Method Article

Metody badania kompleksów makromolekularnych zawierających Mrp4 w regulacji migracji fibroblastów

DOI:

10.3791/53973

⸱

May 19th, 2016

 ,  , 
1Division of Pulmonary Medicine, Department of Pediatrics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MRP4 reguluje różne cykliczne zdarzenia sygnalizacyjne zależne od nukleotydów, w tym niedawno wyjaśnioną rolę w migracji komórek. Opisujemy bezpośrednie, ale wieloaspektowe podejście do rozwikłania dalszych celów molekularnych MRP4, co skutkuje identyfikacją unikalnego interaktomii MRP4, który odgrywa kluczową rolę w precyzyjnej regulacji migracji fibroblastów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białko oporności wielolekowej 4 (MRP4) należy do rodziny transporterów błonowych kasety wiążącej ATP i jest endogennym transporterem wypływu cyklicznych nukleotydów. Modulując wewnątrzkomórkowe stężenie cyklicznych nukleotydów, MRP4 może regulować wiele cyklicznych zdarzeń komórkowych zależnych od nukleotydów, w tym migrację komórek. Wcześniej wykazaliśmy, że przy braku MRP4 komórki fibroblastów zawierają wyższe poziomy wewnątrzkomórkowych cyklicznych nukleotydów i mogą migrować szybciej. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tego odkrycia, przyjęliśmy bezpośrednie, ale wieloaspektowe podejście. Po pierwsze, wyizolowaliśmy potencjalne oddziałujące kompleksy białkowe MRP4 z systemu komórkowego nadekspresji MRP4 za pomocą immunoprecypitacji, a następnie spektrometrii mas. Po zidentyfikowaniu unikalnych białek w interaktomie MRP4 wykorzystaliśmy analizę ścieżki Ingenuity (IPA), aby zbadać rolę tych interakcji białko-białko w kontekście transdukcji sygnału. Wyjaśniliśmy potencjalną rolę kompleksu białkowego MRP4 w migracji komórek i zidentyfikowaliśmy F-aktynę jako głównego mediatora wpływu MRP4 na migrację komórek. W badaniu podkreślono również rolę cAMP i cGMP jako kluczowych graczy w zjawiskach migracyjnych. Korzystając z mikroskopii o wysokiej zawartości, przeprowadziliśmy testy migracji komórek i zaobserwowaliśmy, że wpływ MRP4 na migrację fibroblastów jest całkowicie zniesiony przez zakłócenie cytoszkieletu aktynowego lub hamowanie kinazy A zależnej od cAMP (PKA). Aby zobrazować modulacje sygnałowe w migrującej komórce w czasie rzeczywistym, wykorzystaliśmy czujnik oparty na FRET do pomiaru aktywności PKA i stwierdziliśmy obecność bardziej spolaryzowanej aktywności PKA w pobliżu krawędzi natarcia migrującego fibroblastu Mrp4-/- w porównaniu z fibroblastami Mrp4 +/+. To z kolei zwiększyło tworzenie aktyny w korze mózgowej i przyspieszyło proces migracji. Nasze podejście umożliwia identyfikację białek działających po MRP4 i daje nam przegląd mechanizmu zaangażowanego w zależną od MRP4 regulację migracji fibroblastów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek to skomplikowany, wieloetapowy proces. Badania wykazały, że podczas migracji komórki są spolaryzowane na krawędzie natarcia i spływu. Przylegając do macierzy zewnątrzkomórkowej, krawędź natarcia zapewnia przyczepność niezbędną do poruszania się ciała komórki do przodu. Na koniec krawędź spływu zwalnia tylny osprzęt i kończy cykl migracji1,2.

Polaryzacja komórek dla efektywnej migracji komórek jest regulowana przez przestrzenną segregację sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Wtórne przekaźniki komórkowe, takie jak cAMP, pośredniczą w przedziale zdarzeń sygnalizacyjnych wymaganych do precyzyjnie dostrojonej kierunkowej migracji komórek3,4. Preferencyjne akumulacje cAMP i aktywność kinazy PKA zależnej od cAMP na krawędzi wiodącej odgrywają kluczową rolę w kierunkowej migracji komórek5,6. Poprzez fosforylację małych GTPaz, takich jak substrat toksyny botulinowej C3 związany z Ras (Rac) i homolog białka kontrolującego podział komórek 42 lub Cdc42, PKA aktywuje białko związane z aktyną 2/3 (Arp 2/3) na krawędzi natarcia i indukuje tworzenie lamellipodiów7-9. PKA fosforyluje również środek przeciw zamknięciu, fosfoproteinę stymulowaną przez rozszerzenie naczyń krwionośnych (VASP), regulując w ten sposób cykle oscylacyjne wydłużania i cofania błony10,11.

W komórkach poziomy cAMP są regulowane przez trzy główne procesy: i) syntezę przez cyklazę adenylanową, ii) degradację przez fosfodiesterazy, oraz iii) transport przez transportery wypływu związane z błoną3. Białko oporności wielolekowej 4 (MRP4), należące do rodziny transporterów błonowych kasety wiążącej ATP (ABC), działa jako endogenny transporter wypływu cyklicznych nukleotydów. Dlatego MRP4 może regulować wewnątrzkomórkowe poziomy cAMP i sygnalizację komórkową zależną od cAMP11-13. Wcześniej wykazaliśmy, że w Mrp4-/- fibroblasty zawierają stosunkowo wyższe poziomy cyklicznych nukleotydów i migrują szybciej w porównaniu z fibroblastami Mrp4 +/+ 14. Stwierdziliśmy również dwufazowy wpływ cyklicznych nukleotydów na migrację fibroblastów. Opierając się na wcześniejszych badaniach i naszym odkryciu, że fibroblasty Mrp4-/- zawierają więcej spolaryzowanych cAMP w trakcie migracji, postawiliśmy hipotezę, że ta regulacja migracji fibroblastów za pośrednictwem MRP4 jest zależna od cAMP. Aby zrozumieć mechanizm oddolny, przyjęliśmy bezpośrednie, ale wieloaspektowe podejście.

Aby zidentyfikować białka związane i współdziałające z MRP4, poddaliśmy immunoprecypitacji makromolekularne kompleksy zawierające MRP4 z komórek HEK293, które nadmiernie eksprymują MRP4. Za pomocą spektrometrii mas zidentyfikowaliśmy wiele białek oddziałujących z MRP4 i przeanalizowaliśmy ich wzajemne połączenia za pomocą analizy ścieżki Ingenuity (IPA). IPA jest użytecznym narzędziem do analizy interakcji białko-białko (zarówno strukturalnych, jak i funkcjonalnych) oraz badania ich udziału w poszczególnych zdarzeniach fizjologicznych i patologicznych w oparciu o literaturę i dowody eksperymentalne15,16. IPA wskazała, że F-aktyna jest głównym dalszym celem MRP4 w kontekście migracji komórek, gdzie cAMP i cGMP są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi17. Dane te zostały następnie potwierdzone za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości. Mikroskopia o wysokiej zawartości może rejestrować i analizować zachowania komórek, takie jak migracja komórek, w wygodniejszy, dokładniejszy i bardziej wydajny sposób18. Dane mikroskopowe o wysokiej zawartości wykazały, że wpływ MRP4 na migrację fibroblastów jest całkowicie zniesiony po przerwaniu cytoszkieletu aktynowego lub zahamowaniu PKA17.

Dodatkowo, użyliśmy czujnika PKA opartego na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) do monitorowania dynamiki PKA w migrujących komórkach w czasie rzeczywistym. Czujniki kinaz oparte na FRET zwykle składają się ze specyficznych peptydów substratu fosforylacji otoczonych fluoroforami CFP i YFP19-21. pmAKAR3 jest ulepszonym i ukierunkowanym na membranę czujnikiem PKA opartym na FRET, który zawiera domenę 1 związaną z widełkami (FHA1) i sekwencję substratu PKA LRRATLVD5,22. Fosforylacja pmAKAR3 przez podjednostkę katalityczną PKA zwiększa sygnał FRET między CFP a YFP19. Wprowadzenie domeny modyfikacji lipidów do czujnika kieruje go do błony plazmatycznej w celu monitorowania dynamiki PKA, szczególnie w przedziale błony23.

Korzystając z pmAKAR3, wykazaliśmy, że krawędź natarcia migrujących fibroblastów Mrp4-/- wykazywała bardziej spolaryzowaną aktywność PKA niż fibroblasty Mrp4+/+, co z kolei zwiększyło tworzenie się aktyny korowej na krawędzi czołowej komórki17. Łącznie zdarzenia te skutkowały lepszą polaryzacją komórkową i szybszą kierunkową migracją komórek przy braku MRP4. Nasze konkretne i bezpośrednie podejście zidentyfikowało kluczowe cele dla MRP4 i zapewnia ważny, ale jak dotąd niezbadany mechanizm zależnej od MRP4 regulacji migracji fibroblastów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analiza ścieżki Ingenuity

  1. Przesyłanie zestawu danych białko-interaktom
    1. Wstawić białka/geny będące przedmiotem zainteresowania w arkuszu kalkulacyjnym wraz z ich unikalnymi identyfikatorami genów (najlepiej symbolami genów i numerami identyfikatorów genów uzyskanymi za pomocą danych spektrometrii mas).
    2. Przypisz jedną kolumnę w arkuszu kalkulacyjnym dla numeru identyfikacyjnego genu i jedną kolumnę dla wartości obserwacyjnej (np. Fold-change lub p-value). Wybierz opcję "zawiera nagłówek kolumny", aby wyświetlić nagłówki kolumn.
    3. Prześlij zestaw danych do IPA, klikając kartę przesyłania zestawu danych i wybierając wspomniany powyżej arkusz kalkulacyjny. Wybierz zakładkę elastycznego formatu i wybierz odpowiednią kategorię identyfikatora genu.
      Uwaga: Elastyczny format zestawu danych przewyższa specyfikacje formatowania przesyłania.
    4. Po wyświetleniu zestawu danych wybierz pozycję Identyfikator i kolumny obserwacji. Upewnij się, że wszystkie białka (interaktom MRP4 zidentyfikowany za pomocą spektrometrii mas) są mapowane, sprawdzając kartę podsumowania zestawu danych. Zestaw danych jest teraz gotowy do żądanej analizy.
  2. Analiza danych
    Uwaga: Opisano częściowe zastosowania funkcji IPA, które zostały wykorzystane w tym badaniu.
    1. Po wgraniu interaktomii MRP4 z ich nazwami genów jako unikalnymi identyfikatorami, kliknij na nowy i wybierz analizę rdzeniową w lewym górnym menu oprogramowania IPA.
    2. Ustaw wartość odcięcia wyrażenia dla intensywności zgodnie z typem eksperymentu (do analizy zalecana jest wartość intensywności 100).
    3. Oblicz zmianę krotności wyrażenia podczas przygotowywania zestawu danych, jeśli w grę wchodzą warunki kontrolne i eksperymentalne, i uwzględnij ją jako część pliku zestawu danych, jeśli konieczne jest przeprowadzenie analizy porównawczej (do analizy zwykle zalecana jest wartość odcięcia 1,5-krotna zmiana).
      Uwaga: Po zakończeniu analizy podstawowej można uzyskać wiele sekcji analiz. Pierwsza zakładka pokazuje podsumowanie wszystkich analiz i sugeruje między innymi najważniejsze szlaki kanoniczne, regulatory nadrzędne, funkcje molekularne i komórkowe oraz sieci; Wszystkie obliczane są na podstawie poziomu ufności (wartość p) i ułożone w porządku rosnącym wartości p.
    4. Otwórz główne szlaki kanoniczne (korzystając z opcji ścieżki otwartej) jako duże sieci molekularne, które obrazowo pokazują przesłuchy, nakładanie się i wpływanie szlaków sygnałowych.
      Spójrz na listę szlaków kanonicznych, które są głównie zaangażowane, w oparciu o wartość p (p <0,05 jest uważane za znaczące).
      Uwaga: Wartości istotności dla ścieżek kanonicznych są obliczane za pomocą dokładnego testu Fishera prawostronnego. Istotność wskazuje na prawdopodobieństwo asocjacji cząsteczek ze zbioru danych ze szlakiem kanonicznym wyłącznie przez przypadek losowy.
    5. Potwierdź białka wejściowe (interaktom MRP4 zidentyfikowany za pomocą spektrometrii mas) na liście białek zaangażowanych w każdy szlak.
      Uwaga: Korzystając z tej opcji, zaobserwowano, że komórkowa sieć sygnalizacyjna cytoszkieletu aktynowego jest głównym szlakiem dotkniętym chorobą i jak białka wejściowe pasują do niego (ryc. 1). Podejście to pomaga określić, które sieci molekularne byłyby ściśle powiązane i dotknięte przez badane białka.
    6. Użyj zakładki sieć w analizach, aby zidentyfikować najważniejsze choroby i funkcje, które są potencjalnie powiązane z określoną siecią białkową na podstawie liczby cząsteczek fokusowych.
      Uwaga: Wartość punktowa jest podawana na podstawie znanych białek, które są określane jako część sieci, np. sieci składania i organizacji komórek, na podstawie wiedzy literaturowej i dowodów eksperymentalnych oraz cząsteczek fokusowych, które są identyfikowane na podstawie zestawu danych i stają się częścią sieci. Odtąd sieć jest filtrowana w pierwszej kolejności na podstawie liczby cząsteczek fokusowych.

2. Mikroskopia o wysokiej zawartości

  1. Przygotowanie komórek
    Uwaga: Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową zostały wykonane pod kapturem hodowli komórkowej z przepływem poziomym.
    1. Użyj 96-dołkowych mikropłytek do testu gojenia się ran.
    2. Pokryć mikropłytkę 1% roztworem fibronektyny (rozpuszczonym w PBS) i przechowywać płytkę w standardowym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    3. Usunąć Mrp4-/- i Mrp4+/+ mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) wyhodowanych w kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 25 cm² z inkubatora, przemyć 1 raz PBS i trypsynizować komórki przez 5 minut przy użyciu 1 ml 4x roztworu trypsyny-EDTA.
    4. Przemyć komórki kompletną pożywką (DMEM zawierającą 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny) i ponownie zawiesić je w 5 ml kompletnej pożywki.
    5. Odessać roztwór fibronektyny ze studzienek. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 30 000 komórek (liczba komórek musi być zoptymalizowana w zależności od typu komórki) do każdej studzienki.
    6. Hoduj komórki do 100% konfluencji w standardowym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Tworzenie rany
    1. Upewnij się, że wszystkie studzienki są wypełnione roztworem. Wypełnij nieużywane studzienki PBS, aby zapobiec uszkodzeniu narzędzia do robienia ran (np. WoundMaker).
    2. Po potwierdzeniu 100% zbieżności komórek, umieść 96-dołkową płytkę wewnątrz narzędzia do robienia ran na metalowej płycie podstawy i dociśnij 96-dołkowy blok szpilek w dół.
    3. Przemyć komórki trzykrotnie PBS w celu usunięcia wszelkich usuniętych komórek i dodać 100 μl kompletnej pożywki.
    4. Na tym etapie dodać badane związki - H-89 (50 μM; rozcieńczenie 1:1 000 z kompletnymi pożywkami przy użyciu 50 mM podstaw w DMSO) lub latrunkulinę B (1 μM; 1:1000 rozcieńczenie z kompletnymi pożywkami przy użyciu 1 mM podstaw w DMSO).
    5. Umieścić płytkę testową wewnątrz czytnika w temperaturze 37 °C i monitorować migrację w okresie doświadczalnym.
  3. Monitorowanie migracji komórek
    Uwaga: Migrację komórek monitorowano za pomocą mikroskopu i oprogramowania dostarczonego z systemem mikroskopii o wysokiej zawartości. Zastosowanie 96-dołkowych mikropłytek zapewnia, że rany są automatycznie monitorowane przez mikroskop i rejestrowane przez oprogramowanie.
    1. Ustaw oprogramowanie tak, aby co godzinę skanowało płytkę testową w celu przeprowadzenia testów migracji za pomocą karty zaplanuj skanowanie. Wybierz czas rozpoczęcia co najmniej 15 minut po umieszczeniu płytki testowej w czytniku, aby umożliwić równowagę przed obrazowaniem.
    2. Wybierz tackę i wybierz typ naczynia (mikropłytka 96-dołkowa) oraz typ eksperymentu (Scratch Wound).
    3. Wybierz obiektyw 10X i wybierz parametry obrazowania z kontrastem fazowym. Wybierz studnie, które mają zostać zeskanowane, korzystając z opcji edycji wzorca skanowania.
    4. Określ grupy zabiegów i wszelkie powtórzenia, wybierając kartę właściwości i konfigurując mapę płyt. Skanowanie można zatrzymać w dowolnym momencie w zależności od warunków eksperymentalnych.
  4. analiza danych
    1. Po zakończeniu skanowania wybierz zakładkę Widok naczynia dla płytki testowej. Przejdź do narzędzi zadania analizy i wybierz opcję uruchom nowe zadanie analizy.
    2. Ustaw nawinięcie zarysowania jako typ zadania i wybierz zakres czasu analizy (od punktu czasowego 0 do punktu czasowego 24 godzin).
    3. Wybierz odwierty, które mają zostać wybrane do analizy, jednym kliknięciem na odwiert i kliknij "OK", aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy zwizualizuj graficznie dane względnej gęstości ran (RWD) dla każdego dołka w każdym punkcie czasowym, korzystając z opcji eksportu do wykresu.
    4. Wyświetl zestaw obrazów z kontrastem fazowym każdej studni odpowiadający różnym punktom czasowym za pomocą zakładki widoku obrazu. Wybierz konkretną studnię, klikając na mapę płyty, wybierz określony punkt czasowy z zakładki zakresu czasu i kliknij kartę wyświetl obraz.

3. Rezonansowy transfer energii Förster (FRET)

  1. Przygotowanie komórek
    1. Naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm pokryć 100 μl 1% roztworu fibronektyny (jak opisano w sekcji 2.1) i przechowywać w standardowym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Odessać roztwór fibronektyny z płytek i zasiać równą liczbę komórek HEK293 (10 000 komórek/płytkę) w kompletnym podłożu.
    3. Hoduj komórki do 60-70% zbiegu w naczyniach ze szklanym dnem pokrytych fibronektyną w standardowym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Transfekcja
    1. Wszystkie transfekcje przejściowe należy wykonywać przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Porcję 250 μl kompletnej pożywki rozlać na dwie oddzielne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml na każde szalkę o średnicy 35 mm.
    3. Dodać 2 μg DNA (pmAKAR3 lub pmAKAR3-TA) do jednej probówki i 5 μl (2,5-krotność stężenia DNA) odczynnika do transfekcji do drugiej probówki.
    4. Inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść rozcieńczone DNA do probówki zawierającej odczynnik do transfekcji.
    5. Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut.
    6. Odessać pożywkę z komórek i umyć je raz PBS. Dodać do komórek 1 ml bezantybiotykowej pożywki DMEM F-12 zawierającej 10% FBS.
    7. Dodać 507 μl koniugatu DNA-lipid z pożywką do komórek na każdej płytce, delikatnie wymieszać i trzymać w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Użyj 2 μg DNA (1 μg/μl podstawy) i 5 μl lipidu na 10 000-50 000 komórek na każdej płytce.
  3. Obrazowanie żywych komórek
    1. Po 48 godzinach od transfekcji usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki 2 razy zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS, wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 °C). Dodać końcową objętość 1,9 ml HBSS do umytych komórek i zamontować je na systemie odwróconego mikroskopu szerokokątnego do obrazowania FRET w specjalnie wykonanej komorze utrzymywanej w temperaturze 37 °C.
      Uwaga: W tym systemie światło wzbudzenia zapewnia lampa ksenonowa o mocy 300 W tłumiona filtrem o neutralnej gęstości o przepuszczalności światła 50%.
    2. Użyj obiektywu 60X. Ręcznie ustaw ostrość na komórkach i ustaw optymalne pole widzenia za pomocą mikroskopu. Aktywuj wybrane pole view na ekranie komputera za pomocą opcji Focus "F" na oprogramowaniu. Do wykonywania pomiarów FRET należy ręcznie dobrać odpowiedni zestaw filtrów (zestaw filtrów CFP/YFP z filtrem wzbudzenia 430/25 nm, podwójnym dichroicznym rozdzielaczem wiązki oraz dwoma filtrami emisyjnymi (470/30 nm dla CFP i 535/30 nm dla FRET).
    3. Wizualizuj fluorescencję, najpierw sprawdzając opcję kanału CFP/YFP/FRET, a następnie klikając otwórz zakładkę fluor. Popraw intensywność sygnału za pomocą narzędzia do wzmacniania w zakładce kamery.
    4. Wybrać komórki wykazujące ekspresję pmAKAR3 lub pmAKAR3-TA, unikając nasycenia intensywności sygnału. Użyj okna przechwytywania, aby zainicjować pomiar FRET.
    5. Wybierz opcję poklatkową i ustaw skanowanie czasu na 30 minut z 30-sekundowym interwałem. Sprawdź opcję FRET i ustaw czas naświetlania na 100 ms. Wprowadź etykietę obrazu i naciśnij start, aby rozpocząć pomiar.
    6. Po pięciu punktach czasowych i ustaleniu linii podstawowej, dodać 25 μM forskoliny (5 μl z 10 μM zapasu w etanolu, rozcieńczonego 100 μl HBSS) do komórek bez naruszania płytki i monitorować komórki przez łącznie 30 minut.
  4. Analiza danych
    Uwaga: Użyj modułu obliczeń ratiometrycznych do analizy danych.
    1. Kliknij narzędzie wyboru po lewej stronie okna obrazu i wybierz solidny prostokąt z menu rozwijanego. Przeciągnij prostokąt na polu obrazu w wolnym obszarze komórki i kliknij go prawym przyciskiem myszy, aby ustawić go jako tło w celu odejmowania tła.
    2. Przejdź do maski i skorzystaj z opcji "utwórz nową maskę". Przejdź do narzędzia do zaznaczania i wybierz pióro z menu rozwijanego, aby ręcznie narysować maskę wokół komórki, aby wybrać ją do pomiaru. Zaznacz co najmniej 4-6 komórek na warunek.
    3. Wybierz zakładkę Maska i wykonaj statystyki maski.
    4. Zaznacz 'Cała maska', rozwiń opcję wielokanałową i wybierz dawcę znormalizowanego FRET (N-FRET) (FRET/CFP). Wartość N-FRET jest reprezentatywna dla aktywności PKA w błonie plazmatycznej.
    5. Dodaj znaczniki czasu, tabelę przeglądową i pasek skali za pomocą adnotacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać wpływ MRP4 na migrację fibroblastów, użyliśmy testu gojenia się ran z wykorzystaniem mikroskopii o wysokiej zawartości14. Precyzyjne rany wykonano na zlewających się monowarstwach MEF wyizolowanych od myszy Mrp4-/- lub Mrp4+/+, a obrazy wykonywano w odstępach 1-godzinnych przez 24 godziny. Zaobserwowaliśmy wyższy wskaźnik migracji dla MRP4-/- MEF w porównaniu z MEF-ami Mrp4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek to skomplikowany proces, który odgrywa nieodzowną rolę w wielu ważnych zdarzeniach fizjologicznych, w tym w gojeniu się ran1,2. Nieprawidłowe migracje komórek mogą powodować katastrofalne zdarzenia, takie jak przerzuty guza i angiogeneza24,25. Dlatego precyzyjna regulacja migracji komórek jest niezbędna do utrzymania prawidłowego funkcjonowania organizmu.

Korzystając z mikroskopii o wysokiej zawartości18, wykazaliśmy, że MEF z niedoborem MRP4 m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health R01-DK080834 i R01-DK093045. Dziękujemy J. Denise Wetzel, pisarzowi medycznemu CCHMC, za redakcję manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000Invitrogen(Carlsbad, CA) 11668-027
DMEMInvitrogen (Carlsbad, CA) 11965-092
IncuCyte ZoomEssen BioScience
96-dołkowe mikropłytki IncuCyte Image-Lock Essen BioScience4493
Latrunculin BSigma-Aldrich (St. Louis, MO).L5288Zapasy w DMSO
H-89Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)BML-EI196Zapasy w
naczyniach ze szklanym dnem DMSO 35 mm (Korporacja MatTek; Ashland, MA)P35G-1.5-20-C 
FibronektynaSigma-Aldrich (St. Louis, MO).F1141
Opti-MEM Obniżone podłoże w surowicy(Carlsbad, CA) 31985-088
System mikroskopii FRETMikroskop odwrócony Olympus (IX51)Kamera
CCD Hamamatsu, JaponiaORCA285
Oprogramowanie SlideBook 5.5Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania (Denver, CO)
Oprogramowanie do analizy ścieżek pomysłowościIPA, QIAGEN Redwood City,
ForskolinTocris (Ellisville, MO). 1099Zapas w 100% EtOH
DMEM F-12   Invitrogen (Carlsbad, Kalifornia) 11330-057
HBSSInvitrogen (Carlsbad, CA) 14025-134
ExcelMicrosoft
PBSInvitrogen (Karlowe Wary, Kalifornia) 10010-023
Roztwór trypsyny/EDTA (TE)Invitrogen(Carlsbad, CA) R-001-100
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen (Carlsbad, CA) Rozdział 15140-122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  2. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
  3. Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
  4. Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
  5. Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
  6. Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
  7. Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
  8. Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
  9. Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
  10. Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
  11. Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
  12. Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
  13. Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
  14. Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
  15. Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
  16. Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
  17. Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
  18. Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
  19. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
  20. Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
  21. Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
  22. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
  23. Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
  24. Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
  25. Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
  26. Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
  27. Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
  28. Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MRP4 ComplexFibroblast MigrationImmunoprecipitation Mass SpectrometryIngenuity Pathway AnalysisFRET ImagingHigh Content MicroscopyCyclic Nucleotide RegulationActin CytoskeletonPKA ActivityCell Migration Assays

Related Articles