Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Podsumowanie

Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.

Streszczenie

Chociaż przyjmuje się, że serce ma ograniczony potencjał do regeneracji kardiomiocytów po urazie i że niski poziom obrotu kardiomiocytów występuje podczas normalnego starzenia się, kwantyfikacja tych zdarzeń pozostaje wyzwaniem. Wynika to częściowo z rzadkości tego procesu i faktu, że wiele źródeł komórkowych przyczynia się do utrzymania mięśnia sercowego. Co więcej, duplikacja DNA w kardiomiocytach często prowadzi do powstania poliploidalnych kardiomiocytów i rzadko prowadzi do powstania nowych kardiomiocytów w wyniku podziału komórkowego. Aby dokładnie określić ilościowo obrót kardiomiocytów, niezbędne jest rozróżnienie tych procesów. Opisany tutaj protokół wykorzystuje długoterminowe znakowanie nukleozydów w celu znakowania wszystkich jąder, które powstały w wyniku replikacji DNA i jąder kardiomiocytów zidentyfikowanych przez wykorzystanie izolacji jąder i późniejszego znakowania immunologicznego PCM1. Razem pozwala to na dokładną i czułą identyfikację znakowania nukleozydów w populacji jąder kardiomiocytów. Ponadto znakowanie 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem i analiza ploidii jąder umożliwia odróżnienie jąder neo-kardiomiocytów od jąder, które zawierają nukleozyd podczas poliploidyzacji. Chociaż metoda ta nie może kontrolować binukleacji kardiomiocytów, umożliwia szybką i solidną ocenę ilościową jąder neokardiomiocytów przy jednoczesnym uwzględnieniu poliploidyzacji. Metoda ta ma szereg dalszych zastosowań, w tym ocenę potencjalnych terapii poprawiających regenerację kardiomiocytów lub badanie wpływu chorób serca na obrót kardiomiocytów i ploidalność. Technika ta jest również kompatybilna z dodatkowymi dalszymi technikami immunohistologicznymi, umożliwiając ilościowe określenie inkorporacji nukleozydów we wszystkich typach komórek serca.

Wprowadzenie

W ostatnich latach nagromadziło się wiele dowodów podważających przypuszczenie, że serce jest nieuleczalnie zróżnicowanym, postmitotycznym organem^1,2. Jednak ilościowe określenie obrotu i regeneracji kardiomiocytów pozostaje wyzwaniem.

Trudności w dokładnym zidentyfikowaniu rzadkiego generowania kardiomiocytów przy użyciu standardowych technik immunohistochemicznych są dobrze opisane³. Ponadto komórkowe źródło wytwarzania kardiomiocytów pozostaje niepewne, z dowodami na udział proliferacji kardiomiocytów, a także różnicowania komórek macierzystych^4-6. W związku z tym stosowanie modeli śledzenia linii, które wymagają znajomości fenotypu progenitora kardiomiocytów, jest niemożliwe, a kwantyfikacja proliferacji w pojedynczej populacji, w tym kardiomiocytach, jest niewłaściwa. Ponadto kardiomiocyt ma potencjał do endoreplikacji bez kariokinezy (skutkującej poliploidalnym kardiomiocytem) lub kariokinezy przy braku cytokinezy (w wyniku do dwujądrowego kardiomiocytu)^7,8. Dokładna kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów zależy od zdolności do rozróżnienia między tymi zdarzeniami a prawdziwym wytwarzaniem neokardiomiocytów. Stwarza to wyjątkowe komplikacje, ponieważ replikacja DNA i ekspresja kinaz zależnych od cyklin w kardiomiocytach nie wykazuje wyłącznie prawdziwego podziału komórek^9,10.

Aby pomóc w ilościowym określeniu generacji neo-kardiomiocytów, połączyliśmy sprawdzoną technikę izolacji jąder i immunologiczne znakowanie materiału pericentriolarnego 1 (PCM1) do identyfikacji jąder kardiomiocytów, jak opisali Bergmann i wsp.^7,11 z nowatorskimi metodami długoterminowego znakowania DNA i analizy ploidalnej. PCM-1 jest białkiem centrosomalnym, które gromadzi się na powierzchni jądra zróżnicowanych, niecyklicznych miocytów. Wcześniejsze badania wykazały, że przeciwciała przeciwko PCM-1 specyficznie znakują jądra kardiomiocytów^7,11 i jako takie PCM1 był używany przez wiele niezależnych grup do identyfikacji kardiomiocytów^1,12,13. Ponadto wykazaliśmy, że ekspresja PCM1 mapuje się na genetycznie znakowane jądra kardiomiocytów w transgenicznym modelu myszy TnT-cre¹⁴ (rysunek uzupełniający 1).

Opisany tutaj protokół umożliwia dokładną i czułą identyfikację generacji jąder neo kardiomiocytów w sercu myszy, niezależnie od pochodzenia komórkowego (Rysunek 1A i B), jednocześnie wykluczając z analizy znakowanie nukleozydów spowodowane poliploidyzacją (Rysunek 1C i D). Chociaż metoda ta nie może kontrolować binukleacji kardiomiocytów, umożliwia szybką i solidną kwantyfikację jąder neo-kardiomiocytów, która jest wymagana do dokładnego ilościowego określenia obrotu kardiomiocytów. Co więcej, stanowi narzędzie do szybkich badań przesiewowych w celu oceny potencjalnych zmian w dynamice wytwarzania kardiomiocytów.

Podczas gdy znakowanie DNA zwykle obejmuje 5-Bromo-2′-deoksyurydynę (BrdU) jako analog tymidyny, opisany tutaj protokół wykorzystuje test oparty na 5-etynylo-2'-deoksyurydynie (EdU), ponieważ wymaga mniejszej liczby etapów przetwarzania dla szybszego przepływu i nie wymaga denaturacji DNA do wykrywania immunologicznego, co czyni go kompatybilnym z innymi protokołami immunobarwienia i tym samym zwiększa potencjalne dalsze zastosowania metody.

Rycina 1: Ciągłe pulsowanie z markerami EdU neokardiomiocytów niezależnie od ich progenitorów. (A) EdU jest wbudowywany w DNA kardiomiocytów podczas podziału komórek. Proliferacja w populacji kardiomiocytów spowoduje wzrost lub wymianę kardiomiocytów, a zatem jest produktywną syntezą DNA (przyczynia się do utrzymania i naprawy tkanek). (B) EdU jest włączany do DNA komórek progenitorowych serca podczas podziału komórkowego. Zostanie to zachowane w komórce podczas różnicowania do linii kardiomiocytów. To różnicowanie komórek macierzystych spowoduje również wzrost liczby kardiomiocytów, a tym samym przyczyni się do utrzymania i naprawy tkanek. (C) Kardiomiocyty mają potencjał do ulegania "nieproduktywnej" replikacji DNA, co skutkuje zwiększoną ploidią kardiomiocytów, co jest związane z przerostem kardiomiocytów i przebudową mięśnia sercowego, ale nie zastępuje utraconych kardiomiocytów. Proces poliploidyzacji różni się od dwunukleizacji, ponieważ prowadzi do powstania kardiomiocytu z pojedynczym jądrem, które zawiera cztery lub więcej zestawów dwóch homologicznych chromosomów (>2N). (D) Po ciągłym impulsie jąder, protokół ten opisuje izolację jąder i identyfikację jąder kardiomiocytów przez ekspresję PCM1, aby umożliwić ilościowe określenie zarówno ploidalności kardiomiocytów, jak i inkorporacji EdU. Ekspresja PCM1 i inkorporacja EdU wykryte za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Praca ze zwierzętami została autoryzowana i zatwierdzona przez komisję etyczną Uniwersytetu w Newcastle. Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

1. Administracja EdU

1. Rozpuścić EdU w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% w/v) w końcowym stężeniu 12,5 mg/ml.
   1. Podgrzać roztwór do temperatury 40 °C i przepłukać wirem w celu całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać wystarczającą ilość EdU/soli fizjologicznej w temperaturze 4 °C, aby wstrzyknąć wszystkim myszom biorącym udział w badaniu, co pozwala na 6 wstrzyknięć dziennie.
      Uwaga: Zazwyczaj dla każdej grupy eksperymentalnej potrzeba ponad 6 myszy. Jednak obliczenia mocy należy wykonać w przypadku niezależnych badań.
2. Zważ pojedyncze myszy. Obliczyć wymaganą objętość, aby podać 100 μg/g roztworu EdU/soli fizjologicznej każdej myszy (8 μl podstawowego roztworu EdU na g).
3. Nabrać odpowiednią objętość EdU/soli fizjologicznej do strzykawki insulinowej za pomocą igły 25 G.
4. Wykonuj zastrzyki dootrzewnowe (i.p.) podczas pracy z myszami przy użyciu zatwierdzonych technik Home Office.
   1. Umieść mysz na pokrywie klatki. Delikatnie pociągnij do tyłu podstawę ogona i mocno chwyć mysz za kark.
   2. Odsłonić brzuch do wstrzyknięcia, przytrzymując mysz palcem wskazującym i kciukiem w pobliżu podstawy głowy i przechylając głowę zwierzęcia do tyłu w kierunku podłogi.
   3. Przetrzyj brzuch 70% roztworem alkoholu. Zlokalizuj linię środkową zwierzęcia i prawy dolny kwadrant. Wstrzyknąć roztwór EdU/soli fizjologicznej zwierzęciu w prawym dolnym kwadrancie.
   4. Wstrzyknij myszom roztwór EdU/soli fizjologicznej i zapisz porę dnia.
5. Powtarzaj kroki od 1,2 do 1,4 o tej samej porze dnia przez 6 kolejnych dni.
   Uwaga: Ponieważ kontrola ujemna EdU jest wymagana do ustawienia bramkowania do analizy cytometrii przepływowej, wstrzyknij dodatkowej myszy dopasowanej pod względem wieku, płci i doświadczalnie równoważnej objętości soli fizjologicznej bez EdU. Zapewni to wymaganą kontrolę (brak kontroli EdU). Kontrola ta powinna być uwzględniona w każdym badaniu, aby uwzględnić różnice w partiach odczynników i ustawieniach cytometru.

2. Zbieranie serc

1. Po 24 godzinach od szóstego wstrzyknięcia EdU należy pośmiertnąć myszy za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (lub alternatywnej metody zatwierdzonej przez Home Office zgodnie z Harmonogramem 1).
2. Ułóż ofiarowane zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wykonaj nacięcie skóry od środkowej części brzucha do przepony za pomocą nożyczek chirurgicznych.
3. Przetnij przeponę i trzymając mostek z dala od jamy ciała, przetnij obustronnie, aby odsłonić serce.
4. Lekko unieś serce i przetnij główne naczynia krwionośne drogi odpływu, aby wypreparować serce z jamy klatki piersiowej.
5. Natychmiast umieścić każde serce w pojedynczej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS schłodzonej do temperatury 4 °C.
6. Przełóż serca na oddzielne 10-centymetrowe szalki Petriego, za pomocą skalpela przetnij każde serce na dwie części w orientacji strzałkowej i umyj serce, delikatnie ściskając je kleszczami. Następnie wymień PBS, aby usunąć jak najwięcej krwi. Powtórz ten krok dwukrotnie.
7. Umieść obie części każdego serca w tej samej pojedynczej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
8. Kontynuuj do kroku 3 lub alternatywnie przechowuj próbki w temperaturze -80 °C, jak opisano w krokach 2.9 i 2.10.
9. Za pomocą igły 25 G wykonaj mały otwór w pokrywie probówki do mikrowirówki, aby zapobiec otwarciu pokrywki z powodu rozszerzania się gazów podczas przetwarzania serca.
10. Oznacz każdą probówkę mikrowirówki i umieść w pojemniku z ciekłym azotem do zamrożenia.

3. Dysocjacja jąder i znakowanie jąder kardiomiocytów

Uwaga: Ta dysocjacja jąder i oznaczanie jąder kardiomiocytów jest zaadaptowane z tego Bergmanna i wsp.¹¹ Procedurę tę należy wykonać na wszystkich próbkach, do których wstrzyknięto EdU i kontrolę ujemną z wstrzykiwaną solą fizjologiczną (bez kontroli EdU). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przepisem na roztwory wymagane do wykonania tych kroków.

1. Dla każdego serca, które ma być analizowane, umieścić 36 ml 1% roztworu BSA/PBS w probówce ultrawirówkowej, inkubować przez 30 minut, wyrzucić roztwór, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
   Uwaga: Ta rurka jest używana w kroku 3.6.
2. Umieść pojedyncze zamrożone serca na naczyniu o średnicy 10 mm na lodzie i zmiel za pomocą skalpela, aby serca rozmroziły się podczas procesu mielenia.
3. Umieść zmielone serca w 15 ml buforu do lizy komórek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i homogenizuj za pomocą homogenizatora z sondą przez 15 sekund przy 25 000 obr./min w temperaturze pokojowej.
4. Dodać kolejne 15 ml buforu do lizy komórkowej do probówki wirówkowej i przenieść do 40 ml pojemnika do dnania za pomocą dużego tłuczka do prześwitu. Wykonaj 10 uderzeń tłuczkiem i przefiltruj przez sitko o średnicy 100 μm, a następnie 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Wirować przez 10 minut przy 700 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
6. Zawiesić ponownie osad jądrowy w 25 ml roztworu sacharozy o gradiencie i nałożyć jądra komórkowe zawierające roztwór na 10 ml świeżego roztworu gradientu sacharozy w probówce do ultrawirówki przygotowanej w 3.1.
7. Wirować przy 13 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C za pomocą odchylanego wirnika rurowego.
8. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jądrowy w 1 300 μl buforu do przechowywania jąder w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i oznaczyć PCM1.
9. Pobrać 300 μl zawiesiny do nowej probówki do mikrowirówki i dodać do 700 μl buforu do przechowywania świeżych jąder. Oznacz tę rurkę jako kontrolę ISO.
10. Dodać anty-PCM1 w końcowym stężeniu 8 μg/ml do probówki mikrowirówki oznaczonej PCM1 i dodać przeciwciało kontrolne IgG królika o stężeniu 8 μg/ml do probówki mikrowirówki oznaczonej kontrolą ISO.
11. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji odwirować przy 700 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant, zastąpić 1 ml świeżego buforu do przechowywania jąder, ponownie zawiesić i ponownie odwirować przez 10 minut przy 700 g. Odrzucić supernatant i zastąpić go 1 ml świeżego buforu do przechowywania jąder.
12. Dodać 1 μl F(ab')2 Fragmentu koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H+L) (FITC lub równoważnego barwnika zielonofluorescencyjnego), aby uzyskać końcowe stężenie 2 μg/ml.
    Uwaga: Zastosowanie przeciwciała przeciwko fragmentowi F(ab')2 zmniejsza potencjał nieswoistego znakowania komórek odpornościowych, w tym makrofagów i limfocytów B.
13. Zawinąć probówki w folię aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.

4. Wykrycie inkorporacji EdU

1. Rozcieńczyć 10x skoncentrowany bufor reakcyjny EdU w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną.
2. Odwirować zawiesiny jąder znakowane PCM-1 i kontrolą ISO przy 700 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jądrowy w 1 ml 1% roztworu BSA/PBS. Umyj osad jąder dwukrotnie.
3. Po ostatnim przemyciu wyrzucić supernatant i zastąpić go 100 μl utrwalacza EdU.
4. Zawiń probówki w folię aluminiową, aby chronić je przed światłem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Przemyć próbki dwukrotnie 1 ml 1% roztworu BSA/PBS, odwirować przy 700 x g i inkubować z 1 x roztworem permeabilizacyjnym na bazie saponin w temperaturze pokojowej przez 15 min.
6. Przygotuj 1x koktajl do etykietowania EdU (Tabela 2). Wymagane będą co najmniej 2 reakcje, aby uwzględnić kontrolę bez EdU.
7. Dodać 500 μl 1x koktajlu do znakowania EdU bezpośrednio do każdej próbki już zawierającej jądra w 100 μl 1x roztworu permeabilizacyjnego na bazie saponin i inkubować w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez 30 min.
8. Odwirować przy 700 x g i ponownie zawiesić w 1 ml 1% BSA/PBS i powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy.
9. Odwirować przy 700 x g, odrzucić supernatant i zastąpić 400 μl roztworu barwiącego DNA (patrz tabela materiałów).

Nazwa odczynnika

1. Bufor do lizy komórek

0,32 M sacharoza

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM octan magnezu

2,0 mM EDTA

0,5 mM EGTA

1 mM naziemna telewizja cyfrowa

2. Roztwór gradientu sacharozy

2,1 M sacharoza

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM octan magnezu

1 mM naziemna telewizja cyfrowa

3. Bufor do przechowywania jąder (NSB)

0,44 M sacharoza

10 mM Tris-HCl (pH = 7,2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1,5 mM sperminy

Tabela 1: Składniki bufora do izolacji jąder. Receptura dla wszystkich stosowanych w sekcji 3 protokołu (Dysocjacja jąder i znakowanie jąder kardiomiocytów).

5. Analiza cytometryczna przepływowa

Uwaga: Wykonaj cytometrię przepływową na izolowanych jądrach, jak opisano wcześniej^7,11,15.

1. Najpierw utwórz wykres opisujący rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby umożliwić odróżnienie jąder od szczątków (rysunek 2A).
2. Utwórz wykres, aby odróżnić pojedyncze jądra od agregatów (Rysunek 2B), wykreślając obszar 4',6-diamidyno-2-fenyloindolowy) (DAPI) (3-405/450/50-A) w stosunku do wysokości (33-405/450/50-H). Upewnij się, że sygnał 3-405/450/50-A jest zbierany na skali liniowej, aby umożliwić prawidłowe określenie zawartości DNA.
3. Utworzyć wykres opisujący 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC i wyświetlić tylko zdarzenia z bramki singletowej utworzonej w 5.2 w celu oceny ekspresji PCM-1 w populacji singletów.
4. Uruchomić próbkę kontrolną Isotype, aby ustalić bramkę dodatnią PCM-1 (rysunek 2C). Uruchom niewielką ilość próbki znakowanej PCM1, aby zweryfikować populację wyrażającą PCM1 i pozycję bramkowania.
5. Utwórz wykres opisujący SSC-A vs 405/450/50-A (w celu wykrycia DAPI). Na tym wykresie wyświetl tylko jądra singletowe wyrażające PCM1, używając bramek utworzonych w 5.3. Użyj tego wykresu, aby utworzyć dodatkową bramkę hierarchiczną, która zawiera tylko jądra 2N (rysunek 2D).
6. Utwórz wykres opisujący 488/535/30-A vs 1-633/660/20-A, aby umożliwić identyfikację znakowania EdU populacji kardiomiocytów wykazujących ekspresję PCM1. Wyświetlić tylko jądra, które są singletowe, PCM1+ i 2N przy użyciu powyższego bramkowania.
7. Uruchom próbkę serca bez kontroli EdU, aby ustawić dodatnią bramkę EdU (rysunek 2E). Stwórz odpowiednią bramkę dla ogniw EdU+.
8. Rejestruj i określaj ilościowo singlety, ekspresję PCM-1, jądra 2N, które zawierają EdU.
9. Oblicz tę populację jako procent całkowitych jąder singletowych, PCM1+. Zapewni to szybkość wytwarzania jąder neo-kardiomiocytów podczas 7-dniowego okresu impulsu EdU, jako procent całkowitych jąder kardiomiocytów.
   Uwaga: Ponieważ wiązanie DAPI z DNA jest stechiometryczne, intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do ilości DNA. Określ ploidalność na podstawie intensywności sygnału 405/450/50-A, jak opisano wcześniej⁷.
10. Aby ocenić ploidalność w całej populacji kardiomiocytów, należy użyć wykresu ustalonego w 5.5 i strategii bramkowania opartej na stężeniu DNA⁷.

Rycina 2: Strategia bramkowania w celu ilościowego określenia inkorporacji EdU kardiomiocytów i ploidalności. (A) Jądra są odróżniane od szczątków na podstawie rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). (B) Tworzona jest bramka liniowa i identyfikowana jest populacja jąder singletowych na podstawie znakowania DAPI i sygnału 405/450/50 wysokość w funkcji powierzchni. (C) Bramkowanie fluorescencyjne umożliwia oddzielenie jąder kardiomiocytów (PCM-1-dodatnich) i niekardiomiocytów (PCM-1-ujemnych) od tkanki serca. (D) Intensywność sygnału DAPI służy do określenia stężenia DNA, a tym samym ploidalności jąder populacji kardiomiocytów PCM1+. U myszy >80% jąder kardiomiocytów jest diploidalnych (2n). (E) Bramkowanie fluorescencyjne umożliwia oddzielenie 2N, jąder kardiomiocytów, które mają włączone EdU (PCM+/EDU+ = 0,9%) od 2N, kardiomiocytów, które nie mają włączonego EdU (PCM+EDU-). Wszystkie kroki są szczegółowo opisane w protokole 5.0. Przykład pokazany z myszy mdx^-/y na tle C57/BL10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Ta metoda pozwala na ilościowe określenie zwiększonej inkorporacji EdU w wyniku podziału jąder kardiomiocytów, jednocześnie kontrolując zwiększoną poliploidyzację. Korzystając z testu opartego na BrdU, wykazaliśmy wcześniej, że serce ssaków reaguje na przewlekłą utratę kardiomiocytów w mysim modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a mdx regeneracją nowych kardiomiocytów. Wykorzystaliśmy opisane tutaj metody, aby jeszcze bardziej zweryfikować nasze opublikowane wyniki i zademonstrować użyteczność protokołu. Zgodnie z opisanym protokołem; dorosłym (12-tygodniowym) myszom MDX i kontrolnym BL10 podawano pulsacyjnie jedno codzienne wstrzyknięcie EdU przez 7 dni, zgłoszone wcześniej, aby umożliwić analizę statyczną między grupami eksperymentalnymi^5,13. Analiza immunohistologiczna pulsujących serc wykazuje obecność kardiomiocytów wyrażających PCM1, które mają włączone EdU (ryc. 3A). Jednak dane uzyskane za pomocą metod immunohistologicznych mogą być błędnie interpretowane, ponieważ inne typy komórek, które zawierają EdU, mogą być błędnie identyfikowane jako kardiomiocyty. Przykład tego przedstawiono na rysunkach uzupełniających 1A i B. Ponadto metody immunohistologiczne nie odróżniają poliploidyzacji od podziału jądrowego. Analiza cytometrii przepływowej szczegółowo opisana w tym protokole umożliwia szybkie ilościowe określenie podziału jądra kardiomiocytów u myszy mdx i kontrolnych, przy jednoczesnym wykluczeniu komórek, które włączyły EdU z powodu poliploidyzacji. Podobnie jak w przypadku wcześniej opublikowanych danych¹³, analiza wykazała wzrost szybkości wytwarzania jąder neokardiomiocytów w sercach myszy mdx w porównaniu z grupą kontrolną dopasowaną do wieku (1,2% w porównaniu z 0,17%; Rysunek 3B i C).

Rycina 3: Kwantyfikacja kardiomiocytów znakowanych EdU w sercach typu dzikiego i mdx. (A) Obraz wypustek stosu Z wykonanych z odcinków serc mdx o grubości 40 μm. Jądra kardiomiocytów z ekspresją PCM-1 (zielone), które zawierają EdU (czerwony). Żółta strzałka oznacza kardiomiocyty oznaczone EdU. i i ii wskazują pojedyncze kardiomiocyty znakowane EdU pokazane w płaszczyźnie Z. Jądra znakowane DAPI (niebieskie) (B i C) Cytometria przepływowa izolowanych jąder przedstawiająca reprezentatywne wykresy od 12-13 tygodniowych myszy typu dzikiego (C57/BL10) i mdx (mdx^-/y na tle C57/BL10). (B) Histogram przedstawiający intensywność DAPI i rozróżnienie między jądrami 2N i >2N. (C) Wykresy przedstawiające włączenie EdU do populacji jąder kardiomiocytów 2N podczas analizy zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Wszystkim myszom Edu podawano przez 1 tydzień od 12 tygodnia życia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: PCM-1 jest specyficznym markerem jąder kardiomiocytów. Korzystając z opisanego protokołu, jądra wyizolowano z podwójnie transgenicznej myszy wytworzonej przez skrzyżowanie myszy TNT-cre¹⁴ z czułą linią reporterową¹⁶ ROSA^nT/nGcre. W powstałym mysim cre aktywacja pod kontrolą promotora troponiny T (TNT) prowadzi do nieodwracalnej ekspresji GFP z jest zlokalizowany w jądrach. Jądra znakowane kontrolą izotypu (Iso) wykazują zdolność do identyfikacji populacji jąder kardiomiocytów wykazujących ekspresję GFP (488/530/30-A). Znakowanie jąder anty-PCM1 (przeciwciało drugorzędowe wykrywane przez 633-660/20-A) wykazuje korelację ekspresji PCM1 z populacją jąder kardiomiocytów eksprymujących GFP. W tym przykładzie 98,8% jąder kardiomiocytów, zidentyfikowanych na podstawie aktywności promotora TNT, jest znakowanych przeciwciałem PCM1. Kliknij tutaj, aby pobrać Rysunek Uzupełniający 1.

Rysunek uzupełniający 2: Wyzwania związane z ilościowym określaniem odnowy kardiomiocytów za pomocą technik immunohistologicznych. (A) Obraz 2D pokazuje dwa jądra kardiomiocytów wykazujące ekspresję PCM-1 (zielone), które wydają się być również oznaczone jako EdU (czerwony). Żółte strzałki wskazują coś, co wydaje się być kardiomiocytami, które zawierają EdU. Wynika to z pozornej kolokalizacji ekspresji PCM1 i znakowania EdU podczas wizualizacji za pomocą obrazowania 2-wymiarowego. (B) Trójwymiarowa projekcja tego obrazu identyfikuje, że komórki znakowane EdU nie są kardiomiocytami, ale są komórkami niekardiomiocytów pokrywającymi jądra kardiomiocytów z ekspresją PCM1. Myszy C57/BL10 w wieku 12 tygodni używane do eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać rysunek uzupełniający 2A. Kliknij tutaj, aby pobrać Rysunek Uzupełniający 2B.

Składniki reakcji	Liczba reakcji
	cyfra arabska	5
Pbs	875 μl	2,19 ml
Miedziany środek ochronny	20 μl	50 μl
Barwnik fluorescencyjny azydek pikolilu	5 μl	12,5 μl
Rozcieńczony bufor reakcyjny przygotowany w 4.1	100 μl	250 μl
Całkowita objętość reakcji	Pojemność 1 ml	Pojemność 2,5 ml

Tabela 2: Składniki koktajlu EdU. Przepis na koktajl znakujący EdU wymagany w sekcji 4 protokołu (Wykrywanie inkorporacji EdU).

Dyskusja

Aby dokładnie określić ilościowo obrót i regenerację kardiomiocytów, testy muszą rozróżniać między prawdziwym generowaniem kardiomiocytów a nieproduktywnym podziałem DNA. Wiele badań nadal po prostu ignoruje te nieproduktywne zdarzenia, określając ilościowo proliferację kardiomiocytów wyłącznie poprzez ekspresję kinezy cykliny i markerów cyklu komórkowego. Do tej pory jedna metoda, która pozwala na dokładne ilościowe określenie obrotu kardiomiocytów przy jednoczesnej kontroli tych nieproduktywnych zdarzeń, pozostaje aluzyjna. W szczególności trudno jest wyjaśnić poliploidyzację kardiomiocytów, która przyczynia się do ~65% replikacji DNA kardiomiocytów¹³. Dlatego, aby pomóc w dokładnej kwantyfikacji wytwarzania kardiomiocytów, opracowaliśmy protokół, który pozwala na solidną kwantyfikację szybkości jąder neo kardiomiocytów, wykluczając jednocześnie replikację DNA, która powoduje zwiększoną ploidalność. Chociaż protokół ten nie może rozróżnić między wytwarzaniem neo-kardiomiocytów a dwunukleacją kardiomiocytów, można go szybko i dokładnie obliczyć górną granicę (z uwzględnieniem ploidalności) generacji kardiomiocytów. Protokół ten stanowi zatem narzędzie przesiewowe do oceny potencjalnych zmian w tempie wytwarzania kardiomiocytów i poliploidyzacji w modelach chorób lub do oceny potencjalnej skuteczności terapii. Po zidentyfikowaniu zmian w tempie wytwarzania jąder neo-kardiomiocytów za pomocą tego protokołu, można wykorzystać kolejne badania w celu ustalenia, czy jest to spowodowane zmianami w wytwarzaniu kardiomiocytów liczby zarodków kardiomiocytów, jak opisano wcześniej^2,13,17,18. Obejmują one wykorzystanie histologicznej kwantyfikacji dynamiki zarodkowania kardiomiocytów w okresie tętna lub analizy skrawków tkanek uzyskanych od zwierząt pulsujących EdU w celu porównania inkorporacji EdU w populacjach kardiomiocytów jednojądrowych i wielojądrowych.

Ze względu na niski poziom obrotu kardiomiocytów, protokół ten wykorzystuje wielokrotne wstrzyknięcia EdU w ciągu 7 dni. Pozwala to również na "ściganie" wszystkich potencjalnych komórkowych źródeł wytwarzania kardiomiocytów i pozwala na ilościowe określenie skumulowanego wytwarzania jąder kardiomiocytów w tym okresie. W zależności od badania, ten przedział czasowy może być dostosowany do przewidywanych poziomów wytwarzania kardiomiocytów. W celu dokładnego ilościowego określenia inkorporacji EdU w jądrach kardiomiocytów konieczne jest, aby nie było niespecyficznego znakowania jąder przeciwciałem drugorzędowym używanym do wykrywania reaktywności PCM-1. W związku z tym rozsądne byłoby przeprowadzenie dodatkowych doświadczeń z miareczkowaniem przeciwciał drugorzędowych w celu optymalizacji tego aspektu protokołu, w szczególności jeżeli ma być użyte przeciwciało drugorzędowe inne niż sugerowane w niniejszym protokole. Opisany tutaj protokół wykorzystuje ekspresję PCM-1 do identyfikacji jąder kardiomiocytów. Chociaż jest to uznany marker kardiomiocytów, do walidacji danych można użyć alternatywnych markerów; należą do nich przeciwciała specyficzne dla sercowej troponiny T, która została zidentyfikowana jako częściowo zlokalizowana w jądrach kardiomiocytów¹. Podobnie, alternatywne białka zlokalizowane jądrowo mogą być wykorzystane do identyfikacji i ilościowego określenia inkorporacji EdU w populacjach jąder innych niż kardiomiocyty. Ważne jest, aby wszystkie jądra kardiomiocytów, które aktywnie przechodzą mitozę, zostały wyłączone z analizy, ponieważ los tej syntezy DNA jest nieznany i może skutkować podziałem komórek lub zwiększoną ploidalnością. PCM1 ulega rozkładowi podczas fazy M cyklu komórkowego, dlatego kardiomiocyty przechodzące mitozę nie zostaną zidentyfikowane na podstawie ekspresji PCM1. Ponadto wszystkie jądra w fazie s cyklu komórkowego powinny być wyłączone z dalszej analizy. Można to osiągnąć poprzez bramkowanie wszystkich jąder o intensywności DAPI powyżej populacji 2N, w tym tych o intensywności DAPI między populacjami 2N i 4N.

Chociaż coraz częściej przyjmuje się, że serce ma zdolność do zastępowania kardiomiocytów podczas normalnego starzenia się i po ostrym urazie, źródło i stopień tego potencjału pozostaje kontrowersyjne. Ponadto stwierdzono rozbieżne tempo obrotu kardiomiocytów^1,7,20-22. Może to częściowo wynikać z trudności w dokładnej identyfikacji i ilościowym określeniu generacji neokardiomiocytów¹⁹. Do tej pory większość badań opierała się wyłącznie na analizie histologicznej i identyfikacji kardiomiocytów poprzez ekspresję białek cytoplazmatycznych, w tym białek sarkomeru, w celu ilościowego określenia obrotu i odnowy kardiomiocytów^2,4,23,24. Zastosowanie tych metod do wykrywania ekspresji markerów proliferacji lub, jak wykazano tutaj, włączenie analogów tymidyny może łatwo spowodować błędną identyfikację innych typów komórek serca jako kardiomiocytów. Chociaż zastosowanie obrazowania konfokalnego 3D może pomóc w złagodzeniu tych problemów, metody te są drogie i czasochłonne. Co ciekawe, opisany tutaj protokół pokazuje, że wytwarzanie jąder neokardiomiocytów zachodzi w tempie 0,17% tygodniowo. Jest to zgodne z innymi badaniami opartymi na cytometrii przepływowej, które wykazały tygodniowe wskaźniki rotacji do 0,13%⁵. Chociaż kuszące jest ekstrapolowanie rocznych wskaźników rotacji na podstawie tych danych, podobnie jak w poprzednich badaniach^2,5,25,26, jest to niewłaściwe, ponieważ wskaźniki rotacji są dynamiczne w ciągu życia zwierzęcia¹³.

Metoda ta ma szereg potencjalnych zastosowań, w tym ocenę potencjalnych terapii poprawiających regenerację kardiomiocytów lub badanie wpływu choroby serca na obrót kardiomiocytów i szybkość poliploidyzacji kardiomiocytów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,32 M sacharoza	Sigma	84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)	Sigma	T3253
5 mM CaCl2	Sigma	c5086
5 mM octan magnezu	sigma	M-5661
2,0 mM EDTA	Sigma	E5134
0,5 mM EGTA	Sigma	63779
1 mM DTT	Sigma	D0632
70 mM KCl	Sigma	P9541
10 mM MgCl2	Sigma	M8266
1,5 mM spermina	Sigma	85590
Isotyp królika IgG-ChIP Grade	abcam	abc7415
Królicze przeciwciało anty-PCM-1	Sigma	HPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H+L)	Filtry	Life technologies A-11070
70 μ m oraz 100 μ m	Fisher scientific	11597522, 11517532
Szklany dounce (40 ml) i tłuczek o dużym prześwicie	Sigma	D9188-1SET
EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna)	Life technologies	A10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Zestaw do badania cytometrii przepływowej	Technologie życia	C10634	Ten zestaw zawiera  odczynniki wymagane dla sekcji, bufor reakcyjny EdU,  Utrwalacz EdU, roztwór permeabilizacyjny na bazie saponin i odczynniki wymagane do koktajlu znakującego EdU.
CyStain DNA 2-etapowy	zestaw,Sysmex Partec	05 5005	Ten zestaw zawiera  odczynniki wymagane do znakowania DAPI (roztwór do barwienia DNA)
Homogenizator sondy, np. , TissueRuptor	Qiagen	9001273
TissueRuptor Sondy jednorazowe	Qiagen	990890
ultrawirówka	Sorvall
Facscanto II	BD Biosciences
, polipropylenowa. 38,5 ml, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A2153