Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Podsumowanie

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Streszczenie

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem (LSFM) zyskuje coraz większą popularność jako metoda obrazowania rozwoju embrionalnego. Głównymi zaletami LSFM w porównaniu z systemami konfokalnymi są niska fototoksyczność, delikatne strategie montażu, szybka akwizycja z wysokim stosunkiem sygnału do szumu oraz możliwość obrazowania próbek pod różnymi kątami (widokami) przez długi czas. Obrazowanie z wielu widoków uwalnia pełny potencjał LSFM, ale jednocześnie może tworzyć zestawy danych o rozmiarze terabajta. Przetwarzanie takich zbiorów danych jest największym wyzwaniem związanym z korzystaniem z LSFM. W tym protokole przedstawiamy kilka rozwiązań tego problemu. Do niedawna LSFM był wykonywany głównie w laboratoriach, które posiadały doświadczenie w budowie i obsłudze własnych mikroskopów arkuszowych. Jednak w ciągu ostatnich trzech lat pojawiło się kilka komercyjnych implementacji LSFM, które są uniwersalne i łatwe w użyciu dla każdego biologa rozwojowego. Niniejszy artykuł skierowany jest przede wszystkim do tych badaczy, którzy nie są twórcami technologii LSFM, ale chcą wykorzystać LSFM jako narzędzie do odpowiedzi na konkretne pytania z zakresu biologii rozwojowej.

Tutaj używamy obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego jako przykładu, aby zapoznać czytelnika z technologią LSFM i demonstrujemy zastosowania LSFM w wielu skalach przestrzennych i czasowych. W tym artykule opisano kompletny protokół eksperymentalny, rozpoczynający się od zamontowania zarodków danio pręgowanego do LSFM. Następnie przedstawiamy opcje obrazowania za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Co ważne, wyjaśniamy również potok późniejszej rejestracji i fuzji zestawów danych multiview przy użyciu rozwiązania open source zaimplementowanego jako wtyczka Fidżi. Chociaż protokół ten koncentruje się na obrazowaniu rozwijającego się oka danio pręgowanego i przetwarzaniu danych z określonej konfiguracji obrazowania, większość przedstawionych tutaj spostrzeżeń i sugestii dotyczących rozwiązywania problemów ma ogólne zastosowanie, a protokół można dostosować do różnych eksperymentów mikroskopowych z użyciem arkuszy świetlnych.

Wprowadzenie

Morfogeneza to proces, który kształtuje zarodek i wraz ze wzrostem i różnicowaniem napędza ontogenezę z zapłodnionej komórki jajowej do dojrzałego organizmu wielokomórkowego. Procesy morfogenetyczne zachodzące podczas rozwoju zwierząt można najlepiej przeanalizować poprzez obrazowanie nienaruszonych żywych osobników^1-3. Dzieje się tak dlatego, że takie obrazowanie całego zarodka zachowuje wszystkie składniki, które napędzają i regulują rozwój, w tym gradienty cząsteczek sygnałowych, macierz zewnątrzkomórkową, unaczynienie, unerwienie, a także właściwości mechaniczne otaczającej tkanki. Aby połączyć skale, w których zachodzi morfogeneza, szybkie zdarzenia subkomórkowe muszą zostać uchwycone w minutowej skali czasowej w kontekście rozwoju całej tkanki w ciągu godzin lub dni. Aby spełnić wszystkie te wymagania, opracowano nowoczesną implementację⁴ mikroskopu oświetlenia w płaszczyźnie ortogonalnej⁵. Pierwotnie nosiła nazwę Selektywnej Mikroskopii Oświetlenia Płaskiego (SPIM)⁴; obecnie zwykle stosuje się wszechstronny termin mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego (LSFM). LSFM umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości czasowej, przy jednoczesnym wywoływaniu mniejszej fototoksyczności niż skanowanie laserowe lub mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem^6,7. Obecnie istnieje już wiele implementacji podstawowej zasady oświetlenia arkusza świetlnego i jest ona wykorzystywana do obrazowania wielu różnych próbek i procesów, które wcześniej były niedostępne dla badaczy^8-11.

Chcielibyśmy najpierw podkreślić kilka kluczowych zalet LSFM w porównaniu z konwencjonalnymi metodami mikroskopii konfokalnej:

Aby uzyskać znaczące wyniki z eksperymentów mikroskopowych na żywo, ważne jest, aby obserwacja tylko minimalnie wpływała na próbkę. Jednak wiele organizmów, w tym danio pręgowany, jest bardzo podatnych na ekspozycję na światło laserowe, co utrudnia zobrazowanie ich w mikroskopie konfokalnym z wysoką rozdzielczością czasową bez skutków fototoksyczności, takich jak zatrzymany lub opóźniony rozwój^6,7. LSFM jest obecnie techniką obrazowania fluorescencyjnego o najmniejszym wpływie zakłócającym na próbkę⁷. Ponieważ cienki arkusz światła laserowego oświetla tylko tę część próbki, która jest obrazowana w określonym punkcie czasowym, mikroskop arkusza świetlnego bardzo efektywnie wykorzystuje fotony. W związku z tym ekspozycja przy słabym oświetleniu pozwala na dłuższe obserwacje poklatkowe zdrowszych okazów, np. ^12-17. Co więcej, dzięki minimalnej inwazyjności LSFM, liczba pozyskanych obrazów nie jest już podyktowana ilością światła, które próbka może tolerować, ale raczej tym, ile danych można przetworzyć i przechowywać.

Podobnie jak w przypadku utrzymywania próbki w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, LSFM oferuje alternatywne strategie montażu próbek, które dobrze nadają się do żywych zarodków. W technikach LSFM zarodki są zwykle osadzone w cienkiej kolumnie agarozy o niskiej zawartości procentowej. Montaż w cylindrach z agarozy pozwala na pełną swobodę obrotu, dzięki czemu próbka może być obserwowana pod idealnym kątem (w LSFM określanym jako widok) i z kilku widoków jednocześnie. Obrazowanie wielowidokowe i późniejsza fuzja multiview jest korzystne szczególnie w przypadku dużych, rozpraszających się próbek i umożliwia ich uchwycenie z wysoką, izotropową rozdzielczością. Podsumowanie innych możliwych strategii montażu LSFM można znaleźć w oficjalnej instrukcji obsługi mikroskopu, w rozdziale dotyczącym przygotowania próbki napisanym przez laboratorium E. Reynaud. Jest to lektura zalecana, zwłaszcza jeśli celem jest zobrazowanie innych próbek niż opisane tutaj.

Akwizycja obrazu w LSFM odbywa się za pomocą kamery, w przeciwieństwie do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Skutkuje to wyższym stosunkiem sygnału do szumu (SNR) dla pozyskanych obrazów i może być niezwykle szybkie (dziesiątki do setek klatek na sekundę). Wysoka czułość LSFM umożliwia ponadto obrazowanie słabo fluorescencyjnych próbek, takich jak czynniki transkrypcyjne wyrażane na poziomie endogennym¹⁸ lub, w niedalekiej przyszłości, endogenne białka znakowane za pomocą CRISPR/Cas9. Wysoki stosunek sygnału do szumu (SNR) jest również ważny dla udanej analizy obrazu na dalszym etapie. Duża prędkość jest wymagana nie tylko do uchwycenia szybkich procesów wewnątrzkomórkowych, ale także do wystarczająco szybkiego zobrazowania całego zarodka z wielu widoków. Płynne połączenie wielu widoków można osiągnąć tylko wtedy, gdy obserwowane zjawisko nie zmienia się podczas pozyskiwania tych kilku stosów z pochodzących z oddzielnych widoków.

Zalety LSFM zazwyczaj nie kosztują jakości obrazu. Rozdzielczość boczna LSFM jest nieco gorsza niż rozdzielczość mikroskopu konfokalnego. Dzieje się tak, ponieważ obiektywy detekcyjne stosowane w LSFM mają niższą aperturę numeryczną (zwykle 1,0 lub mniej) w porównaniu do 1,2-1,3 obiektywów zanurzeniowych w wodzie lub krzemie w standardowych konfokalnych konfokalnych. Dodatkowo, ze względu na szerokie pole detekcji w LSFM (brak otworka), jest więcej nieostrego światła w porównaniu z mikroskopem konfokalnym. Ilość nieostrego światła zależy od grubości blachy świetlnej. Niemniej jednak te wady są kompensowane przez wyższy stosunek sygnału do szumu (SNR) w LSFM. W praktyce skutkuje to obrazami o podobnej jakości w porównaniu na przykład z konfokalną akwizycją z wirującym dyskiem¹⁵. W związku z tym umożliwia to niezawodną ekstrakcję cech, takich jak błony komórkowe lub jądra komórkowe, np. w celu śledzenia linii komórkowych^15,19.

Rozdzielczość osiowa LSFM jest określana, oprócz celu wykrywania, przez grubość lekkiego arkusza. Rozdzielczość osiowa LSFM może w niektórych przypadkach przewyższać rozdzielczość mikroskopów konfokalnych. Po pierwsze, poprawa rozdzielczości następuje, gdy arkusz światła jest cieńszy niż rozdzielczość osiowa obiektywu detekcji, co zwykle ma miejsce w przypadku dużych próbek obrazowanych za pomocą obiektywu o małym powiększeniu. Drugim sposobem, w jaki LSFM może osiągnąć lepszą rozdzielczość osiową, jest fuzja wielu widoków, w której informacje o wysokiej rozdzielczości xy z różnych widoków są łączone w jeden stos obrazów. Wynikowy scalony stos ma rozdzielczość izotropową zbliżoną do wartości rozdzielczości w kierunku bocznym^20,21. Opisana w tym artykule strategia rejestrowania wielu widoków na siebie nawzajem opiera się na użyciu fluorescencyjnych kulek polistyrenowych jako znaczników powierniczych osadzonych w agarozie wokół próbki^20,21.

W wyniku komercjalizacji LSFM, technika ta jest teraz dostępna dla szerokiej społeczności naukowców²². Dlatego motywacją do napisania tego protokołu jest udostępnienie tej technologii biologom rozwojowym, którzy nie mają praktycznego doświadczenia w LSFM i skłonienie tych naukowców do korzystania z tej technologii w swoich próbkach. W naszym protokole wykorzystano komercyjny mikroskop z arkuszami świetlnymi, który jest koncepcyjnie prostym mikroskopem, który jest łatwy w obsłudze. Chcielibyśmy również wspomnieć o innych najnowszych protokołach obrazowania danio pręgowanego za pomocą domowych konfiguracji LSFM, które mogą być odpowiednie do udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania^23-25. Inną opcją wejścia do LSFM są otwarte platformy^26,27, które wykorzystują zasady otwartego dostępu, aby udostępnić mikroskopię arkuszową światła szerszej społeczności. Dokumentację zarówno sprzętu, jak i oprogramowania można znaleźć na stronach http://openspim.org i https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

W tym protokole używamy danio pręgowanego teleost jako systemu modelowego do badania procesów rozwojowych za pomocą LSFM. Morfogeneza oka danio pręgowanego jest przykładem, który podkreśla wiele korzyści płynących z LSFM. LSFM był już stosowany w przeszłości do badania rozwoju oka u medaka²⁸ i u danio pręgowanego^29,30. Na wczesnym etapie rozwoju oka prawidłowe ustawienie zarodka w konwencjonalnej mikroskopii jest skomplikowane, ponieważ masywne żółtko nie pozwala zarodkowi leżeć na boku z okiem skierowanym w stronę obiektywu. Jednak dzięki zamontowaniu LSFM w kolumnie agarozowej, próbka może być odtwarzalnie pozycjonowana. Dodatkowo, podczas przejścia od stadium pęcherzyka wzrokowego do stadium miseczki wzrokowej, oko ulega poważnym rearanżacjom morfogenetycznym, którym towarzyszy wzrost, co wymaga uchwycenia dużego stosu z i dużego pola widzenia. Również w przypadku tych wyzwań LSFM jest lepszy od konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Proces powstawania kubka optycznego jest trójwymiarowy, dlatego trudno go zrozumieć i zwizualizować wyłącznie poprzez obrazowanie z jednego widoku. To sprawia, że obrazowanie wielowidokowe z rozdzielczością izotropową jest korzystne. Po uformowaniu się miseczki wzrokowej siatkówka staje się coraz bardziej wrażliwa na ekspozycję lasera. W związku z tym niska fototoksyczność związana z LSFM jest główną zaletą w przypadku obrazowania długoterminowego.

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania zarodków i larw danio pręgowanego w wieku od jednego do trzech dni, z naciskiem na rozwój oka. Nasza metoda pozwala na nagrywanie filmów poklatkowych obejmujących do 12-14 godzin z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Co ważne, pokazujemy również potok przetwarzania danych, który jest niezbędnym krokiem w LSFM, ponieważ technika ta niezmiennie generuje duże zbiory danych, często w zakresie terabajtów.

Protokół

UWAGA: Wszystkie prace ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej (UE) 2011/63/UE i niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt. Protokół ma być przestrzegany bez przerwy, od montażu do obrazowania próbki. W zależności od praktycznego doświadczenia, rozpoczęcie eksperymentu poklatkowego zajmie 2-3 godziny. Przetwarzanie danych nie jest uwzględniane w tym obliczaniu czasu. Cały materiał wymagany do eksperymentu można znaleźć na liście kontrolnej materiału potrzebnego przed rozpoczęciem, która jest dostarczana jako dokument uzupełniający. Nosić rękawice bezpudrowe podczas kroków 1, 2, 3 i 4. Aby zapoznać się z krokami 2, 3, 4 i 5 protokołu, należy również zapoznać się z oficjalną instrukcją obsługi mikroskopu.

1. Prace przygotowawcze przed eksperymentem z obrazowaniem

1. Roztwór podstawowy z koralików fluorescencyjnych
   1. Do tego protokołu użyj kulek polistyrenowych o średnicy 500 lub 1,000 nm (oznaczonych barwnikiem fluorescencyjnym emitującym czerwień). Robocze rozcieńczenie kulek wynosi 1:4,000. Najpierw wiruj roztwór podstawowy kulki przez 1 minutę. Rozcieńczyć 10 μl kulek w 990 μl ddH₂O. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C i użyć tego rozcieńczenia 1:100 jako roztworu podstawowego do dalszego rozcieńczania w stosunku 1:40.
2. Przygotowanie roztworu do komory na próbki
   1. W zlewce o pojemności 100 ml zmieszać 38,2 ml pożywki E3 bez błękitu metylenowego, 0,8 ml 10 mM N-fenylotiomocznika i 1 ml 0,4% MS-222. Korzystne jest stosowanie przefiltrowanego podłoża E3, aby uniknąć późniejszych małych cząstek kurzu lub nierozpuszczonych kryształów unoszących się w komorze próbki.
3. Fluorescencyjna selekcja zarodków ryb
   1. W dniach poprzedzających eksperyment przygotuj zarodki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych. Tuż przed eksperymentem należy posortować zarodki pod fluorescencyjnym stereoskopem pod kątem pożądanej siły sygnału fluorescencyjnego. Weź 5-10 zdrowych zarodków i usuń je z nakrętówki za pomocą pęsety.
      UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany dla zarodków w wieku 16-72 godzin.

2. Ustawianie komory na próbki

1. Montaż okien trzykomorowych
   1. W komorze na próbki znajdują się 4 okienka, jedno na obiektyw i trzy do uszczelnienia szkiełkami nakrywkowymi (średnica 18 mm, wybrana grubość 0,17 mm). Przechowuj te szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu. Wytrzyj je do czysta przed użyciem eterem:etanolem (1:4).
   2. Włóż szkiełko nakrywkowe do okna za pomocą drobnych kleszków i upewnij się, że pasuje do najmniejszego rowka. Przykryj go gumowym O-ringiem o średnicy 17 mm i wkręć pierścień adaptera oświetlenia za pomocą narzędzia do okien studzienek. Powtórz ten proces dla pozostałych dwóch okien.
2. Mocowanie pozostałych części komory
   1. Przykręć adapter odpowiedniego obiektywu w czwartą pozostałą stronę komory. Włóż O-ring o średnicy 15 mm do środka adaptera.
   2. Wkręć biały adapter Luer-Lock w prawy dolny otwór w komorze, a szary łącznik odpływowy w lewym górnym otworze. Zablokuj wszystkie trzy pozostałe otwory za pomocą czarnych zaślepek.
   3. Przymocuj blok Peltiera i metalowy suwak na jaskółczy ogon na dnie komory za pomocą klucza imbusowego. Podłączyć wąż ze strzykawką o pojemności 50 ml do adaptera Luer-Lock. Włóż sondę temperatury do komory.
3. Wkładanie obiektywów i komory do mikroskopu
   1. Sprawdź pod stereoskopem, czy wszystkie obiektywy są czyste. Użyj obiektywów oświetleniowych 10x/0,2 i obiektywu detekcyjnego Plan-Apochromat 20x/1,0 W i upewnij się, że jego kołnierz korekcji indeksu refrakcji jest ustawiony na 1,33 dla wody. Przykręć obiektyw detekcji do mikroskopu, nie pozostawiając obiektywów oświetlających zakrytych.
   2. Zdjąć plastikowe nasadki ochronne zakrywające obiektywy oświetlające. Ostrożnie wsuń komorę do mikroskopu i dokręć ją śrubą mocującą.
   3. Połącz sondę temperatury i blok Peltiera z mikroskopem.
      UWAGA: Dwie rurki cyrkulujące ciecz chłodzącą dla bloku Peltiera są kompatybilne z obydwoma złączami. Tworzą one działający obwód niezależnie od orientacji połączenia.
   4. Napełnić komorę przez strzykawkę roztworem przygotowanym w kroku 1.2 aż do górnej krawędzi okien komory. Sprawdź, czy komora nie przecieka.
   5. Uruchom mikroskop, inkubację oraz komputery sterujące i przechowujące. Uruchom oprogramowanie obsługujące mikroskop i ustaw temperaturę inkubacji na 28,5 °C.
      UWAGA: Całkowite zrównoważenie zajmie 1 godzinę. W międzyczasie przygotuj próbkę.

3. Przygotowanie próbki

1. Przygotowanie mieszanki agarozy
   1. 15 minut przed przygotowaniem mieszanki agarozy rozpuścić jedną 1 ml podwielokrotności 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (rozpuszczonej w pożywce E3) w bloku grzewczym ustawionym na temperaturę 70 °C. Gdy agaroza jest całkowicie stopiona, przenieś 600 μl do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj 250 μl pożywki E3, 50 μl 0,4% MS-222 i 25 μl wirowego roztworu podstawowego z kulkami.
      UWAGA: Daje to 925 μl mieszanki, podczas gdy dodatkowe 75 μl oblicza się dla płynu dodawanego później razem z zarodkami.
   2. Przechowywać probówkę w drugim bloku grzewczym w temperaturze 38-40 °C lub upewnić się, że agaroza znajduje się bardzo blisko punktu żelowania przed włożeniem do niej próbek zarodków.
2. Montaż zarodków
   1. Weź pięć szklanych kapilar o objętości 20 μl (z czarnym znacznikiem, średnica wewnętrzna ~1 mm) i włóż do nich pasujące tłoki z końcówką teflonową. Przepchnąć tłok przez kapilarnę tak, aby końcówka teflonowa znalazła się na dnie kapilary.
   2. Przenieść pięć zarodków (liczbę, która może być zamontowana jednocześnie) za pomocą szklanej lub plastikowej pipety do probówki z wirowaną ciepłą mieszanką agarozy o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Staraj się przenosić minimalną objętość płynu razem z zarodkami.
   3. Włóż kapilarnę do mieszanki i zassaj jeden zarodek do środka, pociągając tłok do góry. Upewnij się, że głowa zarodka wchodzi do naczynia włosowatego przed ogonem. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza między tłokiem a próbką. Nad zarodkiem powinno znajdować się ±2 cm agarozy, a pod nim ±1 cm. Powtórzyć te czynności dla pozostałych zarodków.
   4. Poczekaj, aż agaroza całkowicie się zestale, co nastąpi w ciągu kilku minut, a następnie przechowuj próbki w pożywce E3, przyklejając je do ścianki zlewki plasteliną lub taśmą. Dolny otwór kapilary powinien swobodnie zwisać w roztworze, umożliwiając wymianę gazową z próbką.
      UWAGA: Podobny protokół do sekcji 3.1 i 3.2 można również znaleźć na stronie wiki OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

4. Przykładowe pozycjonowanie

1. Zespół uchwytu próbki
   1. Włóż 2 plastikowe tuleje o odpowiednim rozmiarze (czarne) względem siebie do trzpienia uchwytu próbki. Ich rozcięte boki muszą być skierowane na zewnątrz. Przymocuj zaciskową luźno, obracając ją o 2-3 rundy. Przełóż kapilarnę przez clamp śruba i przepchnij ją przez uchwyt, aż pasek stanie się widoczny po drugiej stronie. Unikać dotykania tłoka.
   2. Dokręcić zaciskową. Wypchnij nadmiar 1 cm agarozy poniżej zarodka z naczynia włosowatego i odetnij go. Włóż trzpień do dysku uchwytu próbki.
   3. Potwierdź w oprogramowaniu, że stolik mikroskopu znajduje się w pozycji obciążenia. Użyj szyn prowadzących, aby wsunąć cały uchwyt z próbką pionowo w dół do mikroskopu. Obróć go tak, aby tarcza uchwytu magnetycznego zablokowała się na swoim miejscu.
2. Lokalizacja kapilary
   1. Od teraz kontroluj pozycjonowanie próbki za pomocą oprogramowania. Na karcie Zlokalizuj wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę i ustaw kapilarnę w osiach x, y i z w pozycji ostrości tuż nad soczewką obiektywu detekcji. Skorzystaj z graficznej reprezentacji w nawigatorze próbek, aby uzyskać wskazówki.
   2. Delikatnie wypchnij zarodek z naczynia włosowatego, aż znajdzie się przed źrenicą celu wykrywania.
      UWAGA: "Zlokalizuj kapilarę" jest jedynym krokiem w pozostałym protokole, podczas którego należy otworzyć górną pokrywę mikroskopu i wypchnąć próbkę.
3. Lokalizowanie próbki
   1. Przełącz się na opcję "Zlokalizuj próbkę" i przy powiększeniu 0,5 umieść oko danio pręgowanego na środku pola widzenia. Obróć zarodek tak, aby arkusz światła nie przeszedł przez żadne wysoce załamane lub absorbujące części próbki, zanim dotrze do oka. Podobnie, emitowana fluorescencja potrzebuje wyraźnej drogi wyjścia z próbki. Kliknij "Ustaw pozycję wyjściową".
   2. Otwórz przednie drzwiczki mikroskopu i umieść plastikową osłonę z otworem 3 mm na górze komory, aby uniknąć parowania.
      UWAGA: Jeśli poziom cieczy spadnie poniżej poziomu obrazowania, eksperyment będzie zakłócony.
   3. Sprawdź bicie serca zarodka jako wskaźnik ogólnego stanu zdrowia. Jeśli jest zbyt wolny, użyj innej próbki (porównaj z kontrolami bez zamontowania; konkretne wartości zależą od etapu rozwoju). Przełącz się na końcowe ustawienie powiększenia i ponownie dostosuj pozycję zarodka.

5. Ustawianie wielowymiarowego przejęcia

1. Parametry akwizycji
   1. Przejdź do zakładki "Akwizycja". Zdefiniuj ścieżkę światła, w tym linie laserowe, cel detekcji, filtr blokujący laser, rozdzielacz wiązki i kamery.
   2. Aktywuj pole wyboru skanowania przestawnego. Zdefiniuj inne ustawienia akwizycji, takie jak głębia bitowa, format obrazu, grubość jasnego arkusza i wybierz oświetlenie jednostronne.
   3. Naciśnij przycisk "Ciągły" i w zależności od intensywności uzyskanego obrazu zmień moc lasera i czas naświetlania aparatu.
      UWAGA: Do regulacji wszystkich ustawień obrazowania użyj mniejszej mocy lasera (0,5% lasera o mocy 100 mW, czas naświetlania 30 ms) niż w przypadku rzeczywistego eksperymentu, aby uniknąć niepotrzebnych uszkodzeń próbki przez zdjęcie.
2. Regulacja lekkiego arkusza
   1. Przełącz się na "Dwustronne podświetlenie" i aktywuj pole wyboru "Online Dual Side Fusio'n". Uruchom "Kreatora automatycznej regulacji Lightsheet". Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku.
      UWAGA: Kreator przesuwa arkusz świetlny w płaszczyznę ogniskowej obiektywu wykrywania i upewnia się, że nie jest on przechylony, a jego talia znajduje się w środku pola widzenia. Po zakończeniu automatycznej regulacji pozycje lewej i prawej blachy świetlnej są automatycznie aktualizowane w oprogramowaniu. Poprawa jakości obrazu powinna być teraz widoczna. Aktywuj pole wyboru "Z-stack".
   2. Sprawdź regulację arkusza świetlnego, sprawdzając symetrię funkcji rozproszenia punktowego (PSF) wyrażaną przez koraliki fluorescencyjne w widoku orto xz i yz. Jeśli nie jest symetryczny, ręcznie dostosuj położenie parametru arkusza świetlnego w górę iw dół, aż do uzyskania symetrycznego PSF w kształcie klepsydry (Rysunek 1A).
3. Wielowymiarowe ustawienia akwizycji
   1. Zdefiniuj stos z za pomocą opcji "Pierwszy plasterek" i "Ostatni plasterek" i ustaw krok z na 1 μm.
      UWAGA: Arkusz świetlny w tym mikroskopie jest statyczny, a przekrój z uzyskuje się poprzez przesuwanie próbki. Zawsze używaj opcji "Continuous Drive" w celu szybszego pozyskiwania z-stacków.
   2. Zaznacz pole wyboru "Szeregi czasowe". Określ łączną liczbę punktów czasowych i odstęp między nimi.
   3. Zaznacz pole wyboru "Multiview". Dodaj bieżący widok do listy multiwidoków, na której są przechowywane informacje o x, y, z i kątze. Użyj kontrolera stolika, aby obrócić kapilarę i zdefiniować inne żądane widoki. Skonfiguruj stos z w każdym widoku i dodaj je do listy multiwidoków.
      UWAGA: Oprogramowanie sortuje widoki w sposób szeregowy, tak aby kapilara była obracana jednokierunkowo, podczas gdy obraz jest pozyskiwany.
4. Korekcja dryfu i rozpoczęcie eksperymentu
   1. Po zakończeniu konfiguracji akwizycji odczekaj 15-30 minut przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu.
      UWAGA: Próbka początkowo dryfuje o kilka mikrometrów w x, y i z, ale powinna zatrzymać się w ciągu 30 minut. Jeśli próbka dryfuje przez dłuższy czas, użyj innej próbki lub zamontuj ponownie.
   2. Przejdź do zakładki 'Utrzymanie' i w opcji 'Streaming' określ, w jaki sposób dane mają być zapisywane, np. jeden plik na punkt czasowy lub osobny plik dla każdego widoku i kanału. Wróć do zakładki 'Akwizycja', naciśnij 'Rozpocznij eksperyment' i zdefiniuj nazwę pliku, lokalizację, w której ma zostać zapisany oraz format pliku (użyj .czi).
   3. Obserwuj zdobycie pierwszego punktu czasowego, aby potwierdzić, że wszystko działa bez zarzutu. Natychmiast przystąp do rejestracji i fuzji pierwszego punktu czasowego zgodnie z opisem w krokach 6 i 7, aby potwierdzić, że możliwe będzie przetworzenie całego zestawu danych.

6. Rejestracja Multiview

1. Aplikacja do rekonstrukcji Multiview
   1. Pod koniec sesji obrazowania należy przesłać dane z komputera przechowującego dane pod mikroskopem do komputera przetwarzającego dane. Do przetwarzania danych należy użyć aplikacji "MultiView ReconstructionApplication"^20,21,31 zaimplementowanej na Fidżi³² (rysunek 1B).
2. Definiowanie zestawu danych
   1. Aktualizacja Fidżi: Fidżi > Pomoc > Aktualizacja ImageJ i Fidżi > Pomoc > aktualizacji Fidżi. Korzystaj z głównych witryn aktualizacji ImageJ i Fidżi.
   2. Przenieś cały zestaw danych do jednego folderu. Wyniki i pliki pośrednie przetwarzania zostaną zapisane w tym folderze. Uruchom aplikację MultiView Reconstruction: Fiji > Plugins > Multiview Reconstruction > Multiview Reconstruction Application.
   3. Wybierz opcję "zdefiniuj nowy zestaw danych". Jako typ zbioru danych wybierz opcję meu "Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats)" i utwórz nazwę pliku .xml. Następnie wybierz pierwszy plik .czi zestawu danych (tj. plik bez indeksu). Zawiera dane obrazu, a także metadane nagrania.
      UWAGA: Gdy program otworzy pierwszy plik .czi, metadane zostaną załadowane do programu.
   4. Upewnij się, że liczba kątów, kanałów, iluminacji i obserwuj rozmiar woksela na podstawie metadanych. Po naciśnięciu OK obserwuj, jak otwierają się trzy oddzielne okna (Rysunek 1C): okno dziennika, pokazujące postęp przetwarzania i jego wyniki, "Eksplorator ViewSetup" i konsola, wyświetlająca komunikaty o błędach Fiji.
      UWAGA: "Eksplorator ViewSetup" to przyjazny dla użytkownika interfejs, który pokazuje każdy widok, kanał i oświetlenie oraz pozwala na wybór interesujących plików. Dodatkowo "Eksplorator ViewSetup" umożliwia sterowanie wszystkimi etapami przetwarzania.
   5. Wybierz pliki, które mają zostać przetworzone i naciśnij prawy przycisk myszy do eksploratora. Obserwuj otwarte okno z różnymi etapami przetwarzania (Rysunek 1C).
   6. Po zdefiniowaniu zestawu danych należy zauważyć, że w folderze z danymi tworzony jest plik .xml.
      UWAGA: Ten plik zawiera metadane, które zostały wcześniej potwierdzone.
   7. W prawym górnym rogu zwróć uwagę na dwa przyciski "informacje" i "zapisz". Naciśnięcie przycisku "info" powoduje wyświetlenie podsumowania zawartości pliku .xml. Naciśnięcie przycisku "zapisz" spowoduje zapisanie wyników przetwarzania.
      UWAGA: Podczas przetwarzania w aplikacji "MultiView Reconstruction Application" różne etapy przetwarzania muszą zostać zapisane w .xml przed zamknięciem Fidżi.

Rysunek 1: Proces roboczy rekonstrukcji wielu widoków i wykrywanie punktów zainteresowania. (A) Wyrównanie arkusza świetlnego na podstawie obrazowania fluorescencyjnego kulek. System jest wyrównany (do środka), gdy obraz koralika ma symetryczny kształt klepsydry w rzutach xz i yz. Przykłady nieprawidłowo wyrównanego arkusza świetlnego w obu kierunkach są pokazane po lewej i prawej stronie. Pokazane są maksymalne projekcje intensywności koralika o długości fali 500 nm w osiach xz, yz i xy. Należy zauważyć, że stosunek intensywności centralnego piku dysku Airy'ego (w xy) do płatów bocznych jest większy, gdy arkusz świetlny jest prawidłowo wyrównany w porównaniu z sytuacją niewspółosiowości. Zdjęcia wykonano obiektywem 20X/1,0 W przy powiększeniu 0,7. Podziałka liniowa reprezentuje 5 μm. (B) Zestaw danych jest definiowany, a następnie ponownie zapisywany w formacie HDF5. Koraliki są segmentowane, a następnie rejestrowane. W przypadku szeregów czasowych każdy punkt czasowy jest rejestrowany w referencyjnym punkcie czasowym. Dane są ostatecznie łączone w jeden wolumin izotropowy. (C, góra) Eksplorator ViewSetup pokazuje różne punkty czasowe, kąty, kanały i strony oświetlenia zestawu danych. (C, lewy dolny róg) W oknie BigDataViewer wyświetlany jest widok wybrany w eksploratorze ViewSetup. (C, w środku po prawej) Kliknięcie prawym przyciskiem myszy w Eksploratorze ViewSetup otwiera opcje przetwarzania. (C, prawy dolny róg) Postęp i wyniki przetwarzania są wyświetlane w pliku dziennika. (D i E) Celem detekcji jest segmentacja jak największej liczby punktów zainteresowania (koralików) przy jak najmniejszej detekcji w próbce, pokazanej tutaj jako zrzuty ekranu z interaktywnej segmentacji koralików. (D i E, lewy górny róg) Segmentacja jest definiowana przez dwa parametry: różnicę wartości Gaussa dla Sigma 1 i próg. (D) Przykład udanego wykrywania z powiększonym widokiem prawidłowo wykrytego ściegu. (E) Segmentacja ze zbyt dużą liczbą wyników fałszywie dodatnich i wielokrotnymi wykrywaniami pojedynczego koralika. Podziałka w (C) reprezentuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ponowne zapisywanie zestawu danych w formacie HDF5
   1. Aby ponownie zapisać cały zestaw danych, zaznacz wszystkie pliki za pomocą Ctrl/Apple+a i kliknij prawym przyciskiem myszy. Następnie wybierz opcję Zapisz ponownie zestaw danych i jako HDF5.
   2. Pojawi się okno z ostrzeżeniem, że wszystkie widoki bieżącego zestawu danych zostaną ponownie zapisane. Naciśnij tak.
      UWAGA: Program będzie kontynuował ponowne zapisywanie plików .czi w hdf5, otwierając każdy plik i ponownie zapisując różne poziomy rozdzielczości formatu hdf5. Po zakończeniu potwierdzi to za pomocą "gotowe". Ponowne zapisywanie zwykle zajmuje kilka minut na punkt czasowy (patrz Tabela 1).
      UWAGA: Ponieważ pliki w formacie hdf5 mogą być ładowane bardzo szybko, teraz można wyświetlić niezarejestrowany zestaw danych poprzez "kliknięcie prawym przyciskiem myszy" w eksploratorze i przełączenie opcji "wyświetlanie w BigDataViewer (wł./wył.)". Pojawi się okno BigDataViewer z wybranym widokiem (Rysunek 1C). Podstawowe funkcje BigDataViewer³³ zostały wyjaśnione w tabeli 2 i http://fiji.sc/BigDataViewer.
4. Wykrywanie punktów zainteresowania
   1. Zaznacz wszystkie punkty czasu za pomocą Ctrl/Apple+a i kliknij prawym przyciskiem myszy wybierz opcję Wykryj punkty zainteresowania.
   2. Wybierz Różnica Gaussa³⁴ dla typu wykrywania punktu zainteresowania. Ponieważ stosowana jest tutaj rejestracja oparta na koralikach, wpisz "koraliki" w polu punktów zainteresowania etykietą. Aktywuj opcję "Próbkowanie w dół obrazów przed segmentacją".
   3. W następnym oknie obserwuj ustawienia wykrywania. W przypadku "lokalizacji subpikselowej" należy użyć "3-wymiarowego dopasowania kwadratowego"³⁴, a w celu wyznaczenia różnicy wartości gaussowskich i promienia segmentacji ściegów należy użyć słowa "interaktywny" w specyfikacji największego punktu".
   4. Dla "Downsample XY" należy użyć "Match Z Resolution (less downsampling)", a dla 'Downsample Z' użyj 1×. Rozmiar kroku z jest większy niż rozmiar piksela xy, więc wystarczy po prostu próbkowanie w dół xy, aby dopasować rozdzielczość z. Wybierz opcję "moc obliczeniowa na procesorze (JAVA)". Naciśnij "OK".
   5. W wyskakującym oknie wybierz jeden widok do testowania parametrów z menu rozwijanego. Po załadowaniu widoku dostosuj jasność i kontrast okna za pomocą Fiji > Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast lub Ctrl + Shift + C. Zaznacz pole "szukaj maksimów (zielony)" w celu wykrywania koralików.
   6. Obserwuj segmentację w "viewSetup" jako zielone pierścienie wokół wykryć podczas szukania maksimów i czerwone dla minimów. Segmentacja jest definiowana przez dwa parametry: różnicę wartości Gaussa dla Sigma 1 i próg (rysunek 1D). Dostosuj je, aby podzielić na segmenty jak najwięcej koralików wokół próbki i jak najmniej fałszywych alarmów w próbce (rysunek 1D). Wykryj każdy koralik tylko raz, a nie wiele razy (Rysunek 1E). Po ustaleniu optymalnych parametrów naciśnij 'gotowe'.
      UWAGA: Wykrywanie rozpoczyna się od załadowania każdego pojedynczego widoku punktu czasu i segmentacji koralików. W pliku dziennika program wyprowadza liczbę wykrytych koralików w każdym widoku. Wykrycie powinno nastąpić w ciągu kilku sekund (patrz Tabela 1).
   7. Naciśnij przycisk Zapisz, gdy liczba wykryć jest odpowiednia (od 600 do kilku tysięcy na widok).
      UWAGA: W katalogu danych zostanie utworzony folder, który będzie zawierał informacje o współrzędnych wykrytych koralików.
5. Zarejestruj się, korzystając z punktów Interest Points
   1. Zaznacz wszystkie punkty czasowe za pomocą Ctrl/Apple + a, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zarejestruj się za pomocą punktów procentowych".
   2. Użyj 'szybkiego geometrycznego haszowania 3D (niezmiennika obrotu)' do wykrywania ściegów jako 'algorytmu rejestracji'.
      UWAGA: Ten algorytm nie zakłada wcześniejszej wiedzy na temat orientacji i położenia różnych widoków względem siebie.
   3. Aby zarejestrować wzajemne widoki, wybierz opcję "rejestruj punkty czasowe pojedynczo" jako "typ rejestracji". Dla "punktów zainteresowania" w wybranym kanale, powinna być teraz widoczna wcześniej określona etykieta dla punktów zainteresowania (tj. "koraliki").
   4. W następnym oknie użyj wstępnie ustawionych wartości do rejestracji. Napraw pierwszy widok, wybierając opcję "Napraw kafelki: Napraw pierwszy kafelek i użyj opcji Nie mapuj wstecz" (użyj tej opcji, jeśli kafelki nie są stałe) w sekcji "Mapuj kafelki wstecz".
   5. Użyj 'modelu transformacji afinicznej' z 'regularyzacją'.
      UWAGA: Dozwolony błąd dla RANSAC będzie wynosił 5px, a "istotność dla dopasowania deskryptora" będzie wynosić 10. Do "regularyzacji" należy użyć "modelu sztywnego" o współczynniku lambda 0,10, co oznacza, że transformacja jest w 10% sztywna i w 90% afiniczna³⁵. Naciśnij OK, aby rozpocząć rejestrację.
      UWAGA: Jak pokazano w oknie dziennika, najpierw każdy widok jest dopasowywany do wszystkich innych widoków. Następnie konsensus próby losowej (RANSAC)³⁶ testuje korespondencje i wyklucza wyniki fałszywie dodatnie. Aby rejestracja była solidna, wartość RANSAC powinna być wyższa niż 90%. Gdy zostanie znaleziona wystarczająca liczba prawdziwych kandydatów odpowiadających dwóm widokom, między każdym dopasowaniem obliczany jest model transformacji ze średnim przemieszczeniem w pikselach. Następnie przeprowadzana jest iteracyjna optymalizacja globalna i wszystkie widoki są rejestrowane w widoku stałym. Po pomyślnym zarejestrowaniu model transformacji jest obliczany i wyświetlany wraz z jego skalowaniem i przemieszczeniem w pikselach. Średni błąd powinien być optymalnie poniżej 1 px, a skalowanie transformacji bliskie 1. Rejestracja odbywa się w ciągu kilku sekund (patrz tabela 1).
   6. Potwierdzić, że nie ma przesunięcia między różnymi widokami, jak zaobserwowano w przypadku drobnych struktur w próbce, np. błon komórkowych. Następnie zapisz transformację dla każdego widoku w pliku .xml.
      UWAGA: Teraz zarejestrowane widoki nakładają się na siebie w BigDataViewer (Rysunek 2A), a obrazy ściegów również powinny się nakładać (Rysunek 2B).
   7. Usuń przekształcenia, wybierając punkty czasowe, kliknij je prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierz Usuń przekształcenia > Najnowsze/najnowsze przekształcenie.

Rysunek 2: Wyniki rekonstrukcji multiwidoku. (A) Nałożone zarejestrowane widoki, każdy w innym kolorze, aby pokazać nakładanie się na siebie. (B) Widok w powiększeniu pokazujący nakładanie się na siebie poliestrowych włókien odcinkowych koralików zobrazowanych z różnych widoków. (C) Zbliżenie na koralik po stopieniu, poliestrowe włókna odcinkowe (PSF) są średnią z różnych widoków. (D) Poliestrowe włókna odcinkowe o tym samym zgrubieniu co w (C) po dekonwolucji wielowidokowej wykazującej, że poliestrowe włókna odcinkowe zapadają się w jeden punkt. (E) przekrój x-y i przekrój (F) y-z pojedynczego widoku pęcherzyka wzrokowego, w którym błony są znakowane GFP wykazującym degradację sygnału w z głębiej w tkance. (G) przekrój x-y i przekrój (H) y-z tego samego widoku po fuzji 4 widoków oddalonych od siebie o około 20 stopni, z nieco bardziej zdegradowaną ogólną rozdzielczością x-y, ale zwiększoną rozdzielczością z. (I) przekrój x-y i (J) przekrój y-z tych samych danych po dekonwolucji multiview, wykazujący znaczny wzrost rozdzielczości i kontrastu sygnału zarówno w xy, jak i w z. Obrazy w (E-J) są pojedynczymi warstwami optycznymi. Podziałka odpowiada 50 μm (A, B, E-J) i 10 μm (C, D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Rejestracja poklatkowa
   1. Wybierz cały upływ czasu, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zarejestruj się za pomocą punktów procentowych", aby ustabilizować upływ czasu w czasie.
   2. W oknie 'Podstawowe parametry rejestracji) wybierz Dopasuj do jednego punktu czasowego odniesienia (bez optymalizacji globalnej) dla Typu rejestracji'. Zachowajrównieżinne ustawienia tak samo, jak w przypadku rejestracji poszczególnych punktów czasowych.
   3. W następnym oknie wybierz punkt czasowy, który ma być używany jako odniesienie, zazwyczaj punkt czasowy w środku filmu poklatkowego. Zaznacz pole "traktuj każdy punkt czasowy jako sztywną jednostkę", ponieważ poszczególne widoki w każdym punkcie czasowym są już zarejestrowane względem siebie.
   4. Zaznacz pole "Pokaż statystyki szeregów czasowych". Pozostałe parametry rejestracji pozostają takie same jak poprzednio, łącznie z uregulowaniem. Naciśnij przycisk OK.
      UWAGA: W oknie dziennika zostaną wyświetlone te same dane wyjściowe, co w przypadku rejestracji pojedynczego punktu czasowego. Jeśli rejestracja dla poszczególnych punktów czasowych zakończyła się sukcesem i jest solidna, RANSAC wynosi teraz 99-100%, a średni, minimalny i maksymalny błąd wynosi zwykle poniżej 1 piksela. Zapisz tę rejestrację, zanim przejdziesz dalej.

7. Fuzja wielu widoków

UWAGA: Wynikające z etapów rejestracji transformacje są używane do obliczenia połączonego stosu izotropowego z wielu widoków. Ten stos ma zwiększoną liczbę wycinków z w porównaniu z oryginalnymi danymi, ponieważ odstępy z są teraz równe oryginalnemu rozmiarowi piksela w xy. Fuzja może być wykonana za pomocą opartej na zawartości multiview^{fusion 21,31} lub bayesowskiej multiview deconvolution³¹, które są zaimplementowane w aplikacji do rekonstrukcji multiview.

1. Ramka ograniczenia
   UWAGA: Fuzja jest procesem wymagającym dużych kosztów obliczeniowych (patrz Tabela 1), dlatego zmniejszenie ilości danych poprzez zdefiniowanie pola ograniczenia znacznie zwiększa szybkość przetwarzania.
   1. Zaznacz wszystkie punkty czasowe, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zdefiniuj "Obwiednię". Użyj opcji "Zdefiniuj za pomocą BigDataViewer" i wybierz nazwę obwiedni.
   2. Przesuń suwak "min" i "max" na każdej osi, aby określić obszar zainteresowania, a następnie naciśnij "OK". Zostaną wyświetlone parametry obwiedni.
      UWAGA: Obwiednia będzie zawierać wszystko, co znajduje się w zielonym polu, na które nałożona jest przezroczysta warstwa karmazynowa.
2. Multiview Fusion
   oparty na treści UWAGA: Content-based multiview^{fusion 21} uwzględnia różnice w jakości obrazu w stosunku do stosu (tj. degradację sygnału w z) i stosuje wyższe wagi w celu uzyskania lepszej jakości obrazu zamiast prostego uśredniania.
   1. Wybierz punkty czasowe, które mają być połączone w "Eksploratorze ViewSetup", kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Fuzja/dekonwolucja obrazu".
   2. W oknie Image Fusion wybierz z menu rozwijanego opcję "Fuzja ze średnią ważoną" i wybierz opcję "Użyj wstępnie zdefiniowanej obwiedni dla obwiedni". Dla wyjścia połączonego obrazu wybierz opcję 'Dołącz do bieżącego projektu XML', która zapisuje nowe pliki hdf5 do już istniejących plików hdf5 i umożliwia używanie zarejestrowanych widoków bez fuzji i połączonego obrazu. Naciśnij "OK".
   3. Następnie w wyskakującym okienku "Predefiniuj obwiednię" wybierz nazwę wcześniej zdefiniowanej obwiedni i naciśnij "OK".
   4. Obserwuj parametry obwiedni w następnym oknie. Aby uzyskać szybką fuzję, zastosuj próbkowanie w dół do połączonego zestawu danych.
      UWAGA: Jeśli połączony stos przekracza określony rozmiar, program zaleci użycie bardziej wydajnego pamięci pliku "ImageLib2 containe". Przełącz się z 'ArrayImg' na kontener 'PlanarImg (duże obrazy, łatwe do wyświetlenia) lub CellImg (duże obrazy)', które umożliwiają przetwarzanie większych danych. W przeciwnym razie użyj wstępnie zdefiniowanych ustawień i zastosuj "mieszanie i łączenie oparte na zawartości". Kontynuuj, naciskając "OK".
   5. Obserwuj ustawienia hdf5 w następnym oknie. Użyj predefiniowanych parametrów i rozpocznij proces fuzji. Upewnij się, że Fidżi ma przypisaną wystarczającą ilość pamięci w opcjach Edytuj > > Pamięć i wątki.
3. Multiview Deconvolution
   UWAGA: Dekonwolucja wielu widoków³¹ to inny rodzaj fuzji wielowidokowej. W tym przypadku, oprócz fuzji, brany jest pod uwagę PSF systemu obrazowania w celu dekonwolucji obrazu i uzyskania zwiększonej rozdzielczości i kontrastu sygnału (porównane na rysunku 2C-J, rysunku 5 i filmie 3).
   1. Wybierz punkt czasowy do dekonwolacji, kliknij prawym przyciskiem myszy i naciśnij "Fuzja/Dekonwolucja obrazu".
   2. Wybierz opcję "Dekonwolucja multiwidoku" i użyj "wstępnie zdefiniowanej obwiedni i dołącz do bieżącego projektu XML". Zaznacz obwiednię i kontynuuj.
      UWAGA: Dobrym punktem wyjścia są predefiniowane parametry dekonwolucji. W pierwszej próbie użyj "20 iteracji" i oceń wpływ dekonwolucji przy użyciu "Trybu debugowania". Na koniec ustaw obliczenia na bloki 512 x 512 x 512
   .
   3. W następnym oknie skorzystaj z predefiniowanych ustawień. Ustaw 'tryb debugowania', aby wyświetlać wyniki co '5 iteracji'.
      UWAGA: Wynikiem dekonwolucji są dane 32-bitowe, jednak BigDataViewer obsługuje obecnie tylko dane 16-bitowe. Aby dołączyć dane wyjściowe dekonwolucji do istniejącego zestawu danych hdf5, należy je przekonwertować na 16-bitowy.
   4. W celu konwersji uruchom polecenie "Użyj min./maksimum pierwszego obrazu (może z czasem nasycić intensywność)".
      UWAGA: Dekonwolucja rozpocznie się od załadowania obrazów i przygotowania ich do dekonwolucji.
4. Serwer BigDataServer
   1. W celu udostępnienia bardzo dużych zbiorów danych XML/HDF5 należy użyć serwera http BigDataServer³³. Wprowadzenie do konfiguracji i łączenia się z takim serwerem można znaleźć na stronie http://fiji.sc/BigDataServer.
   2. Aby połączyć się z istniejącym serwerem BigDataServer, otwórz Fiji > Plugins > BigDataViewer > BrowseBigDataServer.
   3. Wprowadź adres URL wraz z portem w oknie.
      UWAGA: Filmy opisane w tej publikacji są dostępne pod tym adresem: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
   4. Obserwuj okno, które pozwala wybrać dostępne filmy. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć okno BigDataViewer i wyświetlić dane zgodnie z wcześniejszym opisem.

Uzupełnienie: Lista kontrolna materiałów potrzebnych przed rozpoczęciem

• Zarodki/larwy danio pręgowanego wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych (Przechowywać zarodki w pożywce E3 danio pręgowanego bez błękitu metylenowego. W przypadku etapów starszych niż 24 godziny przeciwdziałać pigmentacji, dodając PTU do końcowego stężenia 0,2 mM.)
• stereoskop fluorescencyjny
• kapilary (objętość 20 μl, z czarnym znacznikiem) i odpowiednie tłoki (Nie używać ponownie naczyń włosowatych. Z drugiej strony, tłoki mogą być ponownie użyte do kilku eksperymentów.)
• Plastikowe probówki 1,5 ml
• Ostra pęseta
• pipety szklane (polerowane ogniowo) lub plastikowe (plastikowe mogą być używane do 24-godzinnych i starszych zarodków)
• naczynia szklane lub plastikowe o średnicy 60 mm (plastik może być używany dla zarodków 24 godzin i starszych)
• dwie zlewki o pojemności 100 ml
• Strzykawka Luer-Lock o pojemności 50 ml z przedłużaczem o długości 150 cm do infuzji (wąż i strzykawka powinny być całkowicie suche pomiędzy eksperymentami, aby uniknąć zanieczyszczenia mikroorganizmami).
• plastelina
• agaroza o niskiej temperaturze topnienia (LMP)
• Podłoże E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM_MgSO4)
• MS-222 (Trikaina)
• fenylotiomocznik (PTU)
• Mikrosfery fluorescencyjne (zwane tutaj kulkami)
• podwójnie destylowany_H2O(ddH₂O)

Wyniki

LSFM to idealna metoda obrazowania procesów rozwojowych w różnych skalach. Zestawiono tu kilka aplikacji pokazujących zarówno krótko-, jak i długoterminowe obrazowanie struktur wewnątrzkomórkowych, a także komórek i całych tkanek. Przykłady te pokazują również, że LSFM jest użytecznym narzędziem na różnych etapach rozwoju oka, od tworzenia miseczki wzrokowej po neurogenezę siatkówki. Film 1 służy jako ilustracja ogólnego podejścia LSFM, najpierw pokazując pomniejszony widok nienaruszonego zarodka w zanurzającym się cylindrze agarozy w jasnym polu, a później pokazując szczegółowy widok siatkówki w kanale fluorescencyjnym.

Film 1: LSFM siatkówki danio pręgowanego. Aby zilustrować podejście LSFM, ten film pokazuje najpierw w jasnym polu, że zarodek jest obrazowany w stanie nienaruszonym wewnątrz cylindra agarozy przed przełączeniem na fluorescencję. Później okazuje się, że duże pole widzenia umożliwia obserwację całej siatkówki. Następnie film pokazuje powiększony mały obszar siatkówki, aby podkreślić dobrą rozdzielczość subkomórkową. Do obrazowania wykorzystano transgeniczny zarodek danio pręgowanego Ath5:gap-GFP³⁷. Ten transgen znakuje różne neurony w siatkówce (głównie komórki zwojowe i prekursory fotoreceptorów). Fluorescencyjna część filmu została zarejestrowana jako pojedynczy widok z dwustronnym oświetleniem przy użyciu obiektywu 40X/1,0 W z 5-minutowymi interwałami. Pokazano projekcję maksymalnej intensywności objętości o grubości 30 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film 2 pokazuje, jak bardzo szybko można uchwycić zdarzenia wewnątrzkomórkowe z wysoką rozdzielczością; w tym przypadku wzrost mikrotubul na ich plusie kończy się w neuronalnych komórkach progenitorowych siatkówki. Informacje zawarte w filmie pozwalają na śledzenie i ilościowe określenie mikrotubuli wraz ze wzrostem końcowym.

Film 2: Dynamika mikrotubul w pojedynczej komórce. Ten film przedstawia rosnące końcówki plusowe mikrotubul znakowanych białkiem markerowym końcówki dodatniej EB3-GFP³⁸. Białko ulega ekspresji w pojedynczej genecie progenitorowej siatkówki. Mikrotubule rosną głównie w kierunku od wierzchołka do podstawy (od góry do dołu). Średnia prędkość komet EB3 została zmierzona na 0,28 ±0,05 μm/s. Jasnym punktem po wierzchołkowej stronie komórki wykazującym wysoką aktywność zarodkowania mikrotubul jest centrosom. Zarodkowi typu dzikiego wstrzyknięto plazmidowe DNA hsp70:EB3-GFP. Film został zarejestrowany 4 godziny po szoku cieplnym (15 minut w temperaturze 37 °C) około 28 godziny po zapłodnieniu (hpf) jako nagranie pojedynczego widoku z jednostronnym oświetleniem przy użyciu obiektywu 63X/1,0 W i odstępach czasowych 1 s. Pojedyncza komórka została wykadrowana z pola widzenia obejmującego większą część siatkówki. Pokazana jest maksymalna projekcja intensywności dwóch plasterków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek 3 pokazuje, jak struktury wewnątrzkomórkowe mogą być śledzone przez wiele godzin. Tutaj wychwytywany jest centrosom w translokujących komórkach zwojowych siatkówki (RGC).

Ryc. 3: Lokalizacja centrosomów podczas translokacji komórek zwojowych siatkówki. Ten montaż eksperymentu poklatkowego pokazuje położenie centrosomu przez cały okres dojrzewania komórek zwojowych siatkówki (RGC). W neuronalnych komórkach progenitorowych centrosom jest zlokalizowany na samym końcu wyrostka wierzchołkowego (1:00). Podczas podziału komórki dwa centrosomy służą jako bieguny dla wrzeciona mitotycznego (2:25). W wyniku tego podziału powstaje jedna komórka potomna, która różnicuje się w RGC i druga komórka potomna, która staje się prekursorem komórki fotoreceptorowej. Po podziale ciało komórkowe RGC przemieszcza się na podstawową stronę siatkówki, podczas gdy wyrostek wierzchołkowy pozostaje przyczepiony po stronie wierzchołkowej. Gdy RGC dotrze do strony podstawnej, jego wyrostek wierzchołkowy odłącza się, a centrosom przemieszcza się wraz z nim (6:15). Centrosom można obserwować podczas stopniowego cofania się wraz z wyrostkiem wierzchołkowym (6:50, 7:20, 8:10). W ostatniej klatce (8:55) komórka zwojowa wyrasta aksonem od strony podstawy, podczas gdy centrosom jest nadal zlokalizowany wierzchołkowo. Ekspresję mozaiki osiągnięto poprzez wstrzyknięcie plazmidowego DNA do zarodka typu dzikiego na jednym etapie komórki. Komórki są wizualizowane przez konstrukt Ath5:GFP-caax (zielony), który oznacza RGC i inne neurony. Centrosomy (groty strzałek) są oznaczone ekspresją Centrin-tdTomato²⁹ (magenta). Wierzchołkowa strona siatkówki znajduje się u góry obrazu, a strona podstawowa u dołu. Pokazano projekcję maksymalnej intensywności objętości o grubości 30 μm. Obrazy zostały wykadrowane z filmu obejmującego całą siatkówkę. Film zaczyna się około 34 godziny po zapłodnieniu (hpf). Stos A z był uzyskiwany co 5 minut z obiektywem 40x/1,0 W. Czas jest wyświetlany w gg:mm. Podziałka skali reprezentuje 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na rysunku 4 pokazano, jak można wyodrębnić zachowanie pojedynczej komórki z danych przechwytujących całą tkankę, tak jak na Filmie 1. Translokację RGC można łatwo śledzić, a jego procesy wierzchołkowe i podstawowe śledzić.

Ryc. 4: Translokacja pojedynczej komórki zwojowej siatkówki. Translokacja RGC od strony wierzchołkowej do podstawnej siatkówki następuje po końcowej mitozie, jak opisano na rycinie 3. RGC jest znakowany przez ekspresję transgenu Ath5:gap-GFP³⁷. Pokazano projekcję maksymalnej intensywności objętości o grubości 30 μm. Obrazy zostały wykadrowane z filmu obejmującego całą siatkówkę. Film zaczyna się od około 34 hpf. Stos A z był uzyskiwany co 5 minut z obiektywem 40x/1,0 W. Czas jest wyświetlany w gg:mm. Podziałka skali reprezentuje 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5 pokazuje zdolność multiview LSFM do uchwycenia procesów morfogenetycznych w skali tkankowej z rozdzielczością komórkową na przykładzie morfogenezy kubka wzrokowego, podczas której pęcherzyk wzrokowy przekształca się w miseczkę wzrokową. Jakość obrazu można znacznie poprawić dzięki obrazowaniu wielowidokowemu, gdy końcowy obraz jest łączony z informacji z 5 różnych widoków (w tym przypadku) w jeden stos z o rozdzielczości izotropowej. Wykres ten ilustruje poprawę jakości obrazu po fuzji ze średnią ważoną oraz dalszy wzrost kontrastu i rozdzielczości obrazu po dekonwolucji wielu widoków. Na rysunku przedstawiono dwa wycinki optyczne w różnych orientacjach w zestawie danych. Dodatkowo, montaż z dekonwolucyjnego zestawu danych pokazuje morfogenezę kubka wzrokowego w czasie. Wszystkie punkty czasowe są następnie wyświetlane w filmie 3.

Rysunek 5: Porównanie jakości obrazu między pojedynczym widokiem a dwiema metodami fuzji wielowidokowej. (A) Jeden wycinek optyczny danych z pojedynczego widoku pokazanego z widoku bocznego i (B) widok grzbietowy. Widoczne są artefakty paskowe i degradacja sygnału w głębi próbki. Również część obrazu widoczna w scalonych danych (C-F) nie została uchwycona w tym konkretnym widoku. (C) Ten sam wycinek optyczny, teraz jako multiview połączone dane pokazane z widoku bocznego i (D) widoku grzbietowego. Należy pamiętać, że artefakty paskowe są tłumione, a struktury znajdujące się głęboko w próbce są lepiej rozpoznawane. (E) Ten sam wycinek optyczny teraz, co multiview zdekonwolucjonizowane dane pokazane z widoku bocznego i (F) widok grzbietowy. Zwróć uwagę na zwiększony kontrast i rozdzielczość, dzięki czemu można dobrze rozróżnić poszczególne błony i jądra komórkowe. Rozdzielczość nie ulega znacznemu pogorszeniu w głębi próbki. Zestaw danych został uzyskany przy dwustronnym oświetleniu z 5 widoków oddalonych od siebie o około 20 stopni. Stosy z o wielkości około 100 μm z krokiem 1,5 μm były rejestrowane przy każdym widoku w 10-minutowych odstępach czasu przez 10 godzin z obiektywem 20X/1,0 W. Obrazy wejściowe do fuzji i dekonwolucji multiview były próbkowane w dół o 2× w celu przyspieszenia przetwarzania obrazu. Uruchomiono 15 iteracji dekonwolucji multiview. (G) Montaż pokazuje przycięty obszar widoku grzbietowego na podstawie zdekonwoluowanych danych, aby podkreślić zdarzenia morfogenetyczne podczas wczesnego rozwoju oka od pęcherzyka wzrokowego do stadium miseczki wzrokowej. Dwie warstwy pęcherzyka wzrokowego, które początkowo są podobnym nabłonkiem walcowatym, różnicują się w odrębne populacje komórek. Warstwa dystalna blisko naskórka staje się nabłonkiem nerwowym siatkówki (RN), a warstwa proksymalna blisko cewy nerwowej staje się nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RP). Komórki w RN wydłużają się i wnikają, tworząc miseczkę optykową (1:40 do 5:00); w tym samym czasie komórki RP spłaszczają się. Ektoderma powierzchniowa jest indukowana do tworzenia soczewki (1:40), która później się wnika (5:00). Film zaczyna się od 17 hpf. Czas jest wyświetlany w gg:mm. Wszystkie błony komórkowe są znakowane przez transgen β-aktyny:ras-GFP, a wszystkie jądra są znakowane przez transgen hsp70:H2B-RFP. Pasek skali reprezentuje 30 μm. FB przodomózgowie, soczewka LE, plakod węchowy OP, nabłonek neuronabłonka siatkówki RN, nabłonek barwnikowy siatkówki RP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 3: Morogeneza kubka nerwu wzrokowego pokazana w jednym widoku i dwóch metodach fuzji wielowidokowej. Film poklatkowy ilustruje cały proces morfogenezy kubka wzrokowego od pęcherzyka wzrokowego do stadium miseczki wzrokowej. Pokazuje pojedynczy wycinek optyczny z widoku bocznego (na górze) i pojedynczy wycinek optyczny z widoku grzbietowego (na dole). Komórki rozwijającego się pęcherzyka wzrokowego ulegają złożonym przegrupowaniom, aby ostatecznie utworzyć półkulistą miseczkę nerwu wzrokowego z wewnętrznym nabłonkiem neuronabłonka siatkówki i zewnętrznym nabłonkiem barwnikowym siatkówki. Soczewka powstaje z powierzchni ektodermy. Wnika wraz z nabłonkiem nerwowym i znajduje się w miseczce optycznej. Wszystkie błony komórkowe są znakowane ekspresją transgenu β-aktyny: ras-GFP (zielone), a jądra są znakowane hsp70:H2B-RFP (magenta). Film zaczyna się od około 17 hpf. Zestaw danych został pozyskany z dwustronnym oświetleniem z 5 widoków oddalonych od siebie o około 20 stopni, a stosy z około 100 μm były rejestrowane co 10 minut w przypadku obiektywu 20X/1,0 W. Czas jest wyświetlany w gg:mm. Podziałka reprezentuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

1. Krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów związanych z pozyskiwaniem danych

Typowe ustawienia obrazowania dla próbki wyrażającej GFP i RFP można znaleźć w tabeli 3. W opisanym ustawieniu mikroskopu arkusz światła jest statyczny, utworzony przez cylindryczną soczewkę. Dwa obiektywy oświetleniowe to soczewki powietrzne, a obiektyw wykrywania to soczewka zanurzająca się w wodzie. Zoom 1.0 z obiektywami 20X/1.0 lub 40X/1.0 zapewnia rozmiar piksela 230 nm i 115 nm oraz pole widzenia odpowiednio 441 x 441 μm lub 221 x 221 μm. Zaleca się stosowanie domyślnej grubości jasnego arkusza ze stosunkiem środka do obramowania 1:2. Dla 20X/1,0 grubość ta odpowiada 4,5 μm, a dla 40X/1,0 do 3,2 μm w środku. Jeśli szybkość obrazowania nie jest głównym priorytetem, należy użyć oddzielnych ścieżek w przypadku próbki wielokolorowej, aby uniknąć przesłuchów emisji fluorescencji między kanałami. Najwyższa prędkość akwizycji jest ograniczona do 50 ms na krok z przez prędkość ruchu sterownika z. Jeśli celem jest osiągnięcie maksymalnej prędkości obrazowania w przypadku np. dwóch ścieżek z dwustronnym oświetleniem, czas naświetlania musi być tak ustawiony, aby suma wszystkich obrazów wykonanych na krok z była mniejsza niż 50 ms. Z drugiej strony, jeśli rejestrowany jest tylko pojedynczy obraz na krok z, nie jest korzystne ustawianie czasu naświetlania krótszego niż 50 ms.

Rozmiar obrazu 1920 x 1920

16-bitowy

Skanowanie w pozycji pivot włączone

Dwustronne podświetlenie z fuzją online

Obiektyw z oświetleniem 10x/0,2

Planapochromatyczny obiektyw detekcyjny 20x/1,0 W

Ścieżka 1: Wzbudzenie 488 nm typowo 2% lasera 100 mW, filtr emisyjny SP 550 nm

Ścieżka 2: Wzbudzenie 561 nm typowo 3% lasera 75 mW, filtr emisyjny 585 nm LP

Czas naświetlania do 100 ms

Grubość stosu Z 50-100 μm

Wielkość kroku 1-1,5 μm Z w trybie ciągłego napędu Z

Inkubacja w temperaturze 28,5 °C

Tabela 3: Ustawienia obrazowania.

Oględziny próbki po eksperymencie

Ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest nadal zdrowa pod koniec eksperymentu. Jako pierwszy odczyt sprawdź bicie serca próbki pod stereoskopem. Za pomocą pary ostrych kleszczyków próbkę można wyjąć z agarozy i przenieść do inkubatora w celu dalszego rozwoju w celu sprawdzenia, czy obrazowanie miało na nią wpływ. Alternatywnie można go utrwalić do barwienia przeciwciałami.

Montaż i dryf

Istotne jest, aby osmolarność roztworu komory była zbliżona do osmolarności agarozy zatapiającej, w przeciwnym razie dojdzie do pęcznienia/kurczenia się agarozy, a następnie niestabilności próbki. Dlatego należy użyć tego samego roztworu (pożywka E3 bez błękitu metylenowego) do napełnienia komory i przygotowania 1% podwielokrotności agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Dodatkowo nie należy pozostawiać agarozy w bloku grzewczym o temperaturze 70 °C na dłużej niż 2 godziny, ponieważ może ona stracić swoje właściwości żelujące.

Nie umieszczaj ryb w zbyt gorącej agarozie, ponieważ może to prowadzić do reakcji szoku cieplnego lub śmierci zarodka. Jeśli nie masz pewności co do wpływu ciepłej agarozy na zarodki, sprawdź, czy ogon się nie zgina i czy tętno nie zwalnia. Jeśli tak się stanie, użyj innego zarodka do eksperymentu.

Całkowita długość kolumny agarozowej z próbką powinna być krótka (około 2 cm) i należy zamontować danio pręgowanego z głową skierowaną w stronę końcówki tłoka. Podobnie cylinder agarozy wyciśnięty z kapilary powinien być utrzymywany tak krótko, jak to możliwe. Środki te zapewnią stabilność próbki przez cały czas trwania filmu. Jednocześnie kolumna agarozy musi być na tyle długa, aby sama szklana kapilara nie sięgała do ścieżki światła, ponieważ spowodowałoby to duże załamanie i odbicie.

Początkowy dryft próbki jest spowodowany zmianami objętości samego cylindra agarozy. Przesuwanie się tłoka nie jest tego powodem. Dlatego nie pomaga mocowanie tłoka plasteliną lub lakierem do paznokci. Zarodek może również zmienić swoją pozycję podczas filmu ze względu na swój naturalny wzrost. W związku z tym zaleca się wyśrodkowanie obszaru zainteresowania w środku pola widzenia i pozostawienie trochę miejsca na krawędziach, aby dostosować się do tych ruchów.

Zmniejszona ilość medium osadzającego się w ścieżce światła

Prawidłowa orientacja próbki pomaga osiągnąć najlepszą możliwą jakość obrazu¹⁵. Ogólnie rzecz biorąc, światło wzbudzenia i emisji powinno przechodzić przez jak najmniejszą ilość tkanek i mediów montażowych. Optymalnym rozwiązaniem jest montaż bez agarozy. Udało się to osiągnąć na przykład w konfiguracji do obrazowania korzeni bocznych Arabidopsis¹⁴, w której główny korzeń został zamontowany w fitamelu, a korzenie boczne zostały następnie pozostawione do całkowitego wyrośnięcia z kolumny żelowej. Opracowano również montaż bez agarozy do obrazowania pełnej embriogenezy chrząszcza Tribolium w ciągu dwóch dni¹². Poprawa jakości obrazu nie była w tym przypadku główną motywacją. Zarodki Tribolium po prostu nie przeżywają w agarozie wystarczająco długo. Nie udało się uzyskać całkowicie bezpodłożywnego montażu w przypadku długotrwałego obrazowania u danio pręgowanego. Mimo to możemy wykorzystać fakt, że gdy agaroza krzepnie, większość zarodków jest umieszczona po przekątnej w kapilarze, przy czym jedno oko znajduje się głęboko w agarozie, a drugie oko znajduje się blisko powierzchni kolumny osadzającej. Oko znajdujące się bliżej powierzchni zapewnia lepszą jakość obrazu i dlatego powinno być obrazowane preferencyjnie.

Koncentracja agarozy i obrazowanie długoterminowe

Stężenie agarozy do montażu jest kompromisem między stabilnością próbki a możliwością dostosowania się do wzrostu zarodka i dyfuzji tlenu do niego. Nie ma dodatkowego wzrostu stabilności próbki przy stosowaniu stężeń agarozy wyższych niż 1%. Jako punkt wyjścia do optymalizacji eksperymentów zalecamy 0,6% agarozy, która jest również odpowiednia dla zarodków poniżej 24 hpf, które są zbyt delikatne, aby można je było zmontować w 1% agarozie. Aby znieczulić starsze zarodki i larwy, stężenie MS-222 można zwiększyć do 200 μg/ml bez skutków ubocznych¹³.

W przypadku, gdy rozwijające się zarodki są obrazowane dłużej niż ±12 godzin, montaż agarozy nie jest zalecany, ponieważ ogranicza wzrost zarodka i powoduje deformację ogona. Problem ten został rozwiązany w przypadku danio pręgowanego poprzez umieszczenie zarodków w rurkach polimerowych FEP o współczynniku załamania światła podobnym do wody^13,39. Z drugiej strony zarodki myszy mogą być unieruchomione w wydrążonych cylindrach agarozowych⁴⁰ lub w otworach akrylowego pręta przymocowanego do strzykawki⁴¹. Montaż rurki FEP nie jest jednak zalecany jako metoda domyślna, ponieważ ścianka rurki załamuje światło nieco bardziej niż agaroza.

Wyrównanie arkusza świetlnego

Aby uzyskać dobrą jakość obrazu, ważne jest, aby przed każdym eksperymentem wykonać automatyczne wyrównanie arkusza świetlnego. Zwłaszcza, jeśli zmieniono ustawienia zoomu, wyjęto obiektywy lub użyto innego płynu w komorze.

Oświetlenie

Skanowanie obrotowe arkusza świetlnego powinno być zawsze aktywne. W przypadku próbek o dużym rozproszeniu konieczne jest zastosowanie dwustronnego oświetlenia z fuzją online, aby uzyskać równomierne oświetlenie w całym polu widzenia. Dwustronne oświetlenie zmniejsza również specyficzny problem obrazowania oka, jakim jest załamanie wpadającego arkusza światła przez soczewkę zarodka. Mniejsze, mniej rozproszone próbki można efektywnie obrazować za pomocą jednostronnego oświetlenia, które skraca czas obrazowania o połowę i może skutkować nieco lepszą jakością obrazu w porównaniu z oświetleniem dwustronnym. Dzieje się tak dlatego, że ścieżki świetlne dla dwóch ramion oświetleniowych są zawsze różne i można wybrać bardziej wydajną z nich. Dodatkowo dwie jasne tafle padające z każdej strony nigdy nie znajdują się idealnie w jednej płaszczyźnie, co powoduje lekkie rozmycie po stopieniu. W przypadku bardzo szybkich zdarzeń wewnątrzkomórkowych, takich jak rosnące mikrotubule (film 2), dwustronne oświetlenie nie jest odpowiednie, ponieważ obrazy z oświetleniem z lewej i prawej strony są pozyskiwane sekwencyjnie, co może powodować rozmycie ruchu.

Fotowybielanie i fototoksyczność

Mniejsze fotowybielanie fluoroforem jest często wymieniane jako główna zaleta LSFM. Uważamy, że celem nie powinno być w ogóle fotowybielanie. Jeśli w eksperymencie obrazowania na żywo zauważalne jest fotowybielanie, próbka prawdopodobnie jest już poza fizjologicznym zakresem tolerowanej ekspozycji na laser. Z naszego doświadczenia wynika, że podczas obrazowania zarodków danio pręgowanego w mikroskopie z wirującym dyskiem wysoka fototoksyczność może zatrzymać rozwój zarodka, nawet zanim sygnał fluorescencyjny wyraźnie zblednie. Dlatego ustawienia obrazowania w LSFM należy dostosować tak, aby zaobserwowano niewielkie lub żadne fotowybielanie. Mimo że LSFM jest łagodny dla próbki, rozsądne jest użycie tylko tyle mocy lasera i czasu ekspozycji, ile jest potrzebne do uzyskania stosunku sygnału do szumu wystarczającego do późniejszej analizy danych.

Z-stack, przedziały czasowe i rozmiar danych

Pliki generowane przez LSFM są zwykle bardzo duże; czasami w zakresie terabajtów. Często konieczne jest dokonanie kompromisu między jakością obrazu a rozmiarem danych. Dotyczy to w szczególności odstępów z stosów i interwałów w akwizycjach poklatkowych. Do zdefiniowania interwałów z najlepiej byłoby użyć przycisku Optymalna na karcie narzędzia Z-stack, zwłaszcza jeśli zestaw danych będzie później zdekonwoluowany. Oblicza odstępy, aby uzyskać 50% zachodzenia na siebie między sąsiednimi warstwami optycznymi. Mimo to zwykle dopuszczalne są nieco większe interwały z. Skracają one czas potrzebny na uzyskanie stosu z, a także ostateczny rozmiar pliku. Optymalny czas pobierania próbek zależy od interesującego nas procesu. Dla ogólnego rozwoju oczu zwykle dopuszczalne są odstępy 5-10 minut. Jeśli niektóre struktury mają być śledzone automatycznie, kolejne punkty czasowe muszą być wystarczająco podobne.

Koraliki fluorescencyjne

Koraliki fluorescencyjne służą przede wszystkim jako znaczniki odniesienia do rejestrowania różnych widoków zestawu danych multiview na sobie. Zawsze dokładnie zmieszaj roztwory kulek przed użyciem. Nie podgrzewaj koralików, ponieważ może to prowadzić do utraty barwnika fluorescencyjnego. Optymalne stężenie ściegów dla rejestracji multiview musi zostać określone doświadczalnie. Opisana wtyczka działa najlepiej z około 1,000 wykrytymi koralikami w każdym widoku. Większe (500 nm lub 1 000 nm) kulki są wykrywane bardziej niezawodnie niż mniejsze (mniej niż 500 nm) kulki. Dzieje się tak, ponieważ większe kulki są jaśniejsze i łatwiejsze do segmentacji bez fałszywie dodatnich detekcji struktur w próbce. Wadą większych koralików jest to, że są one bardzo widoczne w końcowym obrazie stopionym i zdekonwoluowanym. Dla każdego nowego markera fluorescencyjnego należy zoptymalizować odpowiedni rozmiar ściegu i emisję fluorescencji. Aby podać przykład próbki z rysunku 5 i filmu 3, zielone kulki emisyjne o długości 100 nm dały zbyt wiele fałszywych alarmów w kanale membranowym-GFP, ale czerwone kulki emisji 1,000 nm zostały solidnie wykryte w kanale H2B-RFP z bardzo małą liczbą pozytywnych wykryć wewnątrz próbki. Jeśli wykrywanie kulek nie powiedzie się w kanale ze znacznikiem fluorescencyjnym, można uzyskać oddzielny kanał zawierający tylko koraliki, ale nie jest to zbyt praktyczne. Koraliki o rozmiarach podrozdzielczych dają bezpośredni odczyt funkcji rozproszenia punktowego (PSF) mikroskopu, która może być używana do dekonwolucji (rysunek 2C-D). Jeśli rejestracja i fuzja działa lepiej z większymi kulkami (np. 1000 nm), osobny obraz PSF można uzyskać za pomocą kulek o niższej rozdzielczości, np. 100 nm. Używanie wielokolorowych koralików jest pomocne podczas rejestracji akwizycji wielokanałowej i sprawdzania, czy kanały idealnie się nakładają.

Dodawanie kulek fluorescencyjnych nie jest konieczne w przypadku obrazowania z jednego widoku bez późniejszej rejestracji i fuzji w wielu widokach. Jednak nawet w takich przypadkach koraliki mogą być pomocne podczas początkowej regulacji arkusza świetlnego w celu sprawdzenia jakości arkusza świetlnego i ogólnie ujawnienia aberracji optycznych. Takie aberracje optyczne mogą pochodzić z różnych źródeł, takich jak uszkodzone lub brudne obiektywy, brudne okna komory lub niejednorodność agarozy. Koraliki mogą być również używane do korekcji dryfu za pomocą wtyczki Multiview Registration Fiji²⁰.

Multiview

W celu rekonstrukcji wielu widoków lepiej jest uzyskać nieparzystą liczbę widoków 3, 5 i tak dalej, które nie są przeciwstawne do siebie. Poprawia to dekonwolucję, ponieważ PSF są obrazowane z różnych kierunków. Ważne jest również, aby na początku akwizycji poklatkowej potwierdzić, że widoki w wystarczającym stopniu się pokrywają. Najlepiej dokonać tego empirycznie, tj. natychmiast potwierdzając, że wyświetlenia w pierwszym punkcie czasowym mogą być z powodzeniem zarejestrowane. Gdy celem akwizycji multiview jest zwiększenie rozdzielczości obrazu próbki o dużym rozproszeniu, nie zaleca się obrazowania całej próbki w każdym widoku, ale zatrzymanie się wokół środka próbki, gdzie sygnał ulega pogorszeniu. Niska jakość pozyskania z drugiej połowy okazu nie wniosłaby użytecznych informacji do rekonstrukcji multiview.

2. Kroki krytyczne i rozwiązywanie problemów związanych z przetwarzaniem danych

Obecnie istnieje kilka możliwości przetwarzania danych multiview z mikroskopu arkuszowego światła, które są dobrze udokumentowane i stosunkowo łatwe do zaadoptowania. Korzystamy z aplikacji do rekonstrukcji multiview, która jest oprogramowaniem open source zaimplementowanym na Fidżi³² (Stephan Preibisch niepublikowany, Link 1a i Link1b w Liście Materiałów). Ta wtyczka jest poważnym przeprojektowaniem poprzedniej wtyczki rejestracji SPIM²⁰, zrecenzowanej przez Schmied et al.⁴², integrując BigDataViewer i jego format XML i HDF5³³ z przepływem pracy rejestracji SPIM (Rysunek 1B, Łącze 2, Łącze 3). Aplikacja ta może być również dostosowana do klastrów obliczeniowych o wysokiej wydajności, co znacznie przyspiesza przetwarzanie⁴³. Ta aplikacja do rejestracji wielu widoków jest aktywnie rozwijana i stale ulepszana. W przypadku problemów lub próśb o funkcje dla opisanego oprogramowania, prosimy o zgłaszanie problemów na odpowiednich stronach GitHub (Link 4 dla Multiview Reconstruction i Link 5 dla BigDataViewer).

Drugą opcją jest skorzystanie z komercyjnego oprogramowania dostępnego wraz z mikroskopem. To rozwiązanie działa dobrze i wykorzystuje tę samą zasadę, co użycie koralików fluorescencyjnych do rejestrowania różnych widoków. Brakuje jednak opcji szybkiej wizualizacji całego zestawu danych, jak w przypadku BigDataViewer. Ponadto oprogramowanie nie może być dostosowane do klastra, a ponadto przetwarzanie blokuje mikroskop dla innych użytkowników, chyba że zostanie zakupiona dodatkowa licencja na oprogramowanie.

Trzecia opcja, która również jest oprogramowaniem typu open source, została niedawno opublikowana przez Keller lab⁴⁴ i zapewnia kompleksowe ramy do przetwarzania i dalszej analizy danych z arkusza świetlnego. To oprogramowanie wykorzystuje informacje z wnętrza próbki do przeprowadzania fuzji wielowidokowej, dlatego nie wymaga obecności koralików fluorescencyjnych wokół próbki. Ale jednocześnie zakłada ortogonalną orientację widoków obrazowania (obiektywów), więc nie może być używany do danych pozyskanych pod dowolnymi kątami⁴⁴.

Wymagania sprzętowe

Sprzęt używany do przetwarzania można znaleźć w tabeli 4. Przed właściwym eksperymentem musi być dostępna wystarczająca pojemność pamięci masowej i przejrzysty potok przetwarzania danych. Akwizycja obrazów jest szybsza niż późniejsza analiza i łatwo jest zostać zalanym nieprzetworzonymi danymi. Często nierealne jest przechowywanie wszystkich surowych obrazów, ale raczej przyciętej wersji lub przetworzonych obrazów, takich jak widoki połączone, projekcje o maksymalnej intensywności lub projekcje sferyczne⁴⁵.

Procesor	Dwa procesory Intel Xeon E5-2630 (sześciordzeniowe, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT/s)
Pamięć	128 GB (16×8 GB) pamięci DDR3 ECC RDIMM 1600 MHz
Dysk twardy	Dysk twardy 4×4 TB 3,5 cala Serial ATA (7.200 obr./min)
Kontroler dysku twardego	Kontroler PERC H310 SATA/SAS do stacji roboczej Dell Precision
Konfiguracja dysku twardego	C1 SATA 3,5 cala, 1-4 dyski twarde
Grafika	Dwa karty NVIDIA Quadro 4000 o pojemności 2 GB (2 karty z 2 DP i 1 DVI-I każda) (2 adaptery DP-DVI i 2 DVI-VGA) (MRGA17H)
Sieć	Dwuportowa karta sieciowa Intel X520-T2 10 GbE

Tabela 4: Wymagania sprzętowe.

Szybkość przetwarzania danych

Czas potrzebny na przetworzenie danych zależy od wymiarów danych oraz od używanego sprzętu. W tabeli 1 przedstawiono przegląd czasu wymaganego do wykonania kluczowych kroków w przetwarzaniu przykładowego zestawu danych multiview o rozmiarze 8,6 GB, który składał się z 1 punktu czasowego z 4 widokami i 2 kanałami.

Etap przetwarzania	Godzina	Krok protokołu
Ponowne zapisywanie jako HDF5	6 min 30 sek	6.3
Wykrywanie punktów zainteresowania	20 sekund	6.4
Zarejestruj się, korzystając z punktów procentowych	3 sekundy	6.5
Fuzja wielu widoków w oparciu o zawartość	4 godz	7.2
Dekonwolucja wielu widoków (CPU)	8 godz	7.3
Dekonwolucja wielu widoków (GPU)	2 godz.	7.3

Tabela 1: Czas przetwarzania danych.

Formaty danych wejściowych do rekonstrukcji multiview

Fiji Plugin Multiview Reconstruction może obsługiwać formaty .czi, .tif i ome.tiff. Ze względu na strukturę danych w formacie .czi nieciągłe zestawy danych nie są obsługiwane bez wstępnego przetwarzania. Nieciągły oznacza, że zapis musiał zostać wznowiony (np. w celu ponownego dostosowania pozycji z powodu dryftu próbki). W takim przypadku pliki .czi muszą zostać ponownie zapisane jako .tif. W przypadku plików .tif każdy widok i kierunek oświetlenia muszą być zapisane jako osobny plik.

Kalibracja rozmiaru piksela

Oprogramowanie obsługujące mikroskop oblicza kalibrację dla rozmiaru piksela xy na podstawie wybranego obiektywu. Jednak rozmiar piksela w z jest definiowany niezależnie przez rozmiar kroku. Jeśli w oprogramowaniu zostanie określony nieprawidłowy cel, stosunek xy do z jest nieprawidłowy i rejestracja nie powiedzie się.

Pierwsza rejestracja

Po zdefiniowaniu zestawu danych liczba rejestracji będzie wynosić 1, a liczba punktów zainteresowania będzie wynosić 0 w Eksploratorze ViewSetup. Początkowa rejestracja reprezentuje kalibrację zestawu danych. Zarówno liczba rejestracji, jak i punktów procentowych wzrośnie w trakcie przetwarzania.

Próbkowanie w dół w celu wykrycia punktów zainteresowania

Zaleca się korzystanie z próbkowania w dół, ponieważ ładowanie plików i segmentacja będą znacznie szybsze. Należy jednak pamiętać, że parametry detekcji będą się zmieniać w zależności od próbkowania w dół, dlatego przenoszenie ustawień wykrywania między różnymi ustawieniami próbki w dół nie jest możliwe.

Wykrywanie punktów zainteresowania

Zaleca się segmentację jak największej liczby prawdziwych koralików w każdym widoku, nawet za cenę uzyskania niektórych fałszywych alarmów, ponieważ nie utrudniają one znacznie rejestracji. Fałszywe detekcje, jeśli jest ich niewiele, są wykluczane podczas rejestracji (patrz Rejestracja punktów zainteresowania). Jednak masowe wykrycia fałszywych alarmów stanowią problem dla algorytmu. Nie tylko zmniejsza to wydajność wykrywania i rejestracji, ponieważ segmentacja obrazu, a także porównywanie tych koralików między widokami, zajmuje znacznie więcej czasu, ale także zmniejsza dokładność rejestracji. Można temu zaradzić, stosując bardziej rygorystyczne parametry wykrywania. Dodatkowo, nadmierna segmentacja koralików (tj. wielokrotne wykrycia na jednym koraliku Rysunek 1E) jest szkodliwa dla rejestracji i należy jej unikać.

Rejestracja punktów oprocentowania

Aby zarejestrować widoki względem siebie, położenie każdego ściegu w każdym widoku jest opisane przez jego położenie względem trzech najbliższych sąsiednich ściegów. Konstelacje te tworzą lokalny deskryptor geometryczny i umożliwiają porównywanie każdego koralika między widokami. Koraliki z pasującym deskryptorem między dwoma widokami są następnie traktowane jako korespondencje kandydatów. Należy pamiętać, że działa to tylko w przypadku losowo rozmieszczonych koralików, dla których lokalne deskryptory są zazwyczaj unikalne dla każdego koralika. Do rejestracji można użyć innych struktur, takich jak jądra w próbce. Jednak w celu wykrycia jąder, które są rozmieszczone w próbce w sposób nielosowy, stosuje się inne metody^20,21.

Korespondencja kandydatów jest następnie testowana pod kątem RANSAC³⁶ w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich. Każda korespondencja sugeruje model transformacji, który nakłada na siebie widoki. Prawdziwe powiązania prawdopodobnie zgadzałyby się co do jednego modelu transformacji, podczas gdy wartości odstające wskazywałyby na inny. Rzeczywiste zależności są następnie wykorzystywane do obliczenia modelu transformacji afinicznej między dwoma porównywanymi widokami. Następnie przeprowadzana jest globalna optymalizacja za pomocą iteracyjnego algorytmu optymalizacji , podczas której wszystkie widoki są rejestrowane w pierwszym widoku w celu zminimalizowania przemieszczenia między widokami^20,21.

Rejestracja poklatkowa

Ze względu na ruch agarozy i nieprecyzyjny ruch motoryczny stolika mikroskopowego, położenie każdego stosu zmienia się umiarkowanie w czasie. Podczas gdy rejestracja pojedynczego punktu czasowego usuwa różnicę między widokami tego punktu czasowego, upływ czasu musi być również zarejestrowany jako całość. W tym celu każdy pojedynczy punkt czasowy jest rejestrowany w referencyjnym punkcie czasowym.

Punkt czasowy odniesienia

Jeśli przetwarzany jest szereg czasowy z wieloma punktami czasowymi, reprezentatywny punkt czasowy jest wybierany jako odniesienie zwykle ze środka szeregu czasowego, ponieważ intensywność ściegu może z czasem ulec pogorszeniu z powodu bielenia. Na tym odwołaniu można określić parametry wykrywania punktów zainteresowania, rejestracji, pola ograniczenia i fuzji. Parametry te są następnie stosowane do całego upływu czasu w celu obliczenia określonego modelu transformacji dla każdego pojedynczego punktu czasowego. Podczas rejestracji poklatkowej wszystkie inne punkty czasowe są również rejestrowane przestrzennie w tym punkcie czasowym odniesienia. W związku z tym parametry pola ograniczenia dla całego nagrania są zależne od tego konkretnego punktu czasowego.

Rejestracja wielokanałowa

W przypadku obrazowania wielu kanałów, idealnie byłoby, gdyby te same koraliki fluorescencyjne były widoczne we wszystkich obrazowanych kanałach. Detekcja i rejestracja mogą być następnie wykonywane na każdym kanale indywidualnie, co uwzględnia wpływ różnych długości fal świetlnych na transformację. Często nie jest to możliwe, ponieważ koraliki nie są widoczne we wszystkich kanałach lub koraliki zbyt mocno dominują nad obrazem w jednym kanale i są zbyt przyciemnione w drugim kanale (kanałach). Typowym rozwiązaniem jest użycie koralików widocznych tylko w jednym kanale do detekcji i rejestracji, a uzyskany model transformacji (tj. po wykryciu, rejestracji i rejestracji poklatkowej) jest następnie stosowany do pozostałych kanałów przez Fiji > Plugins > Multiview Reconstruction > Batch Processing > Tools > Duplicate Transformations. Z menu rozwijanego Zastosuj transformację wybierz opcję Jeden kanał do innych kanałów. W następnym oknie wybierz plik XML i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz kanał, który zawiera koraliki, jako kanał źródłowy , a jako kanał docelowy wybierz kanał(y) bez koralików. W polu Duplikuj, które przekształcenia używają opcji Zamień wszystkie przekształcenia , naciśnij przycisk OK. Transformacje są następnie kopiowane do wszystkich innych kanałów i zapisywane w pliku XML. Aby wyświetlić nowe przekształcenia w Eksploratorze ViewSetup, uruchom ponownie aplikację MultiView Reconstruction.

Obwiedni

Fuzja wielu widoków jest bardzo intensywna obliczeniowo. Jednak duże obrazy są zwykle pozyskiwane, aby pomieścić nie tylko próbkę, ale także otaczające ją koraliki. Po wyodrębnieniu parametrów pasowania z koralików nie są one już przydatne jako część obrazu. Dlatego, aby zwiększyć wydajność fuzji, tylko części stosów obrazów zawierających próbkę powinny być ze sobą połączone. Obszar zainteresowania (ramka ograniczająca) powinien być zdefiniowany w taki sposób, aby zawierał próbkę i jak najmniej otaczającej go agarozy. W przykładzie na rysunku 2 fuzja średniej ważonej na całym woluminie o pojemności 2229×2136×2106 pikseli wymagałaby 38 196 MB pamięci RAM, podczas gdy w przypadku pola ograniczenia wolumin jest zmniejszony do 1634×1746×1632 pikseli, a wymagania dotyczące pamięci są zmniejszone do 17 729 MB.

Fuzja wielu widoków w oparciu o zawartość

Wyzwaniem związanym z łączeniem danych z wielu widoków jest to, że widoki zwykle kończą się nagle i nie zawierają tej samej jakości obrazu dla tych samych wokseli. Proste uśrednianie widoków prowadziłoby zatem do mieszania artefaktów i niepotrzebnej degradacji obrazu. Fuzja multiwidoków oparta na treści uwzględnia oba te problemy. Po pierwsze, łączy różne widoki, w których jeden obraz się kończy, a drugi zaczyna, a po drugie, ocenia lokalną jakość obrazu i stosuje wyższe wagi do wyższej jakości obrazu w fusion²¹. W porównaniu z pojedynczym widokiem nastąpiła poprawa rozdzielczości w z z niewielkim pogorszeniem sygnału w xy (Rysunek 2E-H, Rysunek 5A-D).

Dekonwolucja wielu widoków

Dekonwolucja wielu widoków to inne podejście do osiągnięcia fuzji widoków. W przypadku tej metody brane są również pod uwagę PSF różnych widoków w celu odzyskania obrazu, który został przekształcony przez optykę mikroskopu. Metoda ta radykalnie poprawia jakość obrazu poprzez usunięcie rozmycia obrazu oraz zwiększenie rozdzielczości i kontrastu sygnału³¹ (Rysunek 2C-D, Rysunek 2I-J, Rysunek 5E-G, Film 3).

Dekonwolucja jest bardzo intensywna obliczeniowo (patrz Tabela 1), dlatego użycie procesora graficznego do przetwarzania zwiększa szybkość tego procesu. Może być również konieczne przeprowadzenie dekonwolucji na próbkowanych danych. Aby pobrać próbkę, użyj narzędzi Fiji > Multiview Reconstruction > Batch Processing > Tools > Apply Transformations. Spowoduje to zastosowanie nowego modelu transformacji do widoków, które zostaną zapisane w pliku .xml.

Format pliku HDF5 dla BigDataViewer i BigDataServer

BigDataViewer³³ umożliwia łatwą wizualizację danych o rozmiarze terabajtów. Sposób sterowania BigDataViewer podsumowano w Tabeli 2. Zrzut ekranu przedstawiający podstawowe działanie programu jest również dostępny jako dodatek do jego oryginalnej publikacji³³. BigDataViewer jest wyśrodkowany na pliku .xml, który zawiera metadane, oraz na pliku hdf5, który zawiera dane obrazu. Dane obrazu są obecne w hdf5 na wielu poziomach rozdzielczości w blokach 3D. Wiele poziomów rozdzielczości pozwala na szybszą wizualizację danych przy niższej rozdzielczości, przed załadowaniem pełnej rozdzielczości. Poszczególne bloki są ładowane do pamięci tylko wtedy, gdy jest to potrzebne. W ten sposób format obrazu hdf5 umożliwia bezpośrednią i szybką wizualizację danych za pomocą BigDataViewer³³. Przyspiesza to również przetwarzanie, ponieważ ładowanie plików odbywa się bardziej efektywnie. W związku z tym zalecamy ponowne zapisanie zestawu danych w tym formacie, chociaż nie jest on ściśle wymagany do przetwarzania. Więcej informacji na temat formatu danych można znaleźć pod linkiem 3. Ponadto zbiory danych mogą być udostępniane współpracownikom lub publicznie za pomocą BigDataServer³³ (Link 6).

klucz	efekt
F1	wyświetla Pomoc z krótkim opisem BigDataViewer i jego podstawowej obsługi
< > lub kółko myszy	Ruch w Z
strzałka w górę i w dół	Powiększanie i pomniejszanie
Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij	Przesuwa próbkę w przeglądarce
Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij	Obraca próbkę wokół kursora
suwak u dołu przeglądarki lub karty i strzałka w lewo lub w prawo	porusza się po osi czasu
dodatkowo wciśnięcie SHIFT	szybszy ruch lub obrót wzdłuż dowolnej osi
x, a następnie strzałka w lewo i w prawo	obraca się wokół osi X
y, a następnie strzałka w lewo i w prawo	obraca się wokół osi y
z, a następnie strzałka w lewo i w prawo	Obraca się wokół osi Z
Shift i X	Orientuje widok wzdłuż osi X
Przesunięcie i Y	Ustawia widok wzdłuż osi y
Shift i Z	Orientuje widok wzdłuż osi Z
ja	Przełącza między różnymi trybami interpolacji (np. najbliższy sąsiad i trójliniowy)
s lub Ustawienia > jasności i kontrastu	modyfikuje kolor kanałów, jasność i kontrast
F6 lub Ustawienia > Widoczność i grupowanie	Zmienia wyświetlane grupy, umożliwia grupowanie w celu nałożenia na siebie różnych grup i wywoływania grup za pomocą numerycznych
F10 lub Narzędzia > nagrywania filmu	Pobiera szereg czasowy aktualnie wyświetlanego wycinka

Tabela 2: Przeglądarka dużych zbiorów danych.

3. Ograniczenia opisanej implementacji LSFM

Niska przepustowość

W typowym eksperymencie LSFM obrazowana jest tylko jedna próbka na eksperyment. Mimo to, z naszego doświadczenia, z tej jednej próbki można wydobyć wiele przydatnych informacji. Wysokoprzepustowe obrazowanie wielu zarodków zostało ostatnio osiągnięte w domowych konfiguracjach LSFM ^46-48, choć zazwyczaj kosztem swobody pozycjonowania i rotacji próbki.

Niewystarczająca penetracja w głąb tkanek

Mimo że zarodki danio pręgowanego są półprzezroczyste, uzyskana jakość obrazu szybko się pogarsza podczas obrazowania w głębszych warstwach z powodu rozpraszania i absorpcji. Częściowo jest to efekt rozpraszania i absorpcji emitowanej fluorescencji przez próbkę i nie może być skorygowany w obecnej konfiguracji. Innym źródłem nierównej jakości obrazu jest nieregularne oświetlenie. Arkusz światła pada z lewej lub prawej strony, a wszelkie obiekty na jego drodze załamują go, co powoduje artefakty pasków i rozmycie. Dwustronne oświetlenie i fuzja wielu widoków mogą zmniejszyć artefakty na końcowym obrazie. Wreszcie, jakość obrazu jest nieco gorsza w kierunku marginesu pola widzenia ze względu na naturalną geometrię arkusza światła, który staje się coraz grubszy w kierunku krawędzi.

Ograniczona manipulacja chemiczna

Stosowanie leków lub inhibitorów jest szeroko rozpowszechnione w badaniach nad danio pręgowanym. W tym mikroskopie stosowanie leków jest ograniczone ze względu na dużą objętość komory na próbkę i względy innych użytkowników instrumentu, którzy dzielą tę samą komorę. Użycie dodatkowej komory dedykowanej do eksperymentów z lekami może rozwiązać ten problem. Częściowe wypełnienie komory szklanymi kulkami zmniejsza objętość wymaganej cieczy.

Brak fotomanipulacji

Obecnie nie ma możliwości miejscowej manipulacji optycznej, takiej jak fotokonwersja, czy ablacja laserowa w tym mikroskopie. Niemniej jednak domowe konfiguracje mogą być używane do takich specyficznych zastosowań.

4. Znaczenie i przyszłe zastosowania

LSFM jest najlepszą dostępną do tej pory metodą szybkiego obrazowania dużych ilości żywych zarodków. Większość eksperymentów, które można sobie wyobrazić pod mikroskopem konfokalnym, można również przeprowadzić na mikroskopie arkuszowym z wyżej wymienionymi zaletami. W przypadku obrazowania rozwoju oka szybkość LSFM nie jest kluczowym parametrem. Zamiast tego decydującymi korzyściami są niska fototoksyczność i elastyczność w pozycjonowaniu próbek.

Dane LSFM mają wysoki SNR, co pomaga osiągnąć dobre wyniki dekonwolucji, a także jest korzystne dla automatycznej analizy obrazu i śledzenia obiektów. Podsumowując, LSFM jest doskonałym narzędziem do generowania wymiernych danych na temat rozwoju embrionalnego oraz ogólnej charakterystyki komórek i tkanek do późniejszego modelowania i fizycznych opisów procesów, o których mowa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop Lightsheet Z.1			Carl Zeiss
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Roth	6351.1
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Sigma	A4018 lub A9414
Metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu (MESAB/MS-222/Trikaina)	Sigma	E10521
N-fenylotiomocznik (PTU)	Sigma	P7629
Koraliki fluorescencyjne czerwone 500 nm F-Y 050	Milipore (Estapor)	80380495
20 μ l (1  mm średnica wewnętrzna, oznaczona na czarno) kapillary	Marka	701904	sprzedawane jako część zamienna do transferpettor
Tłoki teflonowe do 20  μ l kapilary	Marka	701932	sprzedawane jako część zamienna do transferpettor
Szkiełka nakrywkowe okrągłe średnica 18 mm, wybrana grubość 0,17  mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
Oringi do okien komorowych 17 razy;			Carl Zeiss
, styl 55	Dumont	0209-55-PO
50 ml Strzykawki Luer-Lock	Becton Dickinson	300865
150 cm przedłużacz do infuzji kompatybilny ze strzykawkami Luer-Lock	Becton Dickinson	397400
Links
Link 1 Aplikacja			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer