punktów rozgałęzień i wiązań ("węzłów glikanowych"), które razem nadają unikalność każdemu glikanowi i w wielu przypadkach bezpośrednio służą jako substytuty molekularne, które określają ilościowo względną aktywność winnej glikozylotransferazy.

Od czasu pierwszego bezpośredniego zastosowania do analizy glikanów w 1958 roku, chromatografia gazowa (GC) udowodniła potężną technikę analizy permetylowanych mono- i disacharydów,34 określa ich anomeryczność i bezwzględną konfigurację, a następnie rozdziela je do późniejszej analizy spektrometrii masowej. ³⁵ RozdziałW latach 1984-2007 Ciucanu i współpracownicy wprowadzili i udoskonalili technikę permetylacji glikanów w fazie stałej, w której wykorzystano wodorotlenek sodu i jodometan, a następnie ekstrakcję permetylowanych glikanów w ciecz/ciecz przy użyciu wody i chloroformu. ^35,36 W latach 2005-2008 Kang i współpracownicy włączyli do etapu permetylacji oszczędzające czas podejście oparte na kolumnie wirowej. ^37,38 W 2008 r. grupa badawcza Goetz opracowała ilościową metodę profilowania glikanów permetylacji w fazie stałej przy użyciu spektrometrii mas z desorpcją-jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) w celu porównania i potencjalnego rozróżnienia inwazyjnych i nieinwazyjnych komórek raka piersi; ^Następnie, w 2009 roku, zespół Goetza połączył techniki uwalniania enzymatycznego i chemicznego, aby rozszczepić O-glikany z nienaruszonych glikoprotein w wysoce zasadowym schemacie permetylacji w fazie stałej. ⁴⁰ Chociaż procedura Goetza ułatwiała jednoczesną permetylację i chemiczne uwalnianie O-glikanów, była ona stosowana tylko do wstępnie wyizolowanych glikoprotein. Zmodyfikowaliśmy tę technikę w 2013 roku i dostosowaliśmy ją do całych niefrakcjonowanych płynów biologicznych i homogenizowanych próbek tkanek poprzez włączenie etapów hydrolizy, redukcji i acetylacji kwasu trifluorooctowego (TFA). ³³ Te dodatkowe etapy uwalniają również glikany z glikolipidów i glikany sprzężone z N z glikoprotein i przekształcają je w częściowo metylowane octany aldytolu (PMAA, ryc. 1), których charakterystyczne wzorce metylacji i acetylacji ułatwiają analizę za pomocą GC-MS i jednoznacznie charakteryzują węzły składowe glikanów w oryginalnym nienaruszonym polimerze glikanowym⁴¹ (Figura 2). ³³ Ostatecznie procedura ta pozwala uzyskać złożony portret wszystkich glikanów w złożonym płynie biologicznym oparty na bezpośrednim, względnym oznaczaniu ilościowym unikalnych cech glikanów, takich jak "fukozylacja rdzenia", "6-sjalilacja", "dwuczęściowe GlcNAc" i "rozgałęzienie beta 1-6" - z których każdy pochodzi z pojedynczego piku chromatograficznego GC-MS. W artykule przedstawiono dalszą optymalizację etapów permetylacji, acetylacji, izolacji i oczyszczania wraz z ulepszeniami w trybie względnej kwantyfikacji.

Protokół

Ostrzeżenie: Unikaj kontaktu skóra/oczy z którymkolwiek z odczynników użytych w tym eksperymencie. Po wystawieniu na działanie wody dokładnie spłucz dotknięty obszar wodą i natychmiast zasięgnij porady lekarza.

1. Permetylacja i ekstrakcja glikanów

1. Przygotowanie kolumny
   1. Uzyskać tyle jednostek kolumny wirowej do mikrofuge, ile próbek do analizy. Złam i odczep plastikowe korki rurki zbiornika. Umieść mini filtr mikrofuge w każdej rurce zbiornika. Umieść zmontowane kolumny wirujące do mikrofuge (zawierające mini filtry) w stojaku na probówki do mikrofuge.
   2. Uzyskać zapas kulek wodorotlenku sodu (NaOH) (20-40 oczek). Przenieś trochę NaOH do małej łódki wagowej lub, jeśli wilgoć powoduje zbrylanie, do gorącej zaprawy porcelanowej jako materiału roboczego NaOH. Unikaj używania grudek NaOH lub pokruszonych/sproszkowanych kulek NaOH.
      ostrożność: NaOH jest silną toksyną i zasadą. Płukać odsłoniętą skórę/oczy wodą przez 15 min. Dokładnie wyczyść stół warsztatowy po zakończeniu eksperymentu.
   3. Za pomocą małej miarki lub szpatułki przenieś kulki NaOH z materiału roboczego, aby napełnić mini filtry mikrofuge NaOH do pierwszego zewnętrznego skosu (~5 mm poniżej brzegu). Postukaj w napełnione filtry mikrofuge na blacie, aby zapakować/skondensować kulki NaOH.
      nuta: Przez cały czas trwania tego eksperymentu, aby zminimalizować nadmierną adsorpcję wody przez higroskopijne kulki NaOH, utrzymuj poziom wszelkich dodanych płynów (np. acetonitrylu, dimetylosulfotlenku, roztworu analitu) powyżej powierzchni wypełnienia kolumny NaOH i ogranicz bezpośredni kontakt z powietrzem.
   4. Zaopatrzyć się w zapas acetonitrylu (ACN). Przenieś ~350 μl ACN do każdego mini filtra mikrofuge z NaOH. Utrzymuj NaOH zanurzony pod ACN i usuń duże pęcherzyki powietrza, mieszając końcówką do pipety z zaciskaną końcówką do pipety z żelem.
      ostrożność: Acetonitryl jest łatwopalnym środkiem drażniącym.
   5. Wirowanie kolumnowe
      1. Ułóż kolumny mikrofuge symetrycznie wewnątrz wirówki; w razie potrzeby użyj rurki równoważącej. Unikaj rozsypywania granulek NaOH do wnętrza wirówki. Zamknij pokrywę wirówki.
      2. Odwirować kolumny (zawierające NaOH i ACN) przez ~15 sekund w temperaturze 2 400 × g.
      3. Po zakończeniu wirowania wyjmij kolumny mikrofuge z wirówki i wyrzuć ACN do pojemnika na odpady niebezpieczne. Utrzymuj wypełnienie kolumny NaOH w stanie nienaruszonym.
   6. Dodaj ~350 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdego mini filtra mikrofuge z NaOH. Utrzymuj NaOH zanurzony w DMSO i usuń wszelkie duże pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Jak opisano wcześniej, odwiruj kolumny przez ~15 sekund przy 2,400 × g i wyrzuć DMSO, zachowując nienaruszone opakowanie NaOH.
      ostrożność: DMSO jest substancją mutagenną i drażniącą i łatwo wchłania się przez skórę.
   7. Zatkaj wszystkie mini filtry microfuge za pomocą zatyczek dołączonych do zestawu filtrów wirowych. Przenieś ~ 350 μl DMSO do każdego mini filtra mikrofuge wypełnionego NaOH i użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć pęcherzyki powietrza z opakowania NaOH, tak aby DMSO dotarło do wszystkich regionów w obrębie upakowania NaOH. Unikaj zgniatania lub nadmiernego skrobania kulek NaOH; Proszek NaOH jest niepożądany. Zakończ ten krok tak szybko, jak to możliwe.
2. Przygotowanie próbki(-ek) do kontroli jakości osocza (QC)
   Uwaga: Aby zapewnić spójne wyniki we wszystkich seriach doświadczalnych, należy rozważyć użycie co najmniej jednej podwielokrotności próbki pobranej z dużej, jednorodnej zbiorczej kolekcji materiału biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania, który ma być analizowany w każdej partii. Na przykład, jeśli analizujesz osocze krwi, użyj podwielokrotności z masowej kolekcji osocza krwi jako próbki kontroli jakości w każdej partii. Próbki kontroli jakości należy przetwarzać w taki sam sposób, jak próbki nieznane.
   1. Odwirować podstawową próbkę osocza QC przez 4 minuty przy ~10 000 × g. Podczas wirowania część osadu o dużej gęstości może osiąść na dnie, a część osadu o niskiej gęstości może unosić się na górze osocza. Należy unikać obu tych czynności podczas usuwania podwielokrotności osocza.
   2. Przejdź do "1.3) Przygotowanie próbki" poniżej. Następnie wróć do tego kroku po zakończeniu wirowania plazmowego.
   3. Pobrać 9 μl odwirowanego osocza QC i przenieść je do odpowiednio oznakowanej probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml wyposażonej w zatrzaskową nakrętkę (zwanej dalej "plastikową probówką o pojemności 1,5 ml"). Dodać 1 μl wody dejonizowanej do każdej podwielokrotności; W razie potrzeby użyj go jako nośnika dla wewnętrznych wzorców.
   4. Dodaj 270 μl DMSO do tego kontrolnego osocza. Wir, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
3. Przygotowanie próbki
   1. Uzyskać tyle plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml, ile wynosi liczba próbek biologicznych (analitowych).
   2. Przenieść 9 μl każdej próbki biologicznej (analitu) do odpowiadającej jej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Przenieść 1 μl wody dejonizowanej i 270 μl DMSO do każdej probówki z próbką.
   3. Energicznie wymieszać (np. wirować i/lub wielokrotnie pipetować w górę i w dół) próbki, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie w DMSO.
      ostrożność: Wykonaj następujące czynności wewnątrz dygestorium. Stosowany w kolejnych etapach jodometan (_CH3I), dichlorometan (_CH2Cl₂, znany również jako chlorek metylenu) i chloroform (_{CHCl 3,} trichlorometan) są lotnymi cieczami zdolnymi do rozpuszczania niektórych rodzajów tworzyw sztucznych (np. rękawic nitrylowych). Pamiętaj, aby używać rękawic odpornych na rozpuszczalniki. Ze względu na niską lepkość i wysoką prężność par odczynniki te mogą kapać z końcówki pipety podczas przenoszenia. Zminimalizuj straty odczynnika i potencjalne narażenie, trzymając roztwór podstawowy w pobliżu naczynia odbiorczego.
   4. Przenieś wystarczającą całkowitą objętość jodometanu do małej, czystej probówki. Każda próbka analitu będzie wymagała 105 μl jodotanu. Przenieś ~500 μl dichlorometanu do innej czystej probówki. Aby zapobiec zatkaniu strzykawki, należy przepłukać strzykawkę dichlorometanem natychmiast po transferze jodometanu.
      ostrożność: Jodometan jest światłoczułą, lotną i silną toksyną, która może uszkodzić ośrodkowy układ nerwowy lub spowodować śmierć w przypadku wdychania lub spożycia. Dichlorometan jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym, mutagenem reprodukcyjnym i silnym środkiem drażniącym, który może uszkodzić kilka narządów lub spowodować śmierć.
   5. Za pomocą strzykawki analitycznej dodaj 105 μl jodometanu do każdej próbki analitu. Natychmiast zakryj rurki analitowe, aby zminimalizować parowanie jodometanu. Dokładnie przemieszać i, jeśli to konieczne, krótko odwirować wszystkie próbki, aby upewnić się, że w nasadce nie pozostał żaden płyn. Każda zmiana koloru (np. na brązowy, fioletowy lub żółty) sygnalizuje degradację jodometanu, co może zagrozić następującej reakcji permetylacji.
   6. Przepłukać strzykawkę analityczną używaną do przenoszenia jodometanu z dichlorometanem co najmniej 3 razy. Zapobiegnie to zatykaniu się. Wypłucz to płuczkę wraz z dodatkowym jodometanem i dichlorometanem do naczynia na organiczne odpady niebezpieczne. Umieść zużyte probówki w pojemniku na odpady niebezpieczne.
   7. Zaopatrz się w nowy zestaw plastikowych probówek z bukłakiem o pojemności 2 ml. W razie potrzeby usuń zatrzaski.
   8. Odłącz mini filtry microfuge. Odwirować odłączone kolumny przez 15 sekund przy stężeniu 2 400 × g, a następnie wyrzucić probówki zbiornika wraz ze ściekami DMSO.
   9. Ponownie zatkaj odwirowane kolumny wirowe i umieść je w nowych probówkach zbiornika. Ponumeruj każdą kolumnę wirową i odpowiadającą jej rurkę zbiornika tym samym numerem próbki. Upewnij się, że zaślepki mini filtra są szczelne; Potencjalny wyciek może mieć wpływ na następny krok. Zminimalizuj czas między usunięciem DMSO z kolumn wirujących a przeniesieniem próbek analitu na kolumny wirujące.
   10. Permetylacja
       1. Ilościowo przenieść każdy roztwór próbki do odpowiedniej kolumny wirowej do mikrofugi wypełnionej kulkami NaOH. Do tego kroku użyj końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Po przeniesieniu zaciśnij ~2 mm końcówki końcówki o pojemności 200 μl i pozostaw ją w zawartości kolumny, aby użyć jej jako mieszadła. Powtórz te czynności dla wszystkich próbek.
          nuta: Niska lepkość jodometanu może powodować utratę próbki, ponieważ roztwór analitu może kapać z końcówki pipety podczas przenoszenia. Trzymaj probówkę z próbką i kolumnę wirową przylegające do siebie jedną ręką, a drugą ręką szybko przenieś roztwór próbki.
       2. Pozostawić reakcję permetylacji na 11 minut. W tym czasie każdą próbkę należy mieszać co najmniej 4-5 razy. Aby ułatwić wydajną permetylację, która zachodzi na powierzchni kulek NaOH, należy użyć końcówek do pipet z zaciskaną końcówką żelową jako mieszadeł, aby delikatnie wymieszać zawartość kolumny. Agresywne mieszanie może przebić filtr wirowy, sproszkować i zawiesić kulki NaOH (co może zmniejszyć skuteczność późniejszej ekstrakcji ciecz/ciecz) i/lub spowodować utratę próbki (ponieważ nasączone próbką granulki NaOH mogą z kolumny).
       3. Przygotowując się do kolejnego etapu ekstrakcji ciecz/ciecz, należy przygotować wystarczającą ilość 0,5 M roztworu chlorku sodu (NaCl) w 0,2 M buforze fosforanu sodu (pH 7,0), która ma być przechowywana w temperaturze pokojowej. Każda próbka będzie wymagała łącznie ~12 ml roztworu NaCl dla wszystkich trzech cykli ekstrakcji ciecz/ciecz.
       4. Po zakończeniu 11-minutowego okresu permetylacji, natychmiast, ale ostrożnie, odłączyć kolumny i odwirować je przez 15 sekund przy 2400 × g. Wyrzuć korki.
   11. Natychmiast wyjąć kolumny wirowe z wirówki i umieścić je w nowym zestawie pustych probówek ze zbiornikiem wirowym, pozostawiając za sobą płynny roztwór zawierający świeżo permetylowane glikany. Nie wyrzucaj niczego.
   12. Tak szybko, jak to możliwe, dodaj 300 μl acetonitrylu (ACN) do suchych, wypełnionych NaOH filtrów wirowych. Odwirować filtry wirowe przez 30 sekund przy 9 600 × g.
   13. Natychmiast po tym przenieść główny roztwór permetylacji (tj. roztwór, który inkubowano z kulkami NaOH przez 11 minut, a następnie odwirował przez filtr wirowy do probówki wirówkowej przed dodaniem 300 μl ACN w poprzednim kroku) do silanizowanych szklanych probówek⁴² o wymiarach 13 x 100 mm zawierających 3,5 ml 0,2 M buforu fosforanu sodu zawierającego 0,5 M NaCl, pH 7,0 i natychmiast wymieszać (wirować). Na tym etapie należy unikać przenoszenia jakichkolwiek stałych białych pozostałości. Zrób to dla każdej próbki przed przejściem do następnego kroku.
   14. Niezwłocznie przenieść (połączyć) wirowanie ACN w każdej probówce zbiornika z (z) resztą próbki cieczy w odpowiedniej szklanej probówce silanizowanej i natychmiast wymieszać (wirować). Również na tym etapie należy unikać przenoszenia jakichkolwiek stałych białych pozostałości. Zakryj, wstrząśnij i zawiruj szklaną rurkę. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki. Wyrzucić kolumny NaOH i pipety Pasteura do odpowiednich pojemników na odpady.
4. Ekstrakcja cieczy/cieczy i oczyszczanie glikanów
   1. Do każdej próbki dodać 1,2 ml chloroformu wewnątrz dygestorium. Natychmiast po tym zakryj rurki ze szkła silanizowanego i energicznie wymieszaj zawartość.
   2. Podgrzej wstępnie metalowe bloki do około 75 °C w kolektorze parowania. Używaj bloków grzewczych ze studzienkami, które mogą pomieścić szklane rurki 13 mm × 100 mm.
   3. Zaopatrz się w nowy zestaw silikonowanych pipet Pasteura, niesilanizowanych pipet Pasteura i probówek ze szkła silanizowanego z nakrętkami.
      ostrożność: Chloroform (CHCl₃) jest substancją drażniącą, mutagenną i potencjalnie rakotwórczą, która może przenikać przez niektóre rodzaje rękawic.
   4. Krótko odwirować (~3 000 × g) szklane probówki zawierające próbkę w celu oddzielenia warstwy wodnej i organicznej.
   5. Użyj niesilanizowanej pipety Pasteura, aby usunąć wystarczającą ilość górnej warstwy wodnej, tak aby ~3 mm warstwy wodnej pozostało nad dolną warstwą organiczną.
   6. Dodać 3,5 ml 0,5 M roztworu NaCl w 0,2 M buforze fosforanu sodu (pH 7) do każdej szklanej probówki, energicznie wymieszać i krótko odwirować (~3,000 × g). Podobnie jak w poprzednim kroku (1.4.3), użyj niesilanizowanej pipety Pasteura, aby usunąć warstwę wodną.
   7. Powtórzyć poprzedni krok (1.4.4), ale pozostawić ~1 ml warstwy wodnej.
   8. Użyj czystej silanizowanej pipety Pasteura, aby przenieść warstwę organiczną do czystej i odpowiednio oznakowanej silanizowanej szklanej probówki o średnicy 13×100 mm. Unikać zanieczyszczenia wodnego, ekstrahując w następujący sposób:
      1. Trzymaj zarówno obecne, jak i nowe probówki ze szkła silanizowanego przylegające do siebie w jednej ręce. Drugą ręką naciśnij bańkę pipety, aby utworzyć pęcherzyki, jednocześnie wkładając pipetę przez warstwę wodną.
      2. Po wejściu do warstwy organicznej przestań tworzyć pęcherzyki i trzymaj bańkę pipety stabilnie, aby umożliwić ustabilizowanie się i ponowne rozdzielenie warstw organicznych i wodnych. Następnie powoli zwolnij bańkę, aby usunąć jak najwięcej warstwy organicznej bez zanieczyszczenia wodnego.
      3. Szybko podnieś końcówkę pipety przez warstwę wodną i oprzyj się naturalnemu odruchowi lekkiego zwalniania bańki (co powoduje wycofanie części zanieczyszczenia wodnego) podczas wyjmowania pipety z probówki.
      4. Szybko przenieś warstwę organiczną o niskiej lepkości do sąsiedniej nowej probówki. Wszelkie zanieczyszczenia wodne będą widoczne jako małe kropelki cieczy na wierzchu ekstrahowanej warstwy organicznej w nowych szklanych probówkach. Jeśli widoczne jest zanieczyszczenie wodą/NaCl, usuń je pipetą; W razie potrzeby odwirować, aby zebrać kropelki wody w jedną kroplę.
   9. Prawidłowo zutylizuj stare szklane probówki, pipety oraz roztwory odpadów wodnych i organicznych. Umyj i poddaj recyklingowi szklane nakrętki tubek.
   10. Suszyć wszystkie próbki pod delikatnym i stałym strumieniem azotu w podgrzewanym kolektorze parowania w temperaturze 75 °C przez ~5 minut w dygestorium. Aby zapewnić chłodzenie wyparne podczas wszystkich etapów osuszania, delikatny i stały przepływ azotu musi zakłócać powierzchnię cieczy bez rozpryskiwania lub rozpryskiwania cieczy. Usunąć próbki z kolektora parowania po całkowitym wysuszeniu próbki końcowej. Białe plamki na dnie wysuszonej szklanej probówki wskazują na zanieczyszczenie buforem/NaCl.
   11. Wstrzymaj procedurę w tym miejscu, jeśli w ciągu dnia nie ma wystarczająco dużo czasu, aby zakończyć etap hydrolizy TFA. Tymczasowo (tj. przez noc) suche próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby kontynuować procedurę po przechowywaniu, należy wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozostawić je do całkowitego ogrzania przed odkorkowaniem.
   12. Podczas gdy próbki są ciepłe, w ramach przygotowań do hydrolizy kwasu trifluorooctowego (TFA) (następny etap), należy ustawić płaszcz grzewczy w taki sposób, aby temperatura zawartości cieczy w probówce osiągnęła 121 °C. Przygotować roztwór TFA z materiału wyjściowego TFA (patrz krok 2.1 poniżej).

2. Hydroliza kwasu trifluorooctowego (TFA)

Uwaga: Kwas trifluorooctowy (TFA) jest kwasem organicznym i toksycznym środkiem drażniącym.

1. Przygotować odpowiednią ilość 2,0 M roztworu TFA w wodzie dejonizowanej. Każda próbka analitu będzie wymagała 325 μl 2,0 M roztworu TFA. Skoncentrowane TFA wynosi 13,0 M.
2. Dodać 325 μl 2,0 M TFA do każdej próbki analitu. Aby zapobiec parowaniu tłuszczu tłuszczowego i utracie próbki podczas kolejnego etapu suszenia (ppkt 2.3 poniżej), natychmiast po dodaniu TFA szczelnie zamknąć każdą probówkę z próbką. Zaznacz poziom roztworu we wszystkich szklanych probówkach. Dokładnie zmieszaj każdą próbkę przed następnym krokiem.
3. Inkubować szczelnie zamknięte probówki z próbkami przez 2 godziny w odpowiednim, wstępnie nagrzanym bloku grzewczym lub piecu, tak aby zawartość osiągnęła temperaturę 121 °C. W przypadku korzystania z bloku grzewczego zamiast pieca, należy przykryć probówki z próbkami folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji tłuszczu tłuszczowego w górnej części probówki i częściowemu wysuszeniu pozostałości próbki na dnie probówki. Sprawdź poziom roztworu próbki po 20-30 minutach, aby upewnić się, że odparowanie TFA jest minimalne. W razie potrzeby dokręć nasadki dalej lub wymień nasadki, aby uzyskać ściślejsze dopasowanie.
4. Podczas 2-godzinnego oczekiwania ustawić kolejny kolektor parowania na 75 °C w celu wykonania następnego kroku (patrz 2.4 poniżej).
5. Po zakończeniu 2-godzinnego okresu grzewczego suszyć próbki w temperaturze 75 °C pod delikatnym strumieniem azotu przez ~15 minut. Nie pozostawiaj próbek bez nadzoru na dłużej niż 15 minut. Często sprawdzaj próbki i przerwij ogrzewanie i suszenie, gdy wszystkie próbki wyschną.
6. W tym miejscu należy wstrzymać procedurę, jeśli w ciągu dnia nie pozostało wystarczająco dużo czasu na wykonanie etapu redukcji. Próbki należy przechowywać tymczasowo (tj. przez noc) w temperaturze -80 °C. Aby kontynuować procedurę po przechowywaniu, wyjmij próbki z zamrażarki w temperaturze -80°C i pozwól im całkowicie się rozgrzać przed odsklepieniem.

3. Redukcja

1. Wewnątrz dygestorium przygotować wystarczającą ilość roztworu borowodorku sodu (NaBH₄) o stężeniu 10 g/l w 1 M wodorotlenku amonu (NH₄OH). Każda próbka będzie wymagała 475 μl tego roztworu. Przygotuj świeży roztwór dla każdej partii próbek. Stężony wodorotlenek amonu (27-30% w/w NH₃) wynosi około 14,5 M.
   ostrożność: Borowodorek sodu (NaBH₄) jest higroskopijną, reagującą z wodą toksyną i silnym środkiem drażniącym, który uwalnia się w kontakcie z wysoce łatwopalnymi oparami wody, które powodują poważne oparzenia przy wdychaniu, spożyciu lub kontakcie z oczami / skórą.
   ostrożność: Wodorotlenek amonu (NH₄OH) jest, drażniącym i toksycznym środkiem zdolnym do powodowania poważnych oparzeń i nieodwracalnych uszkodzeń narządów po wdychaniu, spożyciu lub kontakcie z oczami/skórą. Płucz dotknięte obszary wodą przez 30 minut i nie pozwól ofierze pocierać ani drapać dotkniętych obszarów.
2. Do każdej próbki dodać 475 μl 10 g/L NaBH₄ w 1 M NH₄OH. Dokładnie wymieszaj próbki, aby rozpuścić wszelkie pozostałości. Zakryj probówki i pozwól, aby reakcja redukcji trwała przez 1 godzinę.
3. Podczas 1-godzinnego oczekiwania ustawić podgrzewany kolektor parowania na 75 °C. Użyć bloku grzewczego z odpowiednimi dołkami na szklane rurki (patrz 3.4 poniżej).
4. Po zakończeniu 1-godzinnego okresu reakcji dodać 63 μl metanolu (MeOH) do każdej próbki. W tym i następnym etapie usuwa się pozostałości boru w postaci boranu trimetylu – stosunkowo lotnej cieczy, która wrze w temperaturze 68 °C.
5. Suszyć próbki (w podgrzanym kolektorze) w temperaturze 75 °C pod delikatnym strumieniem azotu gazowego przez ~15 min. Często sprawdzaj próbki i nie pozostawiaj ich bez nadzoru. Małe kropelki cieczy na dnie szklanych probówek wskazują, że próbka nie jest jeszcze sucha.
   nuta: Aby odróżnić pęcherzyki powietrza od kropelek cieczy, przechyl probówkę. Po przechyleniu poruszają się tylko kropelki cieczy, ale nie zawsze jest odwrotnie: jeśli bańka się nie porusza, nadal może być (bardzo małą) kroplą cieczy.
6. Po całkowitym wyschnięciu próbek należy przygotować roztwór metanolu (MeOH) i kwasu octowego (AcOH) w stosunku 9:1 (v/v). Dodać 125 μl tego roztworu MeOH:AcOH do każdej próbki.
7. Suszyć próbki (w wstępnie podgrzanym kolektorze) w temperaturze 75 °C pod delikatnym strumieniem azotu gazowego.
8. Gdy próbki są całkowicie suche, susz je próżniowo przez 20 minut w temperaturze pokojowej: Umieść próbki w plastikowej wannie próżniowej (takiej jak te sprzedawane przez FoodSaver), zamknij pokrywę odkurzacza, ustaw pokrętło podciśnienia w pozycji "próżnia", podłącz wąż próżniowy i włącz próżnię. Aby zdemontować odkurzacz, odwróć te kroki. Poczekaj, aż system całkowicie się rozpręży, zanim spróbujesz otworzyć pokrywę odkurzacza.
9. W tym miejscu należy wstrzymać procedurę, jeśli w ciągu dnia nie pozostało wystarczająco dużo czasu na wykonanie etapu redukcji. Próbki należy przechowywać tymczasowo (tj. przez noc) w temperaturze -80 °C. Aby kontynuować procedurę po przechowywaniu, należy wyjąć próbki z zamrażarki w temperaturze -80 °C i pozostawić je do całkowitego ogrzania przed odsklepieniem.
10. Czekając, aż próbki wyschną próżniowo (lub ogrzeją się, po przechowywaniu), przygotuj odczynniki do następnego kroku. Uzyskać i ponumerować fiolkę z autosamplerem ze stożkowym dnem (AS) (z nakrętką) dla każdej próbki. Ponadto należy podgrzać wstępnie zarówno płytko studzienkowy blok grzewczy AS z fiolką, jak i blok ze szklaną rurką z głęboką studnią, tak aby zawartość szklanej rurki osiągnęła temperaturę 50 °C.

4. Acetylacja (wykonywana w dygestorium)

1. Do każdej próbki dodać 18 μl wody dejonizowanej. Zakryj i dokładnie zwiruj wszystkie probówki, aby całkowicie rozpuścić wszelkie osady.
2. Dodać 250 μl bezwodnika octowego do każdej szklanej probówki. Zakryj, dokładnie zwiruj i poddaj sonikacji w łaźni wodnej przez 2 minuty, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie wszelkich pozostałości i osadów.
3. Przykryć szklane probówki folią aluminiową i inkubować w temperaturze wewnętrznej 50 °C przez 10 minut.
4. Dodać 230 μl stężonego kwasu trifluorooctowego (TFA) do każdej próbki. Natychmiast zakryj i wymieszaj próbki. Następnie inkubować próbki przykryte folią aluminiową przez 10 minut w temperaturze wewnętrznej 50 °C.
5. Po inkubacji dodać 1,8 ml dichlorometanu (CH₂Cl₂) do każdej próbki. Zakręć i dobrze wymieszaj.
6. Do każdej próbki dodać 2,0 ml wody dejonizowanej. Dobrze zakręć i wymieszaj próbki. Odwirować od 0 do 3 000 × g, aby oddzielić warstwy. Użyj niesilanizowanej pipety Pasteura, aby przeprowadzić ekstrakcję ciecz/ciecz, jak opisano w kroku 1.4.6, unikając zanieczyszczenia wody.
7. Powtórz ekstrakcję jeszcze raz, w sumie dwie ekstrakcje. Użyj silanizowanych pipet Pasteura, aby przenieść warstwę organiczną do oznakowanych silanizowanych fiolek AS (bezpiecznie trzymanych w stojaku na AS). Napełnij fiolki AS tuż poniżej ronda.
8. Do suszenia próbek (w fiolkach z AS) przez 15 minut w temperaturze 40 °C w atmosferze azotu należy użyć wstępnie podgrzanego, płytkiego bloku grzewczego. Nie suszyć nadmiernie. Produkty końcowe są znane jako częściowo metylowane octany aldytolu (PMAA).

5. Chromatografia gazowa – spektrometria mas (GC-MS)

1. Każdą próbkę rozpuścić w 100 μl acetonu i dobrze wymieszać. Za pomocą automatycznego podajnika próbek wstrzyknąć 1 μl każdej próbki w trybie dzielonym do linera GC z podziałem (utrzymywanego w temperaturze 280 °C i zawierającego małą zatyczkę z silanizowanej waty szklanej). Użyj współczynnika podziału 40. Stosować hel jako gaz nośny w trybie stałego przepływu z prędkością 0,8 ml/min przez 30-metrową kolumnę DB-5ms GC o średnicy wewnętrznej 0,25 mm i grubości warstwy 0,25 mikrona.
2. Utrzymuj początkową temperaturę piekarnika GC na poziomie 165 °C przez 0,5 minuty. Po początkowym czasie podtrzymania należy zaprogramować piec tak, aby przy każdym przebiegu podnosił temperaturę od 165 °C do 265 °C z prędkością 10 °C/min (co zajmuje 10 minut), a następnie natychmiast zwiększał temperaturę z 265 °C do 325 °C z prędkością 30 °C/min (co trwa 2 minuty) i utrzymywał temperaturę na poziomie 325 °C przez 3 minuty. Całkowity czas pracy na próbkę wynosi 15,5 min.
3. Za pomocą odpowiednio dostrojonego i skalibrowanego spektrometru masowego należy poddać składniki próbki eluujące z kolumny GC jonizacji elektronów (EI, 70 eV w temperaturze 250 °C). W przypadku analizatora masy TOF analizuj fragmenty od m/z 40 do m/z 800 z szybkością sumowania impulsów 0,1 sekundy. Ustaw czas opóźnienia rozpuszczalnika EI-filament na 2,5 minuty.

6. Analiza danych

1. W przypadku korzystania z analizatora masy TOF, należy zsumować najliczniejsze i/lub diagnostyczne jony fragmentacyjne dla każdego PMAA, stosując okno masowe 0,15 Da w celu uzyskania wyekstrahowanego chromatogramu jonowego. Jony docelowe dla każdego PMAA zostały opublikowane gdzie ^indziej,33 ale wprowadzono następujące zmiany: jony t-Glc wynoszą teraz 145,1 + 205,1; Jony 2-osobowe to 161,1 + 189,1; Jony 3-Gal to 161,1 + 233,1, jony 6-Gal to 161,1 + 189,1 + 233,1; Jon 2,6-Man wynosi 189.1; Jony 3,6-osobowe to 189,1 + 233,1.
2. Użyj QuanLynx lub innego oprogramowania, aby automatycznie zintegrować obszary pików dla każdego zsumowanego chromatogramu jonowego.
3. Ręcznie zweryfikuj wyniki integracji, przeglądając każdy zintegrowany chromatogram jonowy wyekstrahowany. Następnie wyeksportuj dane integracji pików do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy i normalizacji danych, co polega na podzieleniu obszaru każdego pojedynczego szesnastkowego XIC przez sumę wszystkich obszarów szesnastkowych XIC; podobnie, powierzchnia każdego pojedynczego HexNAc XIC jest dzielona przez sumę wszystkich obszarów HexNAc XIC. Ta procedura daje znormalizowane obfitości dla każdej pojedynczej heksozy i HexNAc.

Wyniki

Chromatogram całkowitego prądu jonowego (TIC) pokazujący udaną permetylację, hydrolizę, redukcję i acetylację próbek ludzkiego osocza krwi w odniesieniu do przypadków, w których dwa krytyczne etapy permetylacji zostały wykonane nieprawidłowo, pokazano na rysunku 3.

Bezwzględna wydajność HexNAcs w stosunku do Hexoses:

N-acetyloheksozam...

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, udana produkcja częściowo metylowanych octanów aldytolu (PMAA) z heksoz jest obarczona mniejszymi trudnościami i jest bardziej niezawodna niż udana produkcja N-acetyloheksozaminy (HexNAc) PMAA. Dokładny mechanizm stojący za tym zjawiskiem, który rozgrywa się na każdym etapie tej procedury, jest nieznany, ale musi odnosić się do unikalnej chemii grupy N-acetylowej (a nie grupy hydroksylowej), która jest unikalna dla HexNAcs w stosunku do heksoz. Mechanizm stojący za tym zjawiskiem, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kulki wodorotlenku sodu	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, klasa odczynnika 97%
Kolumna wirująca 0,9 ml	69705	Pierce oddział ThermoFisher Scientific	Zawiera  korki i frytki z polietylenu
Fiolka z autosamplerem GC-MS (silanizowana)*	C4000-9		Fiolka o wysokim odzysku ThermoFisher Scientific Target DP, 1,5  ml, 12  mm x 32  mm, zawiera nasadki do przekłuwania wyłożone teflonem
1,5 ml probówki polipropylenowe	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Pokrywka z zatrzaskiem
Probówki polipropylenowe 2 ml	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Pokrywka z zatrzaskiem
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioOdczynnik do biologii molekularnej, klasa odczynnika >99,0%
Jodometan	I8507	Sigma-Aldrich	Zawiera miedź jako stabilizator, ReagentPlus 99%
Acetonitryl	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Mikrowirówka	75002436: Wirówka Sorvall Legend Micro 17	ThermoFisher Scientific	Rotor 24 x 1,5/2,0 z pokrywą biohermetyczną ClickSeal. Numer katalogowy wirnika: 75003424
Probówka szklana 13 x 100 (silanizowana)*	53283-800	VWR	13 mm x 100 mm probówki ze szkła borokrzemianowego z nakrętką
Zaślepki do szklanych probówek	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble&handel; Czarne fenolowe nakrętki; 13  mm-415 Gwint GPI; Gumowa wkładka pokryta PTFE.
Chlorek sodu	S7653	Sigma-Aldrich	> 99,5% czystości
Chloroform	4440-08	Macron Chemikalia wysokowartościowe
Kwas trifluorooctowy	299537	Sigma-Aldrich	99% oczyszczone przez redestylację do sekwencjonowania białek
Borowodorek sodu	71321	Fluka Analytical	99%
Roztwór wodorotlenku amonu	320145	Sigma-Aldrich	Zawartość NH3: 28,0-30,0%
Metanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Kwas	Jackson klasy HPLC
	320099	Sigma-Aldrich	99,70%
Plastikowy eksykator próżniowy	Dowolny model o odpowiedniej wielkości	FoodSaver
	539996	Sigma-Aldrich	99,50%
Dichlorometan	D143SK-4	ThermoFisher Naukowy	Stabilizowany gatunek HPLC
Aceton	9006-03	J.T.Baker	Baker Analizowane
Podgrzewany kolektor parowania (jednostka główna)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Moduł grzewczo-mieszający; Model trzyblokowy z funkcją podgrzewania i mieszania
Podgrzewany kolektor parowania (parownik górny)	pi18826	ThermoFisher Scientific	Parownik ThermoScientific* Reacti-Vap, 27-portowy; Do stosowania z modułem grzewczym Reacti-Therm z potrójnym blokiem
Aluminiowe bloki uchwytu na próbki do kolektora parownika	pi18816	ThermoFisher Scientific	Blok, Aluminium, Reacti-Block S-1, Mieści 13  Probówki o średnicy mm, 13 otworów (14  mm śr. x 45  mm głębokość)
Chromatograf gazowy	Model A7890	Agilent	Wyposażony w automatyczny podajnik próbek CTC PAL
Spektrometr masowy	GCT Premier (czas przelotu)	Wody
Wkładka typu split-mode (dezaktywowana / silanizowana)	5183-4647	Agilent	Zawierająca małą zatyczkę z silanizowanej wełny szklanej
DB-5ms GC kolumna	122-5532	Agilent	30 m x 0,25 mm ID x 0,25 mikrona grubość folii
Chlorotrimetylosilan	95541	Sigma-Aldrich
Szklany eksykator próżniowy (do silanizacji wyrobów szklanych)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" szerokości; rozmiar
*Silanizacja szkła jest przeprowadzana we własnym zakresie, przez noc przy użyciu oparów chlorotrimetylosililanu w dużym szklanym eksykatorze próżniowym.