Method Article

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

DOI:

10.3791/53978

⸱

June 21st, 2016

 ,  ,  , 
1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój embrionalny to wieloetapowy proces obejmujący aktywację i represję wielu genów. Wiadomo, że elementy wzmacniające w genomie przyczyniają się do specyficznej dla tkanek i typów komórek regulacji ekspresji genów podczas różnicowania komórkowego. Dlatego ich identyfikacja i dalsze badania są ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób determinowany jest los komórki. Integracja danych dotyczących ekspresji genów (np. mikromacierzy lub sekwencji RNA) oraz wyników badań całego genomu opartych na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) umożliwia identyfikację tych regionów regulatorowych na dużą skalę. Jednak walidacja funkcjonalna wzmacniaczy specyficznych dla typu komórkowego wymaga dalszych procedur eksperymentalnych in vitro i in vivo. Tutaj opisujemy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i weryfikowane eksperymentalnie. Protokół ten zapewnia przepływ pracy krok po kroku, który obejmuje: 1) identyfikację regionów regulatorowych za pomocą analizy danych ChIP-seq, 2) klonowanie i eksperymentalną walidację przypuszczalnego potencjału regulacyjnego zidentyfikowanych sekwencji genomowych w teście reporterowym oraz 3) określenie aktywności wzmacniacza in vivo poprzez pomiar poziomu transkryptu wzmacniającego RNA. Prezentowany protokół jest na tyle szczegółowy, że każdy może skonfigurować ten przepływ pracy w laboratorium. Co ważne, protokół może być łatwo zaadaptowany i wykorzystany w dowolnym systemie modelu komórkowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój organizmu wielokomórkowego wymaga precyzyjnie regulowanej ekspresji tysięcy genów w rozwijających się tkankach. Regulacja ekspresji genów odbywa się w dużej mierze za pomocą wzmacniaczy. Wzmacniacze to krótkie, niekodujące elementy DNA, które mogą być wiązane z czynnikami transkrypcyjnymi (TF) i działać na odległość, aby aktywować transkrypcję docelowego genu1. Wzmacniacze są na ogół cis-działające i najczęściej znajdują się tuż przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji (TSS), ale ostatnie badania opisały również przykłady, w których wzmacniacze znaleziono znacznie dalej, na 3' genu lub nawet w intronach i eksonach2.

W genomach kręgowców znajdują się setki tysięcy potencjalnych wzmacniaczy1. Najnowsze metody oparte na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dostarczają danych o wysokiej przepustowości całego genomu, które można wykorzystać do analizy wzmacniaczy3-9. Chociaż dane uzyskane w eksperymentach ChIP-seq znacznie zwiększają prawdopodobieństwo identyfikacji wzmacniaczy specyficznych dla komórek i tkanek, ważne jest, aby pamiętać, że wykryte miejsca wiązania niekoniecznie identyfikują bezpośrednie wiązanie DNA i / lub wzmacniacze funkcjonalne. W związku z tym niezbędna jest dalsza analiza funkcjonalna nowo zidentyfikowanych wzmacniaczy. W tej pracy przedstawiamy podstawowy, trzyetapowy proces identyfikacji i walidacji domniemanego aktywnego wzmacniacza. Obejmuje to: 1) wybór przypuszczalnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego za pomocą analizy bioinformatycznej danych ChIP-seq, 2) klonowanie i walidację tych sekwencji regulatorowych w konstruktach reporterowych oraz 3) pomiar wzmacniającego RNA (eRNA).

Ekspozycja embrionalnych komórek macierzystych (ES) na kwas retinowy (RA) jest często wykorzystywana do promowania różnicowania neuronalnego komórek pluripotencjalnych 10. RZS wywiera swoje działanie poprzez wiązanie się z receptorami RA (RARα, β, γ) i receptorami retinoidów X (RXRα, β, γ). RAR i RXR w postaci heterodimeru wiążą się z motywami DNA zwanymi elementami odpowiedzi RA, które są zwykle ułożone jako bezpośrednie powtórzenia sekwencji AGGTCA (zwane jako miejsce połowiczne) i regulują transkrypcję. Eksperymenty z użyciem ligandów pozwoliły na identyfikację kilku genów regulowanych kwasem retinowym w komórkach ES 11,12. Jednak elementy wzmacniające wiele z tych genów nie zostały jeszcze opisane. Aby zademonstrować, w jaki sposób opisany tutaj przepływ pracy może być wykorzystany do identyfikacji i walidacji wzmacniaczy, pokazujemy krok po kroku wybór i charakterystykę dwóch wzmacniaczy zależnych od kwasu retinowego w embrionalnych komórkach macierzystych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wybór wzmacniacza na podstawie analizy sekwencyjnej chipów

  1. Pobierz plik fastq surowych danych RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) z http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. Pobierz i rozpakuj wymagany plik indeksu BWA do wyrównania (w naszym przypadku: Mus_musculus_UCSC_mm10). (ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    UWAGA: Odwiedź stronę https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts, aby uzyskać więcej informacji na temat etapów analizy bioinformatycznej i pobrać skrypty używane poniżej.
  3. Dopasuj przykładowy plik fastq do genomu mm10 (użyj skryptu: perform_alignment.sh). Spowoduje to utworzenie folderu z plikiem .bam i statystykami wyrównania. Wyrównane dane RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) i odpowiadający im plik indeksu (.bai) są dostępne tutaj:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    UWAGA: BWA to pakiet oprogramowania, który dopasowuje stosunkowo krótkie sekwencje (np. wyniki sekwencji ChIP) do bazy danych sekwencji, takiej jak genom referencyjny myszy (np. mm10) 13.
  4. Uruchom skrypt (callpeaks.sh) w celu wywołania piku i analizy motywu de novo. Użyj pliku .bam jako danych wejściowych. Skrypt jest oparty na Homer findPeaks 14.
    UWAGA: Pliki wyjściowe dostarczają nam informacji o całkowitej liczbie szczytów, wzbogaceniu motywów, procentowym udziale tła oraz docelowych sekwencjach z motywami itp. (Rysunek 1). Zazwyczaj kilka motywów jest wymienionych w kolejności ich znaczenia.
  5. Zmień mapowanie motywu rangi #1 (NR połowa 'AGGTCA') (użyj skryptu: remap_motif.sh)
    UWAGA: W rezultacie skrypt generuje plik .bed, który pokaże, które piki ChIP pokrywają regiony genomu, które zawierają kanoniczne miejsce wiązania interesującego czynnika transkrypcyjnego.
  6. Pobierz i zwizualizuj wyniki wyrównanych odczytów RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (pobierz również plik .bai)) oraz wystąpień motywu AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV)15 w celu zidentyfikowania przypuszczalnych miejsc wiązania RAR/RXR (Rysunek 2 i Rysunek 3).
    UWAGA: Integracja różnych danych ChIP-seq pomoże w dokładniejszym przewidywaniu dobrych kandydatów na wzmacniacze16,17. Ostatnie badania wykazały, że aktywne wzmacniacze są zazwyczaj wzbogacone o P300 i korelują z H3K4me1 i H3K27ac i są zlokalizowane w otwartych regionach chromatyny, co oznacza, że nadwrażliwość na DNazę-I jest również zalecana 18-21.
  7. Użyj opcji "Zdefiniuj region zainteresowania" w IGV 15, aby uzyskać sekwencję 200 - 400 pz wybranego regionu genomowego i wykorzystać te sekwencje do kolejnych projektów starterów.

2. Test reporterowy

UWAGA: System lucyferyna/lucyferazy jest używany jako bardzo czuły test reporterowy do regulacji transkrypcji. W zależności od aktywności wzmacniacza wytwarzany jest enzym lucyferazy, który katalizuje utlenianie lucyferyny do oksylucyferyny, co prowadzi do bioluminescencji, którą można wykryć. W pierwszym kroku zidentyfikowane przypuszczalne sekwencje wzmacniacza powinny zostać sklonowane do wektora reporterowego (np. TK-Lucyferazy 22, pGL3 lub NanoLuc).

  1. Projekt podkładu
    1. Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji 200 - 400 pz przypuszczalnych regionów wzmacniających za pomocą Primer3 (dostępne tutaj: http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23
    2. Skopiuj i wklej sekwencję genomową z IGV, która zawiera przypuszczalne miejsce wiązania, do Primer3 (patrz krok 1.7). Ustaw zakres rozmiarów produktu na 250 - 300 pz w Primer3.
    3. Walidacja starterów PCR za pomocą narzędzia In silico PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) UCSC Genome Browser ()24
      UWAGA: Ten protokół w późniejszym kroku wykorzystuje enzymy restrykcyjne HindIII i BamHI do klonowania. Sprawdź, czy amplifikowana sekwencja PCR zgodnie z przewidywaniami narzędzia UCSC In-silico PCR będzie zawierać miejsca restrykcyjne AAGCTT lub GGATCC (np. http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. Uzyskaj wymagane startery od komercyjnego dostawcy.
  2. Amplifikacja PCR sekwencji wzmacniacza z genomowego DNA
    1. Oczyść matrycowe genomowe DNA z komórek pierwotnych (np. pierwotnych fibroblastów embrionalnych). Użyj komercyjnego zestawu do izolacji gDNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Wysoka jakość gDNA jest niezbędna do udanej amplifikacji PCR. Odpowiednie klony BAC mogą być stosowane, jeśli PCR nie jest łatwy od gDNA.
    2. Przygotować 50 μl reakcji PCR zawierającej 100 ng gDNA, 5 μl 10x buforu, 3 μlMgSO4 (25 mM), 5 μl dNTP (po 2 mM), 1,5 μl startera Fwd (10 μM), 1,5 μl Rev startera (10 μM), 1 μl polimerazy DNA
      UWAGA: Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności z niskim poziomem błędów dla reakcji PCR.
    3. Ustaw cykl PCR (2 min 95 °C, (20 s 95 °C, 10 s 58 - 65 °C, 18 s 70 °C) x25 powtórz, 2 min 70 °C, na zawsze 4 °C). Ustawić temperaturę wyżarzania z uwzględnieniem przewidywanych wartości Tm podkładu.
    4. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Wprowadzić miejsca ograniczenia do klonowania, powtarzając PCR ze starterami, jak użyto powyżej, ale dodając zwisy na ich końcach 5' (np. Fwd: 5'-ATAT AAGCTTxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATAGGATCCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (BamHI)).
    6. Uruchom 5 μl produktu PCR na żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy nie ma niespecyficznych produktów PCR.
      UWAGA: Jeśli zostanie wykrytych więcej prążków, uruchom cały produkt PCR i oczyść odpowiednią prążek za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.
  3. Ograniczenie
    UWAGA: Aby sklonować ininsert przed promotorem TK22, oczyszczony produkt PCR i wektor (np. TK-Luc) należy roztrawić za pomocą HindIII i BamHI.
    1. Przygotować 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μg oczyszczonego produktu PCR, 1 μl HindIII (20 U/μl), 1 μl BamHI (20 U/μl) i 5 μl 10x buforu.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 250 μl zawierającą 5 μg wektora (TK Luc lub alternatywny wektor reporterowy), 5 μl HindIII (20 U/μl), 5 μl BamHI (20 U/μl), 5 μl termoczułej fosfatazy alkalicznej (1 U/μl) i 25 μl 10x bufor.
      UWAGA: Traktowanie wektora AP znacznie zmniejsza samoligację pojedynczo strawionego wektora, a tym samym tła.
    3. Mieszaniny reakcyjne inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie oczyścić strawione produkty PCR i wektor za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR.
  4. Ligacji
    1. Przygotuj reakcję do ligacji w probówkach PCR, w tym 2 μl 10x bufor ligazy DNA T4, wektor TK-Luc 10 ng, inserta 50 ng (strawiony produkt PCR), 1 μl ligazy DNA T4 (400 U/μl) i woda wolna od nukleaz do 20 μl.
      UWAGA: Przygotować kontrolę ujemną, w której reakcja nie zawiera wstawki.
    2. Delikatnie wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół, krótko odwirować probówki do PCR za pomocą miniwirówki, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić na lodzie i użyć 5 μl produktu do przemiany w 50 μl kompetentnych komórek (np. DH5α).
    4. Użyj standardowej procedury szoku cieplnego, aby przekształcić bakterie, zebrać kolonie i wyizolować plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu. Zweryfikuj wszystkie konstrukcje, sekwencjonując przed kolejnymi krokami.
  5. Transfekcja komórek ES
    1. Używaj płytek 48-dołkowych. Dodać 200 μl 0,1% roztworu żelatyny/basenik 30 minut przed posiewem komórek.
    2. Płytki z embrionalnych komórek macierzystych (ES) na dzień przed transfekcją. Stosować bezpodajnikowe komórki ES i płytkę o gęstości 3 x 104 komórki na studzienkę w 250 μl pożywki ES / studzienkę.
    3. Przygotuj mieszaniny plazmidów (każda mieszanina jest obliczana dla 8 dołków, 4 niepoddanych działaniu i 4 traktowanych kwasem retinowym). Mix 1: 1,250 ng TK-Luc Pusty (kontrola ujemna), 950 ng wektor kodujący β-galaktozydazę (βGal), Mix 2: 1,250 ng wzmacniacz TK-Luc Hoxa1 (kontrola pozytywna), 950 ng βGal, Mix 3: 1,250 ng wzmacniacz TK-Luc PRMT8 (obszar zainteresowania), 950 ng βGal.
      UWAGA: Komórki ES wyrażają pożądane czynniki transkrypcyjne (RAR / RXR). Pozostaw studzienki nietransfekowane, aby określić wartości zasad później podczas pomiarów lucyferazy i β-galaktozydazy.
    4. Dodaj pożywkę surowicy o obniżonej jakości transfekcji do każdej mieszaniny plazmidów do 106 μl całkowitej objętości (wystarcza na 8 dołków).
    5. Dodać 4,5 μl odczynnika do transfekcji o jakości ES, a następnie dokładnie wymieszać, pipetując 15 razy w górę i w dół. Inkubować mieszaninę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać 13 μl mieszanki transfekcyjnej do komórek w każdym dołku, dokładnie wymieszać pipetując. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C) O/N przed poddaniem działaniu liganda.
    7. Ostrożnie usunąć pożywkę przez aspirację z komórek i dodać 250 μl świeżej pożywki/studzienki zawierającej 0,01 - 1 μM kwasu all-trans-retinowego (RA) jako stężenie końcowe lub DMSO jako nośnik. Inkubuj komórki przez 24 - 48 godz.
      UWAGA: Kwas retinowy jest wrażliwy na światło.
  6. Przygotowanie lizatów komórkowych
    1. Rozcieńczyć 5x bufor do lizy (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M ditiotreitol (DTT) (w H2O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml glicerolu, 5 ml Triton X-100, sterylna woda do 100 ml) do 1x za pomocą sterylnej wody, dodać 20 μl 1 M DTT/10 ml i zrównoważyć do RT przed użyciem. Przygotować 10 ml na płytkę 48-dołkową w dniu testu.
    2. Ostrożnie usunąć pożywkę przez aspirację z komórek. Wypłucz komórki raz 1x PBS. Dodaj 200 μl 1x bufor do lizy/studzienki bezpośrednio do komórek.
    3. Wstrząsać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Zamrozić lizaty komórkowe na płytce w temperaturze -80 °C (liza mechaniczna). Lizaty można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka dni.
    4. Rozmrozić lizaty. Po całkowitym rozmrożeniu przenieś lizaty komórek na 96-dołkową płytkę za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej. Przenieść 80 μl lizatu komórkowego na 96-dołkową przezroczystą płytkę do testu β-galaktozydazy i 40 μl lizatu komórkowego na białą płytkę w celu pomiaru lucyferazy. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
  7. Test β-galaktozydazy
    UWAGA: Beta galaktozydaza lub alternatywne drugie reportery powinny być stosowane jako kontrola wewnętrzna w celu uwzględnienia niespecyficznych zmian eksperymentalnych.
    1. Przygotować bufor substratu β-galaktozydazy: 80,0 g Na2HPO4•7H2O, 3,8 g NaH2PO4•H2O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO4•7H2O, uzupełnić do 1 000 ml sterylną wodą. Dostosuj pH do 7,4. Filtr Sterylizuj (0,2 mikrona) i przechowuj w temperaturze 4 °C
    2. Zmieszać 1 ml buforu substratowego β-galaktozydazy z 4 mg ONPG (o-nitrofenylo-β-D-galaktozydazy). Dodać 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (βME) na 1 ml buforu tuż przed użyciem. Dodać 100 μl buforu substratowego β-galaktozydazy do 80 μl lizatu komórkowego.
    3. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C aż do uzyskania słabego żółtego zabarwienia. Odczyt absorbancji przy średnicy zewnętrznej 420 nm na czytniku płytek i eksport danych.
      UWAGA: Czas różni się w zależności od wydajności transfekcji, zwykle nie dłużej niż 30 minut.
  8. Test lucyferazy
    1. Przygotować 50 ml odczynnika substratowego lucyferyny: 15,1 mg soli D-lucyferyny, 82,7 mg soli ATP, 185 mg MgSO4•7H2O, dodać do 50 ml probówki polipropylenowej, następnie dodać 1,5 ml 1 M buforu HEPES, 48,5 ml wody wolnej od ATP, wirować, upewnić się, że wszystkie związki całkowicie się rozpuszczą. Przechowywać 5-10 ml porcji w temperaturze -80 °C.
    2. Przed rozpoczęciem ogrzej 5 ml odczynnika substratowego lucyferyny do RT. Odpipetować 100 μl odczynnika substratowego do każdej studzienki białej płytki zawierającej 40 μl lizatu komórkowego i natychmiast zmierzyć sygnał za pomocą licznika luminescencyjnego.
    3. Wykonaj zadania z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów w potrójnych transfekcjach.
    4. Oblicz najpierw podstawową znormalizowaną aktywność lucyferazy i znormalizowane wartości zasady β-galaktozydazy dla każdej studzienki, odejmując średnie wartości zmierzone dla komórek nietransfekowanych od każdej mierzonej wartości. Następnie oblicz stosunek aktywności lucyferazy do β-galaktozydazy.

3. Charakterystyka RNA wzmacniacza

UWAGA: Bardziej bezpośredni wskaźnik aktywności wzmacniacza wyłonił się z ostatnich badań całego genomu, które zidentyfikowały wiele krótkich, niekodujących RNA, o rozmiarach od 50 do 2000 nt, które są transkrybowane ze wzmacniaczy i są określane jako wzmacniające RNA (eRNA)16,25,26 (Rysunek 4). Indukcja eRNA silnie koreluje z indukcją sąsiednich genów kodujących egzony. W ten sposób zależną od sygnału aktywność wzmacniacza można określić ilościowo in vivo, porównując produkcję eRNA w różnych warunkach za pomocą RT-qPCR.

  1. Wytyczne dotyczące projektowania starterów do wykrywania eRNA za pomocą RT-qPCR
    1. Wybierz regiony genomowe do pomiarów eRNA, które są oddalone o co najmniej 1,5 - 2 kb od miejsc rozpoczęcia transkrypcji z adnotacjami.
      UWAGA: Co ważne, wysokie poziomy transkrypcji mRNA w wzmacniaczach wewnątrzgenowych uniemożliwiają dokładną kwantyfikację eRNA w orientacji zmysłowej, antysensowne eRNA w wzmacniaczach wewnątrzgenowych są wykrywalne i mają podobny poziom do eRNA w wzmacniaczach pozagenowych.
    2. Zgodnie z ogólną zasadą, należy używać regionów 200 - 1,000 pz od środka interesującego miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego do projektowania startera na nici sensownej lub antysensownej (Figura 4 i Figura 6).
      UWAGA: Jeśli dostępne są dane GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 lub H3K27ac ChIP-seq z żądanych typów ogniw i warunków, można je wykorzystać do dokładniejszego projektowania starterów. eRNA są transkrybowane z przypuszczalnych regionów wzmacniających charakteryzujących się wysokimi poziomami H3K4me1 i me3. Ekspresja eRNA dodatnio koreluje ze wzbogaceniem znakowania histonów aktywowanego wzmacniacza H3K27ac.
    3. Zaprojektuj startery PCR do pomiaru eRNA na bazie barwnika fluorescencyjnego RT-qPCR za pomocą Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23Wygeneruj sekwencję antysensowną (odwrotne uzupełnienie nici sensownej) do projektowania startera zgodnie z: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Wstaw 200 - 300 pz sekwencji sensownej lub antysensownej do projektowania podkładu.
  2. Pomiar transkrypcji eRNA
    1. Wyizolować całkowite RNA z leczonych komórek za pomocą dostępnego w handlu odczynnika ekstrakcyjnego na bazie kwaśnego fenolu/chloroformu zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Użyj DNazyI do leczenia wyizolowanego RNA przed użyciem ich w reakcji odwrotnej transkrypcji. Dezaktywuj DNazę zgodnie z zaleceniami producenta przed odwrotną transkrypcją.
    3. Zmierz stężenie RNA po leczeniu DNazą I i użyj 1,000 ng na reakcję RT. Użyj wysokiej jakości odwrotnej transkryptazy.
      UWAGA: Ponieważ duża liczba eRNA może nie być poliadenylowana, odwrotna transkrypcja wymaga użycia losowych starterów.
    4. Wykryj odwrotną transkrypcję eRNA za pomocą RT-qPCR przy użyciu standardowej procedury. Zmierz mRNA niezależnego od leczenia w celu normalizacji (np. 36B4, Ppia, Gapdh, Actb).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy przeciwciała RXR specyficznego dla pana, aby zidentyfikować w całym genomie, które geny regulowane przez RZS mają wzbogacenie receptorów w swoim bliskim sąsiedztwie. Analiza bioinformatyczna danych RXR ChIP-seq uzyskanych z komórek ES traktowanych kwasem retinowym ujawniła wzbogacenie miejsca połówkowego receptora jądrowego (AGGTCA) w miejscach zajętych przez RXR (ryc. 1). Korzystając z algorytmu bioinformatycznego, zmapowaliśmy wynik wyszukiwania motywu dla poło...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach postępy w technologii sekwencjonowania umożliwiły przewidywanie na dużą skalę wzmacniaczy w wielu typach komórek i tkanek 7-9. Opisany powyżej przepływ pracy pozwala na przeprowadzenie podstawowej charakterystyki potencjalnych wzmacniaczy wybranych na podstawie danych ChIP-seq. Szczegółowe kroki i notatki pomogą każdemu skonfigurować rutynową walidację wzmacniacza w laboratorium.

Najbardziej krytycznym krokiem w teście reporterowym lucyferazy jest wydajność transf...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Bence Danielowi, Mattowi Peloquinowi, Dr. Endre Barta, Dr. Balintowi L. Balintowi oraz członkom laboratorium Nagya za dyskusje i komentarze na temat manuskryptu. L.N jest wspierany przez granty z Węgierskiego Funduszu Badań Naukowych (OTKA K100196 i K111941) oraz współfinansowany przez Europejski Fundusz Społeczny i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego oraz Węgierski Program Badań nad Mózgiem - Grant No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polimeraza DNA KODMerck Millipore71085-3do amplifikacji PCR wzmacniacza z gDNA
DNeasy Blood & Zestaw chusteczek Qiagen69504do izolacji genomowego DNA
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28106do oczyszczania produktu PCR
Zestaw do ekstrakcji żelu Qiagen28706do ekstrakcji żelu, jeśli jest więcej produktu PCR
HindIIINEBR3104Lrestrykcyjny
BamHINEBEnzym restrykcyjnyR3136L
FastAPThermo ScientificEF0651uwalnianie grup 5'- i 3'-fosforanowych z DNA
T4 Ligaza DNANEBM0202do ligacji
QIAprep Zestaw Spin MiniprepQiagen27106do izolacji plazmidu
DMEMGibco31966-021ES media
FBSHycloneSH30070.03ES media
MEM Aminokwas endogennySigmaM7145ES media
Penicylina-StreptomycynaSigmaP4333ES media
Beta MerkaptoetanolSigmaM6250ES Media
FuGENE HD Odczynnik do transfekcjiPromegaE2311
Opti-MEM® I Reduced SerumMedium Life Technologies31985-062do transfekcji
kwasu all-trans retinowegoSigmaR2625, do aktywacji 96-dołkowej przezroczystej płytki RAR / RXR
655101do testu beta galaktozydazy
96-dołkowa biała płytkaGreinera655075do testu lucyferazy
D-lucyferyna, sól potasowaGoldbio.com115144-35-9do testu lucyferazy
sól ATPSigmaA7699-1Gdo testu lucyferazy
MgSO4• 7H2OSigma230391-25Gdo testu lucyferazy
HEPESSigmaH3375-25Gdo testu lucyferazy
Na2HPO4 • 7H2OSigma431478-50Gdo testu beta galaktozydazy
NaH2PO4 • H2OSigmaS9638-25Gdo testu beta galaktozydazy
MgSO4• 7H2OSigma230391-25Gdo testu beta galaktozydazy
KClSigmaP9541-500Gdo testu beta galaktozydazy
ONPG (o-nitrofenylo-β-D-galaktozydaza)SigmaN1127-1Gdo testu beta galaktozydazy
TRIzol®Life Technologies15596-026Izolacja RNA
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności LifeTechnologies4368814odwrotną transkrypcję eRNA
Dnazy bez rnazyLeczenie DnazyPromegaM6101
SsoFast Eva GreenBioRad750000105RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym MaszynaBioRadqPCR
Czytnik mikropłytek BioTek Synergy 4Licznik luminescencyjnyBioTek
enzym Ligand

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene Regulatory ElementsRetinoic Acid InducedEmbryonic Stem CellChIP seq Data AnalysisReporter Assay ValidationEnhancer RNA DetectionLuciferase Activity MeasurementBeta Galactosidase AssayTranscription Factor BindingEnhancer Trap Experiment

Related Articles