Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.
Artykuł metodologiczny
Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chociaż przyjmuje się, że serce ma ograniczony potencjał do regeneracji kardiomiocytów po urazie i że niski poziom obrotu kardiomiocytów występuje podczas normalnego starzenia się, kwantyfikacja tych zdarzeń pozostaje wyzwaniem. Wynika to częściowo z rzadkości tego procesu i faktu, że wiele źródeł komórkowych przyczynia się do utrzymania mięśnia sercowego. Co więcej, duplikacja DNA w kardiomiocytach często prowadzi do powstania poliploidalnych kardiomiocytów i rzadko prowadzi do powstania nowych kardiomiocytów w wyniku podziału komórkowego. Aby dokładnie określić ilościowo obrót kardiomiocytów, niezbędne jest rozróżnienie tych procesów. Opisany tutaj protokół wykorzystuje długoterminowe znakowanie nukleozydów w celu znakowania wszystkich jąder, które powstały w wyniku replikacji DNA i jąder kardiomiocytów zidentyfikowanych przez wykorzystanie izolacji jąder i późniejszego znakowania immunologicznego PCM1. Razem pozwala to na dokładną i czułą identyfikację znakowania nukleozydów w populacji jąder kardiomiocytów. Ponadto znakowanie 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem i analiza ploidii jąder umożliwia odróżnienie jąder neo-kardiomiocytów od jąder, które zawierają nukleozyd podczas poliploidyzacji. Chociaż metoda ta nie może kontrolować binukleacji kardiomiocytów, umożliwia szybką i solidną ocenę ilościową jąder neokardiomiocytów przy jednoczesnym uwzględnieniu poliploidyzacji. Metoda ta ma szereg dalszych zastosowań, w tym ocenę potencjalnych terapii poprawiających regenerację kardiomiocytów lub badanie wpływu chorób serca na obrót kardiomiocytów i ploidalność. Technika ta jest również kompatybilna z dodatkowymi dalszymi technikami immunohistologicznymi, umożliwiając ilościowe określenie inkorporacji nukleozydów we wszystkich typach komórek serca.
Wprowadzenie
W ostatnich latach zgromadzono dowody podważające przypuszczenie, że serce jest organem terminalnie zróżnicowanym i postmitotycznym1,2. Jednakże ilościowe określenie tempa wymiany i regeneracji kardiomiocytów wciąż pozostaje wyzwaniem.
Trudności w dokładnej identyfikacji rzadkiego powstawania kardiomiocytów przy użyciu standardowych technik immunohistochemicznych są dobrze udokumentowane3. Ponadto źródło komórkowe generowania kardiomiocytów pozostaje niepewne, a dowody wskazują zarówno na udział proliferacji kardiomiocytów, jak i różnicowania komórek macierzystych4-6. W związku z tym zastosowanie modeli śledzenia linii komórkowej, które wymagają znajomości fenotypu progenitora kardiomiocytów, jest niemożliwe, a kwantyfikacja proliferacji w pojedynczej populacji, w tym w kardiomiocytach, jest niewłaściwa. Co więcej, kardiomiocyt ma potencjał do endoreplikacji bez kariokinezy (co prowadzi do powstania kardiomiocytu poliploidalnego) lub kariokinezy bez cytokinezy (co prowadzi do powstania kardiomiocytu dwojądrowego)7,8. Dokładna kwantyfikacja wymiany kardiomiocytów zależy od zdolności do odróżnienia tych zdarzeń od rzeczywistego powstawania nowych kardiomiocytów. Stwarza to specyficzne komplikacje, ponieważ replikacja DNA i ekspresja kinaz zależnych od cyklin w kardiomiocytach nie świadczą wyłącznie o rzeczywistym podziale komórkowym9,10.
Aby wspomóc ilościowe określenie generowania nowych kardiomiocytów, połączyliśmy uznaną technikę izolacji jąder oraz immunologiczne znakowanie materiału pericentriolarnego 1 (PCM1) w celu identyfikacji jąder kardiomiocytów, zgodnie z opisem Bergmann et al.7,1, z nowymi metodami długoterminowego znakowania DNA i analizy ploidalności. PCM-1 jest białkiem centrosomalnym, które gromadzi się na powierzchni jądra zróżnicowanych, niecyklicznych miocytów. Wcześniejsze badania wykazały, że przeciwciała przeciwko PCM-1 specyficznie znakują jądra kardiomiocytów7,1, w związku z czym PCM1 był wykorzystywany przez szereg niezależnych grup do identyfikacji kardiomiocytów1,12,13. Ponadto wykazaliśmy, że ekspresja PCM1 pokrywa się z genetycznie znakowanymi jądrami kardiomiocytów w transgenicznym modelu mysim TnT-cre14 (Rycina uzupełniająca 1).
Opisany tutaj protokół umożliwia dokładną i czułą identyfikację powstawania nowych jąder kardiomiocytów w sercu myszy, niezależnie od ich pochodzenia komórkowego (Rycyna 1A i B), jednocześnie wykluczając z analizy znakowanie nukleozydowe wynikające z poliploidyzacji (Rycina 1C i D). Chociaż metoda ta nie pozwala na kontrolę wielojądrzastego charakteru kardiomiocytów, umożliwia ona szybką i wiarygodną kwantyfikację nowych jąder kardiomiocytów, co jest niezbędne do dokładnego określenia tempa obrotu kardiomiocytów. Ponadto stanowi ona narzędzie do szybkiego przesiewu w celu oceny potencjalnych zmian w dynamice powstawania kardiomiocytów.
Podczas gdy znakowanie DNA zazwyczaj obejmuje zastosowanie 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU) jako analogu tymydyny, opisany tutaj protokół wykorzystuje test oparty na 5-etynyl-2'-deoksyurydynie (EdU), ponieważ wymaga on mniej etapów przetwarzania, co pozwala na szybszą analizę, oraz nie wymaga denaturacji DNA do immunodetekcji, co czyni go kompatybilnym z innymi protokołami immunobarwienia i tym samym zwiększa potencjalne zastosowania tej metody w dalszych analizach.
Rycina 1: Ciągłe pulsacyjne znakowanie EdU identyfikuje nowe kardiomiocyty niezależnie od ich komórek progenitorowych. (AEdU zostaje wbudowane w DNA kardiomiocytów podczas podziału komórkowego. Proliferacja w populacji kardiomiocytów doprowadzi do zwiększenia liczby lub zastąpienia kardiomiocytów i stanowi zatem produktywną syntezę DNA (przyczynia się do utrzymania i regeneracji tkanki).BEdU wbudowuje się w DNA komórek progenitorowych serca podczas podziału komórkowego. Zostanie on zachowany w komórce podczas różnicowania w kierunku linii kardiomiocytów. Różnicowanie tych komórek macierzystych doprowadzi również do zwiększenia liczby kardiomiocytów, a tym samym przyczyni się do utrzymania i regeneracji tkanki.C) Kardiomiocyty mają potencjał do przechodzenia „nieprodukcyjnej” replikacji DNA, co prowadzi do zwiększenia ploidalności kardiomiocytów; zjawisko to wiąże się z hipertrofią kardiomiocytów oraz przebudową mięśnia sercowego, ale nie prowadzi do zastąpienia utraconych kardiomiocytów. Proces poliploidyzacji różni się od binukleacji tym, że w jego wyniku powstaje kardiomiocyt z pojedynczym jądrem, które zawiera cztery lub więcej zestawów dwóch homologicznych chromosomów (>2N). (DPo ciągłym podaniu impulsów EdU, niniejszy protokół opisuje izolację jąder komórkowych oraz identyfikację jąder kardiomiocytów na podstawie ekspresji PCM1, co umożliwia ilościowe określenie zarówno ploidii kardiomiocytów, jak i wbudowania EdU. Ekspresję PCM1 oraz wbudowanie EdU wykrywa się za pomocą cytometrii przepływowej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Protokół
Prace z udziałem zwierząt zostały autoryzowane i zatwierdzone przez komisję etyczną Newcastle University. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były wykonywane zgodnie z wytycznymi Dyrektywy 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.
1. Podawanie EdU
- Rozpuścić EdU w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% w/v) do końcowego stężenia 12,5 mg/ml.
- Podgrzać roztwór do 40 °C i wymieszać w wortexie w celu całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać odpowiednią ilość roztworu EdU/soli w temperaturze 4 °C, wystarczającą do wstrzyknięcia wszystkim myszom biorącym udział w badaniu, przy założeniu 6 codziennych iniekcji.
Uwaga: Zazwyczaj dla każdej grupy eksperymentalnej wymaganych jest ponad 6 myszy. Jednakże dla niezależnych badań należy przeprowadzić obliczenia mocy statystycznej.
- Podgrzać roztwór do 40 °C i wymieszać w wortexie w celu całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać odpowiednią ilość roztworu EdU/soli w temperaturze 4 °C, wystarczającą do wstrzyknięcia wszystkim myszom biorącym udział w badaniu, przy założeniu 6 codziennych iniekcji.
- Zważyć poszczególne myszy. Obliczyć objętość wymaganą do podania 100 µg/g roztworu EdU/soli fizjologicznej dla każdej myszy (8 µl roztworu stokowego EdU na g).
- Nabrać odpowiednią objętość roztworu EdU/soli do strzykawki insulinowej z igłą 25 G.
- Wykonać wtryskiwanie dombrzeżne (i.p.), obchodząc się z myszami zgodnie z zatwierdzonymi technikami Home Office.
- Umieścić mysz na pokrywie klatki. Delikatnie odciągnąć podstawę ogona i mocno chwycić mysz za kark.
- Odsłonić brzuch do iniekcji, trzymając mysz palcem wskazującym i kciukiem w pobliżu podstawy głowy i odchylając głowę zwierzęcia do tyłu w stronę podłogi.
- Przetrzeć brzuch 70% roztworem alkoholu. Zlokalizować linię środkową oraz prawy dolny kwadrant ciała zwierzęcia. Wstrzyknąć roztwór EdU/soli w prawy dolny kwadrant.
- Wstrzyknąć myszom roztwór EdU/soli i zapisać godzinę wykonania zabiegu.
- Powtórzyć kroki od 1.2 do 1.4 o tej samej porze dnia przez 6 kolejnych dni.
Uwaga: Ponieważ do ustawienia bramkowania w analizie cytometrycznej wymagana jest kontrola negatywna EdU, należy wstrzyknąć dodatkowej myszy (dobranej pod względem wieku, płci i grupy eksperymentalnej) równą objętość soli fizjologicznej bez EdU. Zapewni to wymaganą kontrolę (kontrola bez EdU). Kontrola ta powinna być włączona do każdego badania, aby uwzględnić różnice w partiach odczynników oraz konfiguracji cytometru.
2. Pobieranie serc
- W 24 h po 6tej iniekcji EdU uśmiercić myszy poprzez zwichnięcie szyi (lub inną metodą zatwierdzoną przez Schedule 1 Home Office).
- Umieścić uśmiercone zwierzę w pozycji na plecach i wykonać nacięcie skóry od środka brzucha do przepony za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Przeciąć przeponę, a następnie, odsuwając mostek od jamy ciała, przeciąć obustronnie w celu odsłonięcia serca.
- Lekko unieść serce i przeciąć główne naczynia krwionośne odpływowe, aby wyciąć serce z jamy klatki piersiowej.
- Każde serce natychmiast umieścić w oddzielnej probówce do wirowania o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS schłodzonego do 4 °C.
- Przenieść serca do oddzielnych szalek Petriego o średnicy 10 cm; za pomocą skalpela przeciąć każde serce na pół w orientacji strzałkowej i wypłukać serce, delikatnie ściskając je pęsetą. Następnie wymienić PBS, aby usunąć jak najwięcej krwi. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
- Obie części każdego serca umieścić w tej samej oddzielnej probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml.
- Przejść do kroku 3 lub alternatywnie przechowywać preparaty w temperaturze -80 °C, zgodnie z opisem w krokach 2.9 i 2.10.
- Za pomocą igły 25 G wykonać niewielki otwór w zakrętce probówki do mikrowirowania, aby zapobiec jej otwarciu wskutek rozprężania się gazów podczas przetwarzania serca.
- Oznaczyć każdą probówkę do mikrowirowania i umieścić w pojemniku z ciekłym azotem w celu zamrożenia.
3. Dysocjacja jąder i znakowanie jąder kardiomiocytów
Uwaga: Ta metoda dysocjacji jąder i znakowania jąder kardiomiocytów została zaadaptowana z pracy Bergmann et al.1 Przeprowadź tę procedurę dla wszystkich próbek wstrzykniętych EdU oraz dla negatywnej kontroli wstrzykniętej solą fizjologiczną (kontrola bez EdU). Przepis roztworów niezbędnych do wykonania tych kroków znajduje się w Tabeli 1.
- Dla każdego serca przeznaczonego do analizy wlej 36 ml 1% roztworu BSA/PBS do probówki do ultrawirówki, inkubuj przez 30 min, odlej roztwór, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
Uwaga: Probówka ta zostanie wykorzystana w kroku 3.6. - Umieść poszczególne zamrożone serca na naczyniu 10 mm w lodzie i posiekaj skalpelem, pozwalając sercom rozmrozić się w trakcie procesu siekania.
- Przenieś posiekane serca do 15 ml buforu do lizy komórek (Cell Lysis Buffer) w probówce wiriówkowej 50 ml i homogenizuj homogenizatorem probe przez 15 s przy 25 0 rpm w temperaturze pokojowej.
- Dodaj kolejne 15 ml buforu do lizy komórek do probówki wiriówkowej i przelej do homogenizatora Dounce o pojemności 40 ml z tłuczkiem o dużym prześwicie. Wykonaj 10 ruchów tłuczkiem, a następnie przefiltruj zawartość przez sitko komórkowe 10 µm, a następnie 40 µm do probówki wiriówkowej 50 ml.
- Wiruj przez 10 min przy 70 x g w temperaturze 4 °C i oddziel supernatant.
- Resuspenduj osad jąder w 25 ml roztworu gradientu sacharozy i nanieś roztwór zawierający jądra komórkowe na warstwę 10 ml świeżego roztworu gradientu sacharozy w probówce do ultrawirówki przygotowanej w punkcie 3.1.
- Wiruj przy 13 0 x g przez 1 h w temperaturze 4 °C, używając rotora z kątowo-wychylnymi probówkami.
- Po wirowaniu odlej supernatant i resuspenduj osad jąder w 1 30 µl buforu do przechowywania jąder w probówce mikrocentryfugacyjnej 1,5 ml i oznacz ją jako PCM1.
- Pobierz 300 µl zawiesiny do nowej probówki mikrocentryfugacyjnej i dodaj do 700 µl świeżego buforu do przechowywania jąder. Oznacz tę probówkę jako kontrola ISO.
- Dodaj przeciwciało anty-PCM1 do końcowego stężenia 8 µg/ml do probówki mikrocentryfugacyjnej oznaczonej jako PCM1 oraz dodaj przeciwciało kontrolne izotypowe Rabbit IgG w stężeniu 8 µg/ml do probówki mikrocentryfugacyjnej oznaczonej jako kontrola ISO.
- Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji wiruj przy 70 x g przez 10 min, odlej supernatant, zastąp go 1 ml świeżego buforu do przechowywania jąder, resuspenduj i ponownie wiruj przez 10 min przy 700 x g. Odlej supernatant i zastąp go 1 ml świeżego buforu do przechowywania jąder.
- Dodaj 1 µl fragmentu F(ab')2 przeciwciała Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (FITC lub równoważny zielony barwnik fluorescencyjny), aby uzyskać końcowe stężenie 2 µg/ml.
Uwaga: Zastosowanie przeciwciała we fragmencie F(ab')2 zmniejsza ryzyko niespecyficznego znakowania komórek odpornościowych, w tym makrofagów i limfocytów B. - Owiń probówki folią aluminiową, aby chronić je przed światłem, i inkubuj przez 1 h w temperaturze 4 °C.
4. Wykrywanie wbudowania EdU
- Rozcieńczyć 10x skoncentrowany bufor reakcyjny EdU w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną.
- Odwirować zawiesiny jąder opisane jako PCM-1 oraz kontrola ISO z prędkością 70 x g przez 10 min, odlać supernatant i ponownie zawiesić osad jąder w 1 ml roztworu 1% BSA/PBS. Przespłukać osad jąder dwukrotnie.
- Po ostatnim płukaniu odlać supernatant i zastąpić go 10 µl utrwalacza EdU.
- Owinąć probówki folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Przespłukać próbki dwukrotnie 1 ml roztworu 1% BSA/PBS, odwirować z prędkością 70 x g i inkubować z 1x roztworem permeabilizującym opartym na saponinie w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Przygotować 1x koktajl znakujący EdU (Tabela 2). W celu uwzględnienia kontroli bez EdU wymagane będzie przygotowanie minimum 2 reakcji.
- Dodać 50 µl 1x koktajlu znakującego EdU bezpośrednio do każdej próbki zawierającej jądra w 10 µl 1x roztworu permeabilizującego opartego na saponinie i inkubować w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przez 30 min.
- Odwirować z prędkością 700 x g, ponownie zawiesić w 1 ml 1% BSA/PBS i powtórzyć ten krok jeszcze dwukrotnie.
- Odwirować z prędkością 70 x g, odlać supernatant i zastąpić go 40 µl roztworu do barwienia DNA (patrz Tabela Materiałów).
| Nazwa odczynnika |
| 1. Bufor do lizy komórek |
| 0,32 M sacharozy |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl22 |
| 5 mM octanu magnezu |
| 2,0 mM EDTA |
| 0,5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2. Roztwór gradientu sacharozy |
| 2,1 M sacharozy |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM octanu magnezu |
| 1 mM DTT |
| 3. Bufor do przechowywania jąder (NSB) |
| 0,4 M sacharozy |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl22 |
| 1,5 mM sperminy |
Tabela 1: Składniki buforu do izolacji jąder. Receptura wszystkich buforów użytych w sekcji 3 protokołu (Dysocjacja jąder i znakowanie jąder kardiomiocytów).
5. Analiza cytometryczna
Uwaga: Przeprowadź cytometrię przepływową na wyizolowanych jądrach zgodnie z wcześniejszym opisem7,1,15.
- W pierwszej kolejności należy utworzyć wykres opisujący rozproszenie światła w przód (FSC) i rozproszenie światła boczne (SSC), aby umożliwić odróżnienie jąder od zanieczyszczeń (Rycina 2A).
- Należy utworzyć wykres w celu odróżnienia pojedynczych jąder od agregatów (Rycina 2B), nanosząc pole (area) sygnału 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (3-405/450/50-A) względem wysokości (height) (3-405/450/50-H). Należy upewnić się, że sygnał 3-405/450/50-A jest zbierany w skali liniowej, aby umożliwić prawidłowe oznaczenie zawartości DNA.
- Należy utworzyć wykres opisujący 48/535/30-A (PCM-1) względem SSC i wyświetlić tylko zdarzenia z bramki singletów utworzonej w punkcie 5.2, aby ocenić ekspresję PCM-1 w populacji singletów.
- Należy przeanalizować próbkę kontrolną izotypową w celu ustalenia bramki dla sygnału PCM-1 dodatniego (Rycina 2C). Należy przeanalizować niewielką ilość próbki znakowanej PCM1, aby zweryfikować populację wykazującą ekspresję PCM1 oraz położenie bramki.
- Należy utworzyć wykres opisujący SSC-A względem 405/450/50-A (do detekcji DAPI). Na tym wykresie należy wyświetlić tylko pojedyncze jądra wykazujące ekspresję PCM1, korzystając z bramek utworzonych w punkcie 5.3. Wykres ten należy wykorzystać do stworzenia dodatkowej bramki hierarchicznej zawierającej tylko jądra 2N (Rycina 2D).
- Należy utworzyć wykres opisujący 488/535/30-A względem 1-63/60/20-A, aby umożliwić identyfikację znakowania EdU w populacji kardiomiocytów wykazujących ekspresję PCM1. Należy wyświetlić tylko jądra, które są singletami, PCM1+ i 2N, stosując powyższe bramkowanie.
- Należy przeanalizować próbkę serca z kontroli bez EdU, aby ustawić bramkę dla sygnału EdU dodatniego (Rycina 2E). Należy utworzyć odpowiednią bramkę dla komórek EdU+.
- Należy zarejestrować i ilościowo określić pojedyncze, wykazujące ekspresję PCM-1 jądra 2N, które włączyły EdU.
- Należy obliczyć tę populację jako procent całkowitej liczby singletowych jąder PCM1+. Pozwoli to określić wskaźnik generowania jąder neo-kardiomiocytów podczas 7-dniowego okresu podawania EdU jako procent całkowitej liczby jąder kardiomiocytów.
Uwaga: Ponieważ wiązanie DAPI z DNA jest stechiometryczne, intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do ilości DNA. Ploidie należy określić na podstawie intensywności sygnału 405/450/50-A, zgodnie z wcześniejszym opisem7. - W celu oceny ploidii w całkowitej populacji kardiomiocytów należy użyć wykresu ustalonego w punkcie 5.5 oraz strategii bramkowania opartej na stężeniu DNA7.
Rysunek 2: Strategia bramowania w celu ilościowego oznaczenia wbudowania EdU w kardiomiocyty oraz ich ploidii. (AJądra komórkowe są odróżniane od zanieczyszczeń na podstawie rozproszenia światła w przód (FSC) i rozproszenia światła pod kątem (SSC).B) Tworzy się bramkę liniową i identyfikuje populację pojedynczych jąder na podstawie znakowania DAPI oraz sygnału wysokości względem powierzchni dla kanału 405/450/50. (CBramkowanie fluorescencyjne umożliwia oddzielenie jąder kardiomiocytów (PCM-1-dodatnich) od jąder niebędących kardiomiocytami (PCM-1-ujemnych) z tkanki serca.D) Intensywność sygnału DAPI jest wykorzystywana do oznaczenia stężenia DNA, a tym samym ploidalności jąder w populacji kardiomiocytów PCM1+. U myszy >80% jąder kardiomiocytów jest diploidalnych (2n).EGating fluorescencyjny pozwala na oddzielenie jąder kardiomiocytów 2N, które włączyły EdU (PCM+/EDU+ = 0,9%), od kardiomiocytów 2N, które nie włączyły EdU (PCM+EDU-). Wszystkie kroki zostały szczegółowo opisane w protokole 5.0. Przykład przedstawiono dla mdx.-/y myszy na tle genetycznym C57/BL10. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wyniki
Metoda ta pozwala na ilościowe określenie zwiększonej inkorporacji EdU wynikającej z podziałów jąder kardiomiocytów, przy jednoczesnej kontroli zwiększonej poliploidyzacji. Wykorzystując test oparty na BrdU, wykazaliśmy wcześniej, że serce ssaków reaguje na chroniczną utratę kardiomiocytów w modelu myszy mdx z dystrofią mięśniową Duchenne poprzez regenerację nowych kardiomiocytów. Opisane tutaj metody zostały wykorzystane do dalszej walidacji naszych opublikowanych wyników oraz do zademonstrowania użyteczności protokołu. Zgodnie z opisanym protokołem, dorosłe (12-tygodniowe) myszy mdx oraz kontrolne bl10 otrzymywały codziennie jeden zastrzyk EdU przez 7 dni, co według wcześniejszych doniesień pozwala na analizę statystyczną między grupami eksperymentalnymi5,13. Analiza immunohistologiczna serc po podaniu EdU wykazuje obecność kardiomiocytów wykazujących ekspresję PCM1, które włączyły EdU (Rysunek 3A). Jednak dane uzyskane metodami immunohistologicznymi mogą być błędnie zinterpretowane, ponieważ inne typy komórek, które włączyły EdU, mogą zostać błędnie zidentyfikowane jako kardiomiocyty. Przykład tego zjawiska przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1A i B. Co więcej, metody immunohistologiczne nie odróżniają poliploidyzacji od podziału jądra. Analiza cytometrii przepływowej szczegółowo opisana w tym protokole umożliwia szybkie ilościowe określenie podziałów jąder kardiomiocytów u myszy mdx i myszy kontrolnych, przy jednoczesnym wykluczeniu komórek, które włączyły EdU w wyniku poliploidyzacji. Podobnie jak w wcześniej opublikowanych danych13, analiza wykazała wzrost tempa generowania jąder neo-kardiomiocytów w sercach myszy mdx w porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku (1,2% versus 0,17%; Rysunek 3B i C).
Rysunek 3: Ilościowe oznaczenie kardiomiocytów znakowanych EdU u osobników typu dzikiego i mdx serca (A) Obraz projekcji stosu Z wykonany z 40 µm grube przekroje mdx serca. Jądra kardiomiocytów wykazujące ekspresję PCM-1 (zielone), które włączyły EdU (czerwone). Żółta strzałka wskazuje kardiomiocyty znakowane EdU. i oraz ii wskazują poszczególne kardiomiocyty znakowane EdU pokazane w płaszczyźnie Z. Jądra znakowane DAPI (niebieskie) (B i C) Cytometria przepływowa wyizolowanych jąder komórkowych przedstawiająca reprezentatywne wykresy dla 12–13 tygodniowych myszy typu dzikiego (C57/BL10) oraz mdx myszy (mdx)-/y na tle szczepu C57/BL10). (B) Histogram przedstawiający intensywność barwienia DAPI oraz rozróżnienie między 2N a >jądra 2N. (C) Wykresy obrazujące wbudowanie EdU w populacji jąder kardiomiocytów 2N po analizie zgodnie ze szczegółami opisanymi w niniejszym protokole. U wszystkich myszy EdU podawano przez 1 tydzień, poczynając od 12. tygodnia życia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina uzupełniająca 1: PCM-1 jest specyficznym markerem jąder kardiomiocytów.Zgodnie z opisanym protokołem jądra wyizolowano z podwójnie transgenicznej myszy uzyskanej poprzez skrzyżowanie myszy TNT-cre14 z linią reporterową wrażliwą na cre ROSAnT/nG16. U uzyskanej myszy aktywacja cre pod kontrolą promotora troponiny T (TNT) prowadzi do nieodwracalnej ekspresji GFP, która lokalizuje się w jądrach. Jądra znakowane kontrolą izotypową (Iso) wykazują zdolność do identyfikacji populacji jąder kardiomiocytów wykazujących ekspresję GFP (48/530/30-A). Znakowanie jąder przeciwciałem anty-PCM1 (przeciwciało wtórne wykrywane przez 63-60/20-A) wykazuje korelację ekspresji PCM1 z populacją jąder kardiomiocytów wykazujących ekspresję GFP. W tym przykładzie 98,8% jąder kardiomiocytów, zidentyfikowanych na podstawie aktywności promotora TNT, jest znakowanych przeciwciałem PCM1. Kliknij tutaj, aby pobrać Rycinię uzupełniającą 1.
Rycina uzupełniająca 2: Trudności w ilościowym określaniu odnowy kardiomiocytów za pomocą technik immunohistologicznych. (A) Obraz 2D przedstawia dwa jądra kardiomiocytów wykazujące ekspresję PCM-1 (zielone), które wydają się być również znakowane EdU (czerwone). Żółte strzałki wskazują komórki, które sprawiają wrażenie kardiomiocytów, które włączyły EdU. Wynika to z pozornej kolokalizacji ekspresji PCM1 i znakowania EdU podczas wizualizacji przy użyciu obrazowania dwuwymiarowego. (B) Projekcja trójwymiarowa tego obrazu wykazuje, że komórki znakowane EdU nie są kardiomiocytami, lecz komórkami niebędącymi kardiomiocytami, które znajdują się nad jądrami kardiomiocytów wykazującymi ekspresję PCM1. Do eksperymentów wykorzystano myszy C57/BL10 w wieku 12 tygodni. Kliknij tutaj, aby pobrać Rycinę uzupełniającą 2A. Kliknij tutaj, aby pobrać Rycinę uzupełniającą 2B.
| Składniki reakcji | Liczba reakcji | |
| 2 | 5 | |
| PBS (bufor fosforanowy z solą) | 875 µl | 2,19 ml |
| Środek chroniący miedź | 20 µl | 50 µl |
| Fluorescencyjny barwnik picolyloazyd | 5 µl | 12.5 µl |
| Rozcieńczony bufor reakcyjny przygotowany w punkcie 4.1 | 100 µl | 250 µl |
| Całkowita objętość reakcji | 1 ml | 2,5 ml |
Tabela 2: Składniki koktajlu EdU. Przepis na koktajl do znakowania EdU wymagany w sekcji 4 protokołu (Wykrywanie wbudowania EdU).
Dyskusja
Aby dokładnie określić ilościowo obrót i regenerację kardiomiocytów, testy muszą rozróżniać między prawdziwym generowaniem kardiomiocytów a nieproduktywnym podziałem DNA. Wiele badań nadal po prostu ignoruje te nieproduktywne zdarzenia, określając ilościowo proliferację kardiomiocytów wyłącznie poprzez ekspresję kinezy cykliny i markerów cyklu komórkowego. Do tej pory jedna metoda, która pozwala na dokładne ilościowe określenie obrotu kardiomiocytów przy jednoczesnej kontroli tych nieproduktywnych zdarzeń, pozostaje aluzyjna. W szczególności trudno jest wyjaśnić poliploidyzację kardiomiocytów, która przyczynia się do ~65% replikacji DNA kardiomiocytów13. Dlatego, aby pomóc w dokładnej kwantyfikacji wytwarzania kardiomiocytów, opracowaliśmy protokół, który pozwala na solidną kwantyfikację szybkości jąder neo kardiomiocytów, wykluczając jednocześnie replikację DNA, która powoduje zwiększoną ploidalność. Chociaż protokół ten nie może rozróżnić między wytwarzaniem neo-kardiomiocytów a dwunukleacją kardiomiocytów, można go szybko i dokładnie obliczyć górną granicę (z uwzględnieniem ploidalności) generacji kardiomiocytów. Protokół ten stanowi zatem narzędzie przesiewowe do oceny potencjalnych zmian w tempie wytwarzania kardiomiocytów i poliploidyzacji w modelach chorób lub do oceny potencjalnej skuteczności terapii. Po zidentyfikowaniu zmian w tempie wytwarzania jąder neo-kardiomiocytów za pomocą tego protokołu, można wykorzystać kolejne badania w celu ustalenia, czy jest to spowodowane zmianami w wytwarzaniu kardiomiocytów liczby zarodków kardiomiocytów, jak opisano wcześniej2,13,17,18. Obejmują one wykorzystanie histologicznej kwantyfikacji dynamiki zarodkowania kardiomiocytów w okresie tętna lub analizy skrawków tkanek uzyskanych od zwierząt pulsujących EdU w celu porównania inkorporacji EdU w populacjach kardiomiocytów jednojądrowych i wielojądrowych.
Ze względu na niski poziom obrotu kardiomiocytów, protokół ten wykorzystuje wielokrotne wstrzyknięcia EdU w ciągu 7 dni. Pozwala to również na "ściganie" wszystkich potencjalnych komórkowych źródeł wytwarzania kardiomiocytów i pozwala na ilościowe określenie skumulowanego wytwarzania jąder kardiomiocytów w tym okresie. W zależności od badania, ten przedział czasowy może być dostosowany do przewidywanych poziomów wytwarzania kardiomiocytów. W celu dokładnego ilościowego określenia inkorporacji EdU w jądrach kardiomiocytów konieczne jest, aby nie było niespecyficznego znakowania jąder przeciwciałem drugorzędowym używanym do wykrywania reaktywności PCM-1. W związku z tym rozsądne byłoby przeprowadzenie dodatkowych doświadczeń z miareczkowaniem przeciwciał drugorzędowych w celu optymalizacji tego aspektu protokołu, w szczególności jeżeli ma być użyte przeciwciało drugorzędowe inne niż sugerowane w niniejszym protokole. Opisany tutaj protokół wykorzystuje ekspresję PCM-1 do identyfikacji jąder kardiomiocytów. Chociaż jest to uznany marker kardiomiocytów, do walidacji danych można użyć alternatywnych markerów; należą do nich przeciwciała specyficzne dla sercowej troponiny T, która została zidentyfikowana jako częściowo zlokalizowana w jądrach kardiomiocytów1. Podobnie, alternatywne białka zlokalizowane jądrowo mogą być wykorzystane do identyfikacji i ilościowego określenia inkorporacji EdU w populacjach jąder innych niż kardiomiocyty. Ważne jest, aby wszystkie jądra kardiomiocytów, które aktywnie przechodzą mitozę, zostały wyłączone z analizy, ponieważ los tej syntezy DNA jest nieznany i może skutkować podziałem komórek lub zwiększoną ploidalnością. PCM1 ulega rozkładowi podczas fazy M cyklu komórkowego, dlatego kardiomiocyty przechodzące mitozę nie zostaną zidentyfikowane na podstawie ekspresji PCM1. Ponadto wszystkie jądra w fazie s cyklu komórkowego powinny być wyłączone z dalszej analizy. Można to osiągnąć poprzez bramkowanie wszystkich jąder o intensywności DAPI powyżej populacji 2N, w tym tych o intensywności DAPI między populacjami 2N i 4N.
Chociaż coraz częściej przyjmuje się, że serce ma zdolność do zastępowania kardiomiocytów podczas normalnego starzenia się i po ostrym urazie, źródło i stopień tego potencjału pozostaje kontrowersyjne. Ponadto stwierdzono rozbieżne tempo obrotu kardiomiocytów1,7,20-22. Może to częściowo wynikać z trudności w dokładnej identyfikacji i ilościowym określeniu generacji neokardiomiocytów19. Do tej pory większość badań opierała się wyłącznie na analizie histologicznej i identyfikacji kardiomiocytów poprzez ekspresję białek cytoplazmatycznych, w tym białek sarkomeru, w celu ilościowego określenia obrotu i odnowy kardiomiocytów2,4,23,24. Zastosowanie tych metod do wykrywania ekspresji markerów proliferacji lub, jak wykazano tutaj, włączenie analogów tymidyny może łatwo spowodować błędną identyfikację innych typów komórek serca jako kardiomiocytów. Chociaż zastosowanie obrazowania konfokalnego 3D może pomóc w złagodzeniu tych problemów, metody te są drogie i czasochłonne. Co ciekawe, opisany tutaj protokół pokazuje, że wytwarzanie jąder neokardiomiocytów zachodzi w tempie 0,17% tygodniowo. Jest to zgodne z innymi badaniami opartymi na cytometrii przepływowej, które wykazały tygodniowe wskaźniki rotacji do 0,13%5. Chociaż kuszące jest ekstrapolowanie rocznych wskaźników rotacji na podstawie tych danych, podobnie jak w poprzednich badaniach2,5,25,26, jest to niewłaściwe, ponieważ wskaźniki rotacji są dynamiczne w ciągu życia zwierzęcia13.
Metoda ta ma szereg potencjalnych zastosowań, w tym ocenę potencjalnych terapii poprawiających regenerację kardiomiocytów lub badanie wpływu choroby serca na obrót kardiomiocytów i szybkość poliploidyzacji kardiomiocytów.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez British Heart Foundation, grant projektowy PG/13/69/30454.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,32 M sacharoza | Sigma | 84100 | |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
| 5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
| 5 mM octan magnezu | sigma | M-5661 | |
| 2,0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
| 0,5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
| 1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
| 70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
| 10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 1,5 mM spermina | Sigma | 85590 | |
| Isotyp królika IgG-ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
| Królicze przeciwciało anty-PCM-1 | Sigma | HPA023374 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H+L) | Filtry | Life technologies A-11070 | |
| 70 μ m oraz 100 μ m | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
| Szklany dounce (40 ml) i tłuczek o dużym prześwicie | Sigma | D9188-1SET | |
| EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna) | Life technologies | A10044 | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Zestaw do badania cytometrii przepływowej | Technologie życia | C10634 | Ten zestaw zawiera odczynniki wymagane dla sekcji, bufor reakcyjny EdU, Utrwalacz EdU, roztwór permeabilizacyjny na bazie saponin i odczynniki wymagane do koktajlu znakującego EdU. |
| CyStain DNA 2-etapowy | zestaw,Sysmex Partec | 05 5005 | Ten zestaw zawiera odczynniki wymagane do znakowania DAPI (roztwór do barwienia DNA) |
| Homogenizator sondy, np. , TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
| TissueRuptor Sondy jednorazowe | Qiagen | 990890 | |
| ultrawirówka | Sorvall | ||
| Facscanto II | BD Biosciences | ||
| , polipropylenowa. 38,5 ml, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | A2153 |
Bibliografia
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. Challenges measuring cardiomyocyte renewal. Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).
- Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).
- Malliaras, K., et al. Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart. EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).
- Hsieh, P. C., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, 970-974 (2007).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).
- Carmena, M., Earnshaw, W. C. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. , e4205(2012).
- Gilsbach, R., et al. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun. 5, 5288(2014).
- Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Bergmann, O., et al. Cardiomyocyte renewal in humans. Circ Res. 110, author reply e19-21 e17-e18 (2012).
- Prigge, J. R., et al. Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei. Mamm Genome. , (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157, 795-807 (2014).
- Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1. Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).
- Kajstura, J., et al. Myocyte turnover in the aging human heart. Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).
- Kajstura, J., et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart. Circ Res. 107, 305-315 (2010).
- Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei. Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).
- Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. Cardiac regeneration. J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).
- Gonzalez-Valdes, I., et al. Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence. Nat Commun. 6, 6473(2015).
- Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523, 226-230 (2015).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).
Przedruki i uprawnienia
