Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez komisję etyki badań z udziałem ludzi / Instytucjonalną Komisję Przeglądową (Institutional Review Board) w Academia Sinica, Tajwan.
1. Przygotowanie bodźców i programu eksperymentalnego
- Przygotuj zbiór ponad 60 zdjęć twarzy wyrażających emocje29, podzielonych na trzy kategorie wyrazów twarzy (gniewny, radosny i neutralny). Użyj oprogramowania graficznego, aby zamaskować włosy i uszy na zdjęciach czarnym tłem, jak pokazano na Ryc. 1A, tak aby uczestnicy mogli skoncentrować się na rysach twarzy na fotografiach.
- Otwórz zdjęcie w oprogramowaniu graficznym. Użyj narzędzia zaznaczania, aby narysować obszar eliptyczny i dostosuj jego rozmiar tak, aby uszy i większość włosów nie znajdowały się wewnątrz elipsy.
- Odwróć zaznaczenie. Kliknij „usuń”, aby usunąć niepożądany obszar zdjęcia i zastąpić go czarnym kolorem tła.

Rycina 1. Przykłady bodźców emocjonalnych twarzy. (A) fotografie twarzy, na których włosy i uszy zostały zamaskowane kolorem czarnego tła, oraz (B) rysunki liniowe twarzy, opracowane na podstawie zdjęć z (A) za pomocą oprogramowania graficznego. Twarze przedstawiają odpowiednio od góry do dołu emocje: neutralną, radosną i gniewną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- Przeprowadź badanie pilotażowe. Zrekrutuj uczestników pilotażu w celu wyboru odpowiednich bodźców z puli fotografii.
Uwaga: Uczestnicy pilotażu nie powinni brać udziału w eksperymencie EEG.
- Skonfiguruj program prezentacji bodźców, zaczynając od pierwszego ekranu komputera prezentującego instrukcje do zadania, a następnie 5 prób zapoznawczych. Każdą próbę rozpocznij od krzyżyka fiksacyjnego, po którym następuje bodziec w postaci twarzy, a następnie zadanie oceny emocjonalności. Przykładowy program znajduje się w Pliku z Kodem Uzupełniającym.
Uwaga: Właściwe próby pilotażowe następują bezpośrednio po próbach zapoznawczych poprzez wybieranie fotografii twarzy w losowej kolejności z puli.
- Stwórz program eksperymentalny, obejmujący ekrany instrukcji oraz centralny ekran fiksacji wzroku. Stwórz ekran bodźca twarzy zgodnie z ilustracją na Rysunku 2, konfigurując rozmiar fotografii na 18,3 x 24,4 cm2 (szerokość x wysokość) z czarnym tłem, przy rozmiarze ekranu komputera 41 x 25,6 cm2 i rozdzielczości 1 680 x 1 050. Przykładowy program znajduje się w Pliku z Kodem Uzupełniającym.
- W programie stwórz system punktacji do oceny emocjonalności, zgodnie z ilustracją na Rysunku 3. Umieść w centrum ekranu linię poziomą w skali ciągłej od -100 do +100, bez żadnych podziałek, z wyjątkiem punktu centralnego i krańcowych. Przygotuj program tak, aby uczestnicy mogli swobodnie oceniać emocjonalność fotografii twarzy, przesuwając kursor punktacji w lewo dla bardzo gniewnej (-100) i w prawo dla bardzo szczęśliwej (+100), a następnie naciskając przycisk GO.
Uwaga: Linia punktacji została zaprojektowana bez podziałek, ponieważ pacjenci z AS mogą mieć tendencję do nadmiernego skupiania się na precyzyjnym ustawieniu kursora między kreskami podczas oceny emocjonalności. Dlatego w przypadku pacjentów preferowana jest skala ciągła.
- Upewnij się, że program rejestruje wyniki behawioralne uczestnika (np. czas reakcji i wyniki emocjonalności), które służą jako kryteria wyboru fotografii z puli (patrz krok 1.3.1).
- Zrekrutuj uczestników pilotażu (5 osób do grupy kontrolnej i 5 pacjentów z AS). Zdiagnozuj pacjentów klinicznych zgodnie z kryteriami Gillberga30 oraz DSM-IV26 i przeprowadź kliniczną skróconą wersję Skali Inteligencji Dorosłych Wechslera (WAIS-III)31. Dopasuj grupę kontrolną do odpowiedników z AS jak najdokładniej pod względem płci oraz wyników IQ werbalnego/wykonawczego.
- Przeprowadź procedurę eksperymentalną w badaniu pilotażowym dla każdego uczestnika z osobna. Po zakończeniu zadania rozpoznawania emocji na twarzy, przeprowadź wywiad z każdym uczestnikiem z grupy AS na temat odpowiedniego czasu trwania centralnej fiksacji wzroku i okresów prezentacji bodźców, trudności zadania, łatwości obsługi systemu punktacji oraz maksymalnej liczby prób pozwalającej na utrzymanie koncentracji; na tej podstawie program może zostać ponownie skonfigurowany na potrzeby eksperymentu EEG (patrz krok 1.3.2).

Rysunek 2. Zrzut ekranu bodźca w postaci twarzy w programie. Rozmiar twarzy jest skonfigurowany tak, aby dopasować się do wysokości ekranu. Pusta przestrzeń jest wypełniona kolorem czarnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zrzut ekranu systemu punktacji do oceny emocjonalności. Pasek punktacji został zaprojektowany bez podziałki. Uczestnik musi przeciągnąć myszą, aby wybrać ocenę przypisaną do twarzy, a następnie nacisnąć przycisk GO, aby zakończyć zadanie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Program dla zadania 1: Sesja z fotografiami.
- Wybierz z puli 30 fotografii, po 10 dla wyrazów twarzy radosnych, gniewnych i neutralnych (po 5 twarzy męskich i 5 żeńskich dla każdego typu wyrazu), które zapewniają najbardziej porównywalne średnie czasy reakcji oraz średnie wyniki emocjonalności pomiędzy 5 uczestnikami pilotażowymi z AS a 5 uczestnikami z grupy kontrolnej.
- Zaktualizuj konfiguracje programu eksperymentalnego, uwzględniając uwagi od pacjentów z badania pilotażowego, takie jak optymalny czas centralnej fiksacji wzroku (t.j. 1,000 msec), czas prezentacji bodźca (t.j. 1,000 msec), odstęp między bodźcami (t.j. losowo przypisany w przedziale od 4 do 7 sec) oraz skala systemu punktowego (t.j. od -100 do 100). Dodaj w programie pięć prób zapoznawczych przed 30 próbami eksperymentalnymi.
- Zmień liczbę bodźców i odstępy czasowe w zewnętrznym pliku tekstowym konfiguracji powiązanym z programem eksperymentalnym.
Uwaga: Plik tekstowy może być modyfikowany w celu dostosowania do różnych warunków eksperymentalnych bez ingerencji inżynierów oprogramowania.
- Nie wliczaj pięciu fotografii do prób zapoznawczych do 30 wybranych fotografii. Nie wykorzystuj danych EEG ani danych behawioralnych zarejestrowanych podczas prób zapoznawczych w analizie danych.
- Program dla zadania 2: Sesja z rysunkami liniowymi.
- Stwórz rysunki liniowe na podstawie 35 fotografii (5 do prób zapoznawczych, 30 do prób eksperymentalnych) użytych w zadaniu 1, obrysowując krawędzie każdej twarzy. Użyj oprogramowania graficznego, aby przekształcić fotografie w skali szarości w czarno-białe rysunki liniowe, jak pokazano na Rysunku 1B.
Uwaga: Poniższe kroki edycji fotografii są jednym z możliwych rozwiązań tworzenia rysunków liniowych.
- W oprogramowaniu graficznym dostosuj jasność/kontrast fotografii tak, aby oryginalna intensywność skali szarości w większości pikseli stała się albo czarna, albo biała.
- Zastosuj „efekt szkicu” (sketch effect) w menu „efekty” lub „filtry” oprogramowania do fotografii w skali szarości, tak aby zachować jedynie kontury części o wysokiej częstotliwości przestrzennej, a następnie zastosuj „efekt zużycia” (distress effect), aby zwiększyć rozszerzenie linii konturowych.
- Użyj dowolnego narzędzia pędzla, aby wzmocnić kontury, oraz narzędzia gumki, aby usunąć niepożądane fragmenty. Upewnij się, że zachowano istotne cechy twarzy, porównując na bieżąco oryginalną fotografię z jej odpowiednikiem w formie rysunku liniowego.
- Wykonaj kopię programu z zadania 1 z kroku 1.3, aby stworzyć program dla zadania 2, i zastąp 35 fotografii z zadania 1 odpowiadającymi im rysunkami liniowymi.
2. Procedura rejestracji EEG
- Przygotowania
- Zrekrutować 10 zdrowych osób kontrolnych i 10 pacjentów z AS do eksperymentów EEG, zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji etyki badań z udziałem ludzi/Instytucjonalnej Rady Przeglądowej (Institutional Review Board).
- Przeprowadź skróconą wersję testu WAIS-III31 do pacjentów z AS indywidualnie przed rozpoczęciem eksperymentów, a następnie dobrać grupę kontrolną tak, aby osoby te w jak największym stopniu odpowiadały pacjentom pod względem płci oraz wyników ilorazu inteligencji (IQ) w testach werbalnych i wykonawczych.
- Rejestracja EEG
- Posadź uczestnika na wygodnym krześle w wygłuszonej (słabo oświetlonej) komorze i ustaw krzesło tak, aby ekran komputera znajdował się 60 cm przed uczestnikiem. Po zapoznaniu uczestnika z procedurą eksperymentalną poproś go o wypełnienie formularzy zgody oraz odpowiedzi na kilka pytań dotyczących jego dominującej ręki.
- Do rejestracji EEG należy użyć czepka EEG z 132 elektrodami Ag/AgCl (w tym 122 elektrod EEG w systemie 10-10 oraz bipolarnych elektrod VEOG, HEOG, EKG i EMG, wraz z sześcioma kanałami mięśni twarzy). Czepek należy podłączyć do dwóch wzmacniaczy 64-kanałowych z analogowym filtrem pasmowoprzepustowym 0,1–100 Hz w celu cyfryzacji surowych danych EEG przy częstotliwości próbkowania 1 000 Hz.
- Załóż standardną czapeczkę EEG z 128 kanałami na głowę każdego uczestnika. Dopasuj czapeczkę tak, aby elektroda z oznaczeniem „reference” znajdowała się w pozycji „Cz”, która jest zlokalizowana względem punktów orientacyjnych linii środkowej przedniej/tylnej (t. j., środek odległości między nasionem a inionem), oraz do punktów orientacyjnych po lewej/prawej stronie (t. j., środek lewego/prawego przeciwprzewlekłego), zgodnie z międzynarodowym systemem EEG 10/10.
- Ostrożnie, za pomocą tępej igły, wstrzyknij żel przewodzący do wszystkich elektrod. Powoli mieszaj żel igłą wewnątrz elektrody, aby zapewnić dobry kontakt żelu pomiędzy skórą głowy a elektrodą (t. j., aby utrzymać impedancję poniżej 5 kΩ). Należy stale kontrolować stan kontaktu żelu przy elektrodach oznaczonych jako „reference” i „ground” na czepku EEG, aby upewnić się, że pomiar impedancji jest prawidłowy.
- Obserwuj impedancję elektrod, korzystając z ekranu impedancji elektrod obsługiwanego przez oprogramowanie do rejestracji EEG (np. SCAN 4.5 w niniejszym badaniu), który zazwyczaj towarzyszy systemowi EEG. Na ekranie elektrody są wyświetlane w kolorach, a różne kolory wskazują poziomy impedancji.
- Umieść jedną elektrodę HEOG w kąciku jednego oka (punkt dodatni), a drugą elektrodę w kąciku drugiego oka (punkt ujemny); jedną elektrodę VEOG powyżej, a drugą poniżej lewego oka; bipolarne elektrody EKG na grzbietach lewej i prawej dłoni; bipolarne elektrody EMG w przestrzeni między kciukiem a palcem wskazującym prawej dłoni oraz sześć elektrod twarzowych wokół brwi i policzków.
- Zapisz w notatniku te wadliwe kanały, w których impedancja przekracza 5 kΩ, lub zapisz bezpośrednio zrzut ekranu pokazujący impedancję na wszystkich elektrodach. Wykorzystaj te informacje w przyszłości do odrzucenia wadliwych kanałów na etapie przetwarzania danych EEG.
- Należy zarejestrować EEG w stanie spoczynku po poinstruowaniu uczestnika, aby zamknął oczy na 12 min. W tym czasie należy dwukrotnie sprawdzić jakość strumienia EEG w czasie rzeczywistym, wyświetlanego na ekranie za pomocą oprogramowania do rejestracji EEG.
Uwaga: W warunkach z zamkniętymi oczami, w porównaniu z warunkami z otwartymi oczami, w kanałach potylicznych powinny występować wyraźne fale alfa. Jeśli fale alfa są zbyt zaszumione (pomijając kanały uszkodzone) lub zniekształcone, należy wrócić do kroku 2.2.4 i skorygować kontakt z żelem.
- Należy rozpocząć dwa zadania eksperymentalne w kolejności zrównoważonej (counter-balanced) pomiędzy uczestnikami. Rejestrację EEG należy rozpocząć, klikając ikonę nagrywania na ekranie w oprogramowaniu do rejestracji.
- Po zapoznaniu się z instrukcją zadania wyświetloną na ekranie, każdy uczestnik powinien wykonać 5 prób zapoznawczych, a następnie 30 prób właściwych. Zastosować taką samą procedurę zarówno dla zadań ze zdjęciami, jak i z rysunkami liniowymi. W instrukcji zadania należy zachęcić uczestników do jak najszybszego przypisania oceny emocjonalności bodźca w postaci twarzy.
- WAŻNE: Należy sprawdzić programy przygotowane w krokach 1.3.2 i 1.4.2 pod kątem poprawnego przesyłania do oprogramowania rejestrującego zdarzeń zsynchronizowanych czasowo z początkiem fiksacji wzroku w centrum, prezentacją bodźca twarzy oraz naciśnięciem przycisku GO podczas oceny emocjonalności. Czasy rozpoczęcia te są kodowane numerycznie i mogą być weryfikowane na ekranie obsługiwanym przez oprogramowanie rejestrujące.
Uwaga: uczestnik może zrobić przerwę pomiędzy dwoma zadaniami. W trakcie przerwy nie rejestrowano sygnału EEG.
- użyj digitalizatora (np. digitizer 3D Polhemus FASTRAK (użyty w niniejszym badaniu), aby zarejestrować trójwymiarowe pozycje elektrod i zapisać je w pliku (np. (plik .3dd lub .dat) do korejestracji czapek EEG pomiędzy uczestnikami w analizie danych.
- Po zakończeniu badania EEG poproś uczestnika o wypełnienie kwestionariusza składającego się z 35 pytań, dotyczącego jego zachowań i odczuć podczas eksperymentu EEG (np., odczuwają negatywne emocje, prawie zasnęli), a następnie przekazać im wynagrodzenie za udział w eksperymencie.
- Zaprowadź uczestnika do łazienki, aby umyć i wysuszyć jego włosy.
- Oczyścić i wysterylizować czepek EEG zgodnie z instrukcjami klinicznymi.
3. Przetwarzanie danych EEG
Uwaga: Polecenia oprogramowania podane w tej sekcji są specyficzne dla programu EEGLAB.
- Przefiltruj sygnały EEG, stosując filtr górnoprzepustowy 1 Hz i filtr dolnoprzepustowy 50 Hz poprzez wywołanie funkcji pop_eegfilt.m32.
Uwaga: W przypadku krajów, w których częstotliwość sieci elektrycznej wynosi 50 Hz, należy zastosować filtr dolnoprzepustowy 40 Hz
- Odrzuć kanały wadliwe o impedancji wyższej niż 5 kΩ po sprawdzeniu impedancji elektrod zarejestrowanej w kroku 2.2.6. Odrzuć kanały wadliwe o widmie mocy znacząco różniącym się od kanałów sąsiednich poprzez wizualną inspekcję cech widma mocy (np. wartości maksymalnej, krzywizny itp.) w każdym kanale.
- Oblicz i wykreśl widmo mocy sygnału EEG poprzez wywołanie funkcji pop_spectopo.m32.
- Wykonaj ponowne odniesienie (re-referencing) sygnałów EEG do średniej z kanałów mózgowych z pominięciem kanałów wadliwych poprzez wywołanie funkcji pop_reref.m.
- Podziel zapisy EEG na epoki zsynchronizowane z bodźcem, z których każda obejmuje zakres od -2,0 s przed do 1,5 s po wystąpieniu bodźca. Skoryguj linię bazową (od -2,0 do -1,2 s przed wystąpieniem bodźca) poprzez odjęcie średniej z wartości linii bazowej od każdej epoki.
- Wywołaj odpowiednio funkcje pop_epoch.m oraz pop_rmbase.m. Wybierz interwał linii bazowej przed okresem centralnej fiksacji wzroku i wystąpieniem bodźca w postaci twarzy.
- Oznacz epoki wadliwe, które wydają się zawierać artefakty. Odrzuć epoki wadliwe, zachowując epoki zanieczyszczone mrugnięciami oczu. Epoki z artefaktami zazwyczaj wyglądają na zaszumione lub mają ekstremalnie wysoką wartość szczytową (np. wyższą niż 100 µV) w porównaniu z typowymi epokami.
- Wywołaj funkcję pop_rejmenu.m, aby uruchomić procedurę półautomatyczną. Pojawi się okno interakcji, umożliwiające użytkownikowi ponowne potwierdzenie automatycznie wybranych epok wadliwych poprzez inspekcję wizualną. Chociaż większość epok jest zanieczyszczona mrugnięciami oczu, epoki te można tymczasowo zachować do późniejszego usunięcia za pomocą analizy niezależnych komponentów (ICA)33 w kroku 3.8.
- Po odrzuceniu kanałów i epok wadliwych, przeprowadź analizę ICA na oczyszczonych danych EEG przy użyciu funkcji pop_runica.m.
- Spośród oszacowanych komponentów niezależnych (IC) zidentyfikuj artefakty wynikające z ruchów/mrugnięć oczu, aktywności mięśniowej, tętna oraz zakłóceń sieciowych32.
Uwaga: Znacząco wysoka korelacja (R2 >0,9) między wartościami IC danego komponentu a wartościami wszystkich kanałów referencyjnych (VEOG, HEOG, EKG i kanały twarzowe) wskazuje, że komponent ten wynika głównie z artefaktów. Oszacowane wartości IC wyjaśnione przez artefakty można usunąć za pomocą analizy regresji wielokrotnej.
- Usuń komponenty IC będące artefaktami i oszacuj czyste sygnały EEG, które są pochodną iloczynu macierzy mieszania ICA i macierzy wartości IC oczyszczonej z artefaktów. Zapisz czyste sygnały EEG do dalszej analizy.
- W macierzy wartości IC zachowaj reszty z predykcji komponentów IC artefaktów (R2 >0,9) z referencyjnych kanałów VEOG, HEOG, EKG i kanałów twarzowych. Usuń pozostałe komponenty IC artefaktów za pomocą funkcji pop_subcomp.m. Funkcja ta zwraca sygnały EEG oczyszczone z artefaktów.
4. Analiza statystyczna
- Podziel kanały EEG na jedenaście jednorodnych obszarów, aby zmniejszyć liczbę porównań statystycznych w analizach ERP i ERSP, tj.: lewy przedczołowy (10 kanałów), środkowy przedczołowy (14) i prawy przedczołowy (10); lewy skroniowy (13) i prawy skroniowy (13); lewy centralny (9), środkowy centralny (14) i prawy centralny (9); lewy ciemieniowo-potyliczny (9), środkowy ciemieniowo-potyliczny (12) i prawy ciemieniowo-potyliczny (9), jak pokazano na Ryc. 4. Obszary te zostały zdefiniowane zgodnie z anatomią funkcjonalną kory34. Jednorodność funkcjonalna sygnałów EEG w tych obszarach została potwierdzona w różnych eksperymentach13,35,36.

Rycina 4. Podział kanałów. Kanały są podzielone na jedenaście regionów. LF: lewy czołowy (10 kanałów), MF: środkowy czołowy (14), RF: prawy czołowy (10), LT: lewy skroniowy (13), RT: prawy skroniowy (13), LC: lewy centralny (9), MC: środkowy centralny (14), RC: prawy centralny (9), LP: lewy potyliczno-ciemieniowy (9), MP: środkowy potyliczno-ciemieniowy (12), RP: prawy potyliczno-ciemieniowy (9). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Wczytaj oczyszczone zapisy EEG z kroku 3.8. Oblicz ERP dla poszczególnych kanałów poprzez uśrednienie sygnałów z epok w każdym kanale oraz ERP regionalne poprzez uśrednienie ERP w obrębie tego samego regionu.
Uwaga: Gdy zapisy EEG są wczytywane za pomocą funkcji pop_loadset.m w EEGLAB, sygnały są przechowywane w zmiennej strukturalnej „EEG.data” w tablicy o wymiarach kanał-czas-epoka.
- W oknie poleceń Matlab oblicz ERP dla kanałów, uśredniając EEG.data w obrębie epok dla każdego kanału (np. channelERP = mean(EEG.dat,3)). Oblicz regionalne ERP poprzez uśrednienie ERP kanałów w obrębie każdego regionu zgodnie z podziałem z punktu 4.1 (np. regionalERP = mean(channelERP(index,:),1), gdzie „index” oznacza indeksy kanałów w danym regionie).
- Oblicz ERSP dla kanałów, stosując transformację czasowo-częstotliwościową (np. transformację falkową) do sygnałów epok w każdym kanale, oraz regionalne ERSP poprzez uśrednienie ERSP kanałów w tym samym regionie.
- Wykonaj transformację czasowo-częstotliwościową, wywołując funkcję pop_newtimef.m.
Uwaga: W niniejszym badaniu wpis „wavelet cycles” ustawiono na [1, 0.5], a „baseline” na [-2,000 do -1,200] msec. Wynikowe ERSP dla kanałów zostaną zapisane w tablicy o wymiarach częstotliwość-czas-kanał.
- W oknie poleceń Matlab oblicz regionalne ERSP, uśredniając ERSP w obrębie kanałów w każdym regionie zgodnie z podziałem z punktu 4.1 (np. regionalERSP = mean(channelERSP(:,:,index),3), gdzie „channelERSP” jest wynikiem funkcji pop_newtimef.m, a „index” oznacza indeksy kanałów w danym regionie).
- Oblicz wartości średnie w różnych przedziałach czasowych (np. 50-150, 150-250, 250-350, 350-450 msec) dla regionalnych ERP. Oblicz wartości średnie w różnych przedziałach czasowo-częstotliwościowych (np. 50-150, 150-250, 250-350, 350-450, 450-800 msec w zakresie 1-7 Hz oraz 200-800 msec w zakresie 8-30 Hz) dla regionalnych ERSP.
- Zastosuj analizę MANOVA w oprogramowaniu statystycznym (np. IBM SPSS) dla wartości średnich regionalnych ERP i ERSP, aby ocenić efekty główne dla zadania (fotografia vs rysunek liniowy), regionu (jedenaście regionów skóry głowy) i grupy (AS vs kontrolna), a także efekty interakcji między zadaniem, regionem i grupą.
- W analizie statystycznej uwzględnij płeć (mężczyzna vs kobieta) jako współzmienną i oszacuj efekty główne oraz interakcje, utrzymując efekt płci na stałym poziomie.