Artykuł metodologiczny

Badanie funkcji koroniny A we wczesnej reakcji głodowej Dictyostelium discoideum za pomocą testów agregacyjnych

DOI:

10.3791/53972

⸱

18 czerwca 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ameba społeczna Dictyostelium discoideum przechodzi rozwojowe przejście w organizm wielokomórkowy, gdy jest głodzona. Ewolucyjnie konserwatywne białko koronina A odgrywa kluczową rolę w inicjacji rozwoju. Wykorzystując testy agregacyjne jako naszą główną metodę, staramy się wyjaśnić rolę koroniny A we wczesnym rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ameba Dictyostelium discoideum znajdują się w glebie, żywiąc się bakteriami. Kiedy źródła pożywienia stają się rzadkie, wydzielają czynniki, aby zainicjować program rozwoju wielokomórkowego, podczas którego pojedyncze komórki chemotaksują w kierunku centrów agregacji1-4. Proces ten jest zależny od uwalniania cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP)5. cAMP jest wytwarzany falami w wyniku skoordynowanego działania cyklazy adenylanowej i fosfodiesterazy oraz wiąże się z receptorami cAMP sprzężonymi z białkiem G6,7. Szeroko stosowany test do analizy mechanizmów zaangażowanych w cykl rozwojowy dolnego eukarionta Dictyostelium discoideum opiera się na obserwacji agregacji komórek w warunkach zanurzonych8,9. Protokół ten opisuje analizę roli koroniny A w cyklu rozwojowym poprzez głodzenie na płytkach do hodowli tkankowych zanurzonych w zrównoważonym roztworze soli (BSS)10. Koronina A należy do szeroko konserwatywnej rodziny białek koronin, które są zaangażowane w szeroki zakres działań11,12. Komórki dictyostelium pozbawione koroniny A nie są w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych, a wadę tę można uratować, dostarczając impulsy cAMP, co sugeruje, że koronina A działa przed kaskadą cAMP10. Techniki opisane w tych badaniach dostarczają solidnych narzędzi do badania funkcji białek w początkowych etapach cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum przed kaskadą cAMP. Dlatego wykorzystanie tego testu agregacji może umożliwić dalsze badania funkcji koroniny A i pogłębić naszą wiedzę na temat biologii koroniny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzina białek koroniny jest wysoce konserwatywna u eukariontów. Białka te charakteryzują się obecnością aminokońcowego regionu zawierającego powtórzenia tryptofanu-asparaginianu (WD), po którym następuje unikalny region połączony z domeną cewki zwiniętej na końcu karboksylowym13,14 (Figura 1). Koroniny są zaangażowane w różne funkcje komórkowe, w tym regulację cytoszkieletu i transdukcję sygnału12. U ssaków może dojść do jednoczesnej ekspresji do sześciu krótkich cząsteczek koroniny (koronina 1-6), a także "tandemowa" koronina 712,15. Koronina 1 jest najszerzej badanym członkiem rodziny i wykazano, że bierze udział w niszczeniu patogenów, przeżywalności limfocytów T i sygnalizacji neuronalnej. W jaki dokładnie sposób koronina 1 przeprowadza te działania, pozostaje niejasne. Podczas gdy wykazano, że koronina 1 reguluje sygnalizację zależną od Ca2 + i cAMP, a także modulację cytoszkieletu F-aktyny 16-18, potencjalna koekspresja do 7 członków rodziny u ssaków utrudniła badanie funkcji molekularnej koronin w tych systemach ze względu na potencjalne redundancje. W przeciwieństwie do organizmów ssaków, dolny eukariont Dictyostelium discoideum wykazuje ekspresję tylko dwóch członków rodziny koroniny (koroniny A, ortologi koroniny ssaków 1 i koroniny B, ortologi koroniny ssaków 7) z pozornie niezbędnymi funkcjami15,19,20. Fakt ten sprawia, że Dictyostelium discoideum jest silnym modelem do badania funkcji koronin.

Aby zbadać rolę koroniny A w Dictyostelium discoideum, wywołaliśmy cykl rozwojowy poprzez głodzenie na płytkach z kulturami tkankowymi zawierającymi zrównoważony bufor roztworu soli (BSS) przy użyciu komórek typu dzikiego lub komórek pozbawionych koroniny A10. Odkryliśmy, że komórki pozbawione koroniny A nie były w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych po zagłodzeniu. Dla dokładnej oceny ilościowej tego fenotypu niezbędne jest zautomatyzowane obrazowanie żywych komórek opisane w tym protokole. Defekt w inicjacji wczesnej odpowiedzi głodowej w komórkach pozbawionych koroniny A można uratować poprzez dostarczanie impulsów cAMP, co sugeruje, że koronina A działa przed kaskadą cAMP. Egzogeniczne zastosowanie impulsów cAMP do symulacji rozpoczęcia rozwoju było wykorzystywane przez kilka laboratoriów w ciągu ostatnich8,9 lat. Jednak wiadomo również, że ta procedura jest w dużym stopniu zależna od gęstości komórek i czasu. W związku z tym opisany tutaj protokół ma na celu zmniejszenie tych zmienności, aby zagwarantować wysoki stopień odtwarzalności. Podsumowując, techniki wykorzystane w tych badaniach dostarczają solidnych narzędzi do badania funkcji białek we wczesnych stadiach cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum i mają potencjał do identyfikacji efektorów w górę i w dół funkcji koroniny A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Obserwuj wczesną reakcję głodową Dictyostelium discoideum za pomocą mikroskopii poklatkowej.
    1. Hodować komórki DH1,10 lub komórki z niedoborem korA w kolbie Erlenmayera zawierającej pożywkę HL-5 (dla 1 l: 5 g peptonu proteozy, 5 g peptonu tiotonu E, 10 g glukozy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,35 g Na2HPO4*7H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g siarczanu dihydrostreptomycyny, pH 6,6) w temperaturze 22 °C w inkubatorze z wytrząsaniem o prędkości obrotowej 160 obr./min. Utrzymuj komórki w gęstości od 0,01 x 106 komórek/ml do 2 x 106 komórek/ml.
    2. Zbadać agregację komórek, zbierając komórki DH1.10 we wzroście w fazie logarytmicznej21 lub komórki z niedoborem korA 10 wytworzone na tle DH1.10, hodowane w kulturze wstrząsającej z pożywką HL-5 w temperaturze 22 °C. W tym celu należy pobrać odpowiednią ilość komórek (zwykle od 10 do 50 ml), odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i dwukrotnie umyć komórki w BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5).
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie płytki o gęstości (5, 10, 20 lub 40) x 104 komórek/cm2 w 24-dołkowej płytce. Pozwól im przylegać przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C w BSS.
    4. Wizualizacja agregacji za pomocą mikroskopii poklatkowej, jak opisano wcześniej10, wykonywanie obrazów co 135 sekund przy użyciu zestawu do obrazowania na żywo wyposażonego w obiektyw 5X i kamerę urządzenia sprzężonego z ładunkiem zwielokrotniającym elektrony, zautomatyzowaną przez odpowiednie oprogramowanie (patrz Tabela materiałów).
  2. pulsowanie cAMP komórek Dictyostelium discoideum podczas głodu.
    1. Zbadaj wpływ zewnętrznie stosowanych impulsów cAMP na rozwój komórek DH1.1021 lub komórek z niedoborem DH1.10 corA 10, poprzez pobieranie komórek. W tym celu należy pobrać odpowiednią ilość komórek (zwykle od 10 do 50 ml), odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i dwukrotnie przemyć w BSS.
    2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić komórki do gęstości 1 x 107 komórek/ml w BSS. Potrząsać kulturami bakterii (160 obr./min) w temperaturze 22 °C przez 2 godziny przed zastosowaniem impulsów. Dodaj impulsy cAMP za pomocą pompy perystaltycznej sterowanej zegarem. Zaprogramuj pompę tak, aby co 6,5 minuty dostarczała impuls o stężeniu 15 μl 50 nM cAMP (stężenie końcowe) przez okres 5 godzin.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie płytkie komórki o gęstości (5, 10, 20 lub 40) x 104 komórki/cm2 na płytce 24-dołkowej. Pozostawić na 1 godzinę w BSS.
    4. Wizualizacja agregacji po 16 godzinach w temperaturze 22 °C za pomocą mikroskopii w jasnym polu przy użyciu obiektywu 5X.
  3. Indukcja rozwoju Dictyostelium discoideum poprzez ekspozycję na kondycjonowaną pożywkę.
    1. Przygotować świeże kondycjonowane podłoże zgodnie z opisem22. Zebrać komórki DH1,10 w fazie logarytmicznej21 lub komórki z niedoborem korA DH1,10 10 z wytrząsania kultur z pożywką HL-5 w temperaturze 22 °C za pomocą pipety, odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i przemyć komórki trzykrotnie w PBM (0,02 M fosforan potasu, 10 μM CaCl2 i 1 mM MgCl2, pH 6,1).
    2. Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru, zawiesić je ponownie w PBM o gęstości 1 x 107 komórek/ml i wstrząsać przez 20 godzin przy 110 obr./min/22 °C.
    3. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po odwirowaniu w stężeniu 400 × g przez 3 minuty i sklarować przez odwirowanie w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4°C.
    4. Przefiltrować kondycjonowane medium przez filtr 0,45 μm (patrz tabela materiałów) i rozcieńczyć trzykrotnie w PBM.
    5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki o gęstości (5, 10, 20 lub 40) x 104 komórek/cm2 na płytce 24-dołkowej. Pozostawić je do przylegania przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C.
    6. Zamiana supernatantu komórek na wcześniej przygotowane kondycjonowane podłoże.
    7. Wizualizacja agregacji po 16 godzinach za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu obiektywu 5X.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki z niedoborem koroniny A wykazują defekt we wczesnym rozwoju (Rysunek 2). W przypadku braku koroniny A komórki A nie są w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych, co jest początkowym etapem cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum. Dlatego wydaje się, że koronina A odgrywa rolę podczas wczesnej reakcji głodowej i / lub sygnalizacji cAMP. Rzeczywiście, brakowi tworzenia agregatów wielokomórkowych przy braku koroniny A towarzyszy zmniejszona sygnalizacja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka koroniny znajdują się w większości taksonów kladu eukariotycznego. Dictyostelium discoideum coronin A, homolog koroniny 1 ssaków, bierze udział we wczesnej odpowiedzi głodowej, ponieważ komórki z niedoborem koroniny A nie są w stanie tworzyć centrów agregacji we wczesnym cyklu rozwojowym10. Aby móc ilościowo i dokładnie ocenić opóźnienie w rozwoju między szczepami, niezbędnym narzędziem jest zestaw do obrazowania żywych komórek pod mikroskopem z automatycznym kontrolerem stopnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dictyostelium Stock Center za szczepy i odczynniki. Badania te zostały sfinansowane z grantów Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki i kantonu Bazylea.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka HL-5 (na 1 l: 5 g peptonu proteozy, 5 g peptonu tiotonu E, 10 g glukozy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g siarczanu dihydrostreptomycyny, pH 6,6)
Pepton ProteozyBD Bioscience211693
Pepton Thiotone EBD Bioscience211684
Ekstrakt z drożdżyBD Bioscience212750
GlucoseAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
siarczan dihydrostreptomycynySigma-AldrichD1954000
PBM (0,02 M fosforan potasu, 10 μ M CaCl2 i l mM MgCl2, pH 6,1)samodzielnie wykonany
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)własnej produkcji
0,45-μ m Filtropure Sfiltr Sarstedt83.1826
Falcon 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFisher Scientific08-772-1H
MikroskopCellobserver Zeissniestandardowe
oprogramowanie AxioVisionMikroprocesor Zeiss
IPC– sterowana pompa dozującaISMATECISM 931
Mikroskop Axiovert 135MZeiss491237-0001-000
Wytrząsarka inkubacyjnaInforst HT Minitron

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dictyostelium discoideumCoronin AAggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumStarvation ResponseDevelopmental Biology

Powiązane artykuły