Method Article

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

DOI:

10.3791/54005

⸱

June 14th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 4Cardiovascular Institute, Maine Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazana tutaj jest metoda wizualizacji ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej w zdecelularyzowanych tkankach serca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwłóknienie jest składnikiem wszystkich form chorób serca, niezależnie od ich etiologii, i chociaż poczyniono znaczne postępy w dziedzinie biologii macierzy serca, nadal istnieją poważne luki związane z tym, jak powstaje matryca, jak różni się fizjologiczna i patologiczna przebudowa, a co najważniejsze, jak można manipulować dynamiką matrycy, aby przyspieszyć gojenie i zahamować zwłóknienie. Obecnie nie ma możliwości leczenia, które kontrolowałoby, zapobiegało lub odwracało zwłóknienie serca. Jednym z powodów jest prawdopodobnie sama złożoność tworzenia blizn sercowych, takich jak te, które występują po zawale mięśnia sercowego, aby natychmiast zastąpić martwe lub umierające kardiomiocyty. Sama macierz zewnątrzkomórkowa uczestniczy w przebudowie poprzez aktywację komórek rezydentnych, a także pomagając w kierowaniu komórek naciekających do nieistniejącej zmiany. Macierz jest również swego rodzaju skrytką do przechowywania białek matrikomórkowych, które są kluczowe dla prawidłowego obrotu macierzy, a także sygnalizacji zwłóknieniowej. Dodatkowo wykazano, że matryca odgrywa elektromechaniczną rolę w tkance serca. Większość technik oceny zwłóknienia nie ma charakteru jakościowego, ale raczej dostarcza wyników ilościowych, które są przydatne do porównywania dwóch grup, ale nie dostarczają informacji związanych z podstawową strukturą macierzy. Wyróżniono tutaj technikę wizualizacji ultrastruktury macierzy serca. Skaningowa mikroskopia elektronowa zdecelularizowanej tkanki serca ujawnia uderzające różnice w strukturze, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte przy użyciu tradycyjnych metod badań ilościowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwłóknienie zakłóca normalną sieć kolagenową mięśnia sercowego, która jest krytyczna dla normalnych funkcji mechanistycznych kardiomiocytów 1,2, jak również dla komunikacji międzykomórkowej, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i przeżycia komórek 3. Rozwój zwłóknienia jest głównym czynnikiem determinującym czynność serca, a zwłóknieniowa przebudowa śródmiąższu serca wynikająca z różnych etiologii prowadzi do zwiększonej sztywności lewej komory i dysfunkcji rozkurczowej 4. Zwłóknienie mięśnia sercowego może również prowadzić do arytmii i niezależnie od tego, czy postęp przebudowy zwłóknienia jest zjawiskiem ogólnym, czy miejscowym, jest silnie związany ze złym rokowaniem u pacjentów z kardiomiopatią niedokrwienną i nieniedokrwienną 5. Podobnie, brak zwłóknienia mięśnia sercowego jest silnym predyktorem powrotu do funkcji komór i długoterminowego przeżycia 6.

Cechą charakterystyczną zwłóknienia jest odkładanie się nadmiaru kolagenu, który ma wytrzymałość na rozciąganie stali 7 i może niekorzystnie wpływać na funkcję kardiomiocytów na wielu poziomach. Siły mechaniczne wynikające z nadmiernie kolagenowej macierzy mogą prowadzić do zaniku kardiomiocytów 8,9, biernej sztywności tkanek 10, sztywności mięśnia sercowego wywołanej skurczem tonicznym 11-13 i zmniejszonego dostarczania tlenu do pozostałej populacji kardiomiocytów. Sprzężenie połączeń szczelinowych kardiomiocytów i mięśni może również upośledzać charakterystykę elektryczną serca, stwarzając większe ryzyko rozwoju arytmii 14-16. Zwłóknienie okołonaczyniowe zmienia reaktywność naczynioruchową śródściennych tętnic wieńcowych i tętniczek 17 i przyczynia się do zwężenia światła, które zmniejsza dopływ tlenu, a tym samym przeżycie kardiomiocytów 17-22. Patogenna przebudowa zwłóknieniowa i elektryczna, pochodząca z początkowego miejsca uszkodzenia niedokrwiennego lub nierównowagi energetycznej, nieuchronnie postępuje do niewydolności serca.

Martwica kardiomiocytów inicjuje reakcję zwłóknieniową, a następująca po niej niekorzystna przebudowa zwłóknienia może wystąpić niezależnie od etiologii. Znalezienie sposobu kontrolowania zwłóknienia serca byłoby klinicznie korzystne w leczeniu kardiomiopatii niedokrwiennych i idiopatycznych, choroby nadciśnieniowej serca, kardiomiopatii przerostowej, wad zastawkowych serca i dystrofinopatii 23-42. Niezależnie od tego, jak rozpoczyna się proces choroby zwłóknieniowej, rozpuszczalne czynniki profibrotyczne mogą przenikać przez przestrzeń śródmiąższową i prowokować aktywację fibroblastów śródmiąższowych i przybyszowych w miejscach odległych od początkowej blizny zwłóknieniowej, tworząc efekt kaskadowy, który ostatecznie prowadzi do niewydolności serca. Optymalnym scenariuszem byłoby wykorzystanie procesu fibrylogennego za pomocą ukierunkowanego środka terapeutycznego, który może być stosowany podczas kompensacyjnego etapu przerostowego kardiomiopatii, zanim dojdzie do niewydolności pompy skurczowej, rozkurczowej niewydolności serca lub innych końcowych etapów. Ostatecznym celem byłoby odwrócenie zwłóknienia, aby martwe kardiomiocyty mogły zostać zastąpione, a funkcja serca całkowicie przywrócona.

Znaczenie matrycy jest szeroko rozumiane, jednak metody badania matrycy ograniczają się głównie do ilościowych pomiarów głównych składników strukturalnych, zwłaszcza kolagenu, oraz względnych poziomów różnych białek macierzy i komórek macierzy. Protokół ten podkreśla rzadko stosowaną technikę, która jest przydatna do oceny różnic jakościowych w macierzy serca. Technika ta została ostatnio wykorzystana do porównania i skontrastowania fundamentalnych różnic w matrycach serca z różnych etiologii chorób serca (u ludzkich eksplantatów), do zbadania serc świń po zawale leczonych izoformą glejowego czynnika wzrostu (GGF) neureguliny-1β w porównaniu ze zwierzętami nieleczonymi 43 oraz do zbadania różnic w matrycach tkanek serca z MDX myszy (powszechnie stosowany model zwierzęcy dystrofii mięśniowej Duchenne'a) w różnym wieku i w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Technika ta została po raz pierwszy wprowadzona przez doktorów Caulfielda i Borga w 1979 roku, ale od tego czasu w niewielu badaniach zastosowano tę potężną technikę 45-47, ponownie wprowadzoną tutaj z niewielkimi modyfikacjami. Metodologia ta jest cennym narzędziem badawczym, ponieważ dostarcza jakościowych informacji na temat ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte podczas prostego pomiaru zawartości składników macierzy i/lub poziomu zwłóknienia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Protokoły postępowania ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protokoły numer M/10/117 (świnie) i M/10/219 (myszy) i przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi standardami AAALAC. Wykorzystanie bankowych tkanek ludzkiego serca zostało zatwierdzone przez Vanderbilt University Medical Center IRB (numer protokołu 100887).

1. Pobieranie i przechowywanie próbek

  1. Przygotować świeży 4% aldehyd glutarowy w 0,1 M roztworze buforu fosforanowego (PB).
    UWAGA: Aldehyd glutarowy jest toksyczny, nosić rękawice i pracować w okapie.
    1. Przygotować 0,2 M roztwór podstawowy PB, pH 7,4 używając 21,8 g Na2HPO4 i 6,4 g NaH2PO4. Quantum satis (Q.s.) do 1 000 ml dH2O.
    2. Dodać 400 μl 50% aldehydu glutarowego do 2,5 ml roztworu podstawowego PB i 2,1 mldH2O.
  2. Zanurz kawałek (nie większy niż 2cm2) tkanki w 4% roztworze aldehydu glutarowego. Uwaga: Można również użyć mniejszych części, ale powinny one mieć wystarczający rozmiar (nie mniejszy niż 5 mm2), aby można je było łatwo zobrazować na oko w celu ułatwienia późniejszych etapów protokołu.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze 4 °C.

2. Decelularyzacja tkanki serca

  1. Przygotować świeży 10% wodny roztwór NaOH za pomocą 10 g granulek NaOH/100 ml dH2O.
    UWAGA: Roztwory NaOH są i mogą powodować oparzenia alkaliczne, należy nosić rękawice.
  2. Wypłukać tkankę w dH2O.
  3. Inkubować w 10% roztworze NaOH w temperaturze pokojowej przez 6 - 10 dni (do momentu, gdy tkanka zmieni kolor z czerwonawo-brązowego na białawy lub biały).
  4. Płukać w dH2O, aż tkanka stanie się przezroczysta.
  5. Zanurz tkankę w 1% kwasie garbnikowym na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Stosować 1 ml 5% roztworu podstawowego na 4 ml dH2O.
    UWAGA: Kwas garbnikowy jest silnym środkiem drażniącym, należy nosić rękawiczki.
  6. Płukać w dH2O przez noc.

3. Osmikacja i odwodnienie tkanki serca (w dygestorii dla bezpieczeństwa)

  1. Sporządzić 0,2 M roztwór podstawowy buforu kakodylanu sodu, używając 21,4 g kakodylanu sodu, 10,0 g chlorku wapnia i 450 mldH2O. Wymieszać, a następnie dodać kwas solny w razie potrzeby, aby dostosować pH do 7,4. Q.s. do 500 ml z dH2O.
    UWAGA: Kakodylan sodu i kwas solny są toksyczne, należy nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.
  2. Dla bezpieczeństwa przygotować 2% wodny roztwór podstawowy tetratlenku osmu w dygestorium, rozpuszczając 1 g kryształu tetratlenku osmu w 50 ml dH2O.
    UWAGA: Tetratlenek osmu stanowi poważne zagrożenie wdychania; Możliwe jest utrwalanie pary wodnej błon śluzowych lub gałek ocznych, dlatego należy obchodzić się z nimi tylko w wyciągach w rękawiczkach. Zalecana jest osłona przeciwbryzgowa.
  3. Płukać tkankę w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (mieszać roztwór podstawowy 1:1 zdH2O) przez 5 minut na rotatorze (lub delikatne mieszanie).
  4. Powtórz poprzedni krok dwukrotnie, w sumie trzy płukania buforem.
  5. Zanurz tkankę w 1% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (wymieszaj podstawowy kakodylan sodu i podstawowy tetrtlenek osmu 1:1) na rotatorze na 1 godzinę.
  6. Wypłukać tkankę w 0,1 M buforze kakodylanu sodu 3 razy po 5 minut na rotatorze.
  7. Płukać tkanki przy użyciu rosnących stężeń etanolu (30%, 50%, 75%, 85%, 95% i na końcu 100%) przez 15 minut na rotatorze.

4. Przygotowanie powierzchni przekroju poprzecznego dla SEM

  1. Przenieś tkankę w 100% etanolu na płytką szalkę Petriego zawierającą również 100% etanolu.
  2. Trzymaj dwie bardzo ostre żyletki tak, aby płaskie boki stykały się ze sobą, a krawędzie tnące krzyżowały się, tworząc dwa boki trójkąta równobocznego nad próbką. Aby to osiągnąć, lewą ręką umieść jedno ostrze po prawej stronie próbki i przetnij w lewo. W tym samym czasie prawą ręką umieść drugie ostrze po lewej stronie próbki i pokrój w prawo. W ten sposób ostrza będą przesuwane względem siebie z przeciwnych kierunków, aby wykonać jedno gładkie cięcie.
  3. Dosuń boki płaskiego ostrza do siebie, aby uzyskać bardzo czyste cięcie próbki przy minimalnym zniekształceniu lub sile rozrywającej, najlepiej odsłaniając jak największą powierzchnię bez uszkadzania próbki.
  4. Powtórz tę czynność dla każdej próbki, aby odsłonić możliwie najczystsze powierzchnie przekroju poprzecznego do badania w SEM.

5. Krytyczny punkt suszenia (CPD) tkanki serca

  1. Za pomocą szpatułki lub pęsety przenieś tkankę do uchwytu próbki suszarki do punktu krytycznego (CPD), upewniając się, że tkanka pozostaje przez cały czas w 100% etanolu. Upewnij się, że posiadacz jest zanurzony w etanolu i że transfer odbywa się przy tkance wystawionej na działanie powietrza nie dłużej niż kilka sekund.
  2. Uruchom CPD zgodnie z instrukcją obsługi, aby wykonać 3 cykle przedmuchiwania i napełniania w celu zastąpienia etanolu ciekłym dwutlenkiem węgla.
  3. Uruchomić CPD zgodnie z instrukcją obsługi, aby osiągnąć krytyczny punkt suszenia próbek i przywrócić je do ciśnienia atmosferycznego z kontrolowanym odpowietrzeniem CO2 .

6. Montaż próbek tkanek serca do SEM

  1. Przygotuj kikut próbki SEM dla każdej próbki, przyklejając zakładkę z kleju węglowego do górnej powierzchni aluminiowego króćca.
  2. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ostrożnie przyklej próbkę do zakładki samoprzylepnej tak, aby powierzchnia interesującego nas przekroju poprzecznego była skierowana do góry (z dala od zakładki, widoczna) i jak najbliżej równoległej do płaszczyzny powierzchni króćca próbki. Nie sonduj ani nie dotykaj interesującej Cię powierzchni.
  3. Rozbij drewniany aplikator w sztyfcie, aby uzyskać zwężający się pędzel, idealny do nakładania farby. Nałóż farbę srebrną lub węglową na podstawę i boki próbki, aby poprawić przyczepność do kęcia.
  4. Rozciągnij bardzo cienką linię farby srebrnej lub węglowej aż do krawędzi powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić ścieżkę ładunku od powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania do masy.
  5. Nałóż 2 lub 3 małe krople farby srebrnej lub węglowej na obwodzie zakładki węglowej, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę od powierzchni zakładki węglowej do metalowego króćca, a tym samym do ziemi.
  6. Pozostaw przewodzącą farbę do wyschnięcia na dwie godziny.
  7. Używaj napylarki zgodnie z instrukcją obsługi, aby nałożyć stosunkowo ciężką powłokę (docelowy zakres 30 - 40 nm) ze stopu złota i palladu lub złota. Pompować komorę próbki do około 0,1 mbar; ustaw Timer na 40 sek. Otwarty Ustaw zawór w pozycji 8:00 (umiarkowany przepływ argonu). Naciśnij Start, aby zainicjować napylanie przy 30 mA. Fioletowe wyładowanie blasku powinno być widoczne w komorze próbki.

7. Badanie SEM próbek tkanek serca

  1. Wykonaj skaningową mikroskopię elektronową przy stosunkowo niskim napięciu przyspieszającym, aby zminimalizować problemy z obrazowaniem związane ze słabym rozpraszaniem ładunku w próbce (ładowanie). Sugerowane warunki początkowe obrazowania to: napięcie przyspieszające 5 kV, odległość robocza 10 mm.
  2. Z pomocą doświadczonego operatora zastosuj zwiększoną odległość roboczą, aby zwiększyć głębię ostrości w warunkach obrazowania wymagających ostrości włókien w wielu płaszczyznach ogniskowych lub światłowodów rozciągających się na znaczną długość w wymiarze z.
    1. W przypadku używanego tutaj mikroskopu (patrz Spis materiałów), w interfejsie użytkownika przejdź do zakładki Nawigacja w prawym górnym rogu.
    2. Dostęp do karty Współrzędne można uzyskać z menu Stół montażowy. Aby zwiększyć odległość roboczą, wprowadź większą wartość w milimetrach dla współrzędnej Z, a następnie kliknij zakładkę Przejdź do, aby przesunąć stolik próbki na wprowadzoną odległość roboczą.
  3. Z pomocą doświadczonego operatora zastosuj pochylanie i obracanie próbki, aby ustawić powierzchnię zainteresowania prostopadłą do wiązki elektronów. Dodatkowe pochylenie od 10 do 30 stopni od tej pozycji może usprawnić obserwację i dokumentację struktury matrycy.
    1. W przypadku używanego tutaj mikroskopu (patrz Tabela materiałów), w interfejsie użytkownika kliknij i przytrzymaj prawy przycisk myszy, a następnie przesuń w lewo lub w prawo, aby ustawić ostrość próbki w pobliżu obrzeży przygotowanej płaszczyzny powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania, zwracając uwagę na zogniskowaną odległość roboczą.
    2. Nawiguj za pomocą joysticka ręcznego interfejsu użytkownika, aby zbliżyć się do przeciwległej krawędzi powierzchni i powtórzyć ostrość. Jeśli odległość robocza nie jest w przybliżeniu równa pierwszej pozycji, należy przechylić próbkę, aby uzyskać przybliżoną zgodność w obu lokalizacjach, korzystając z zakładki Współrzędne w menu Stolik (patrz 7.2) i wprowadzić wartość nachylenia we współrzędnej T.
    3. Obróć próbkę o dziewięćdziesiąt stopni (wprowadź wartość w polu Współrzędna R) i powtarzaj proces, aż wszystkie pozycje zostaną skupione w przybliżeniu w tej samej odległości roboczej.
      Uwaga: Można zastosować SEM o zmiennym ciśnieniu, aby poprawić rozpraszanie ładunku, jeśli jest dostępny. Wysoka próżnia jest standardowym trybem pracy w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyróżniona technika została zastosowana do tkanek serca od niewykorzystanego dawcy ludzkiego przeszczepu serca (Rysunek 1), eksplantowanych tkanek od biorców przeszczepu, serc myszy typu dzikiego i dystroficznego (Rysunek 3) oraz w próbkach serca po zawale mięśnia sercowego z modelu uszkodzenia serca u świń (Rysunek 2). Jak pokazano na rysunku 1, ludzka macierz serca jest skomplikowanym splotem usieciowanych białek, które...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie powierzchni przekroju poprzecznego jest najbardziej krytycznym krokiem podczas protokołu. Aby zachować delikatną strukturę, odwodnione próbki muszą pozostać w 100% etanolu przez cały czas, aż do momentu wprowadzenia do procesu suszenia w punkcie krytycznym. W związku z tym krojenie próbek w celu uzyskania powierzchni do badania EM musi być wykonywane, gdy próbki są zanurzone w etanolu w płytkim naczyniu. Bardzo ważne jest również, aby odsłonięta powierzchnia nie była dotykana ani sondowana podczas późniejsz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantów National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398.

Obrazowanie i przetwarzanie tkanek (po maceracji NaOH) zostało przeprowadzone za pomocą Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Cell Imaging Shared Resource (CISR) (wspieranego przez granty NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 i EY08126). Jesteśmy szczególnie wdzięczni głównym dyrektorom VUMC CISR (dr Samowi Wellsowi i dr W. Grayowi (Jayowi) Jerome'owi) za cenne porady techniczne, a także za udostępnienie podstawowej przestrzeni i zasobów na potrzeby filmowania techniki przedstawionej w tym artykule.

Chcielibyśmy wyrazić nasze najgłębsze podziękowania dla dr Yan Ru Su i Pani Kelsey Tomasek z Cardiology Core Lab for Translational and Clinical Research na Uniwersytecie Vanderbilt za dostarczenie technicznej wiedzy i pobranie próbek tkanek ludzkich wykorzystywanych w tym badaniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorek wapniaMikroskopia elektronowa Nauki12340100 g
Klej węglowyMikroskopia elektronowa Nauki1266430 g
Klej węglowy ZakładkiMikroskopia elektronowa Nauki77825Zamów pasujące do odcinków
Żyletki z podwójną krawędzią Stal nierdzewnaTed Pella, Inc121-6250 / szt
Elektronetanolu Nauki mikroskopowe15055450 ml
Aldehyd gluterowy, 50% roztwórMikroskopia elektronowa Sciences16310Klasa EM, destylacja oczyszczona
Kwas solnyMikroskopia elektronowa Sciences16760 lub 16770100 ml
Fosforan monosodowy NaH2PO4Sigma-AldrichS9251-250G250 g
osmu Mikroskopia elektronowa tlenku tetroksydu191001 g
Srebro Przewodzący klejMikroskopia elektronowa Nauki12686-1515 g
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS8045-1KG1 kg
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS3264-500G500 g
Kwas garbnikowy, 5% Wodny Mikroskopia elektronowa Nauki21702-5500 ml
Trójwodzian kakodylanu soduMikroskopia elektronowaNauki 12300100 g
Stop złota i palladu lubsystemy rafinacji złota, Inc. różni sięw zależności od marki i modelu powlekarki
Punkt krytyczny SuszarkaMikroskopia elektronowa Sciences850
Zwykłe drewniane aplikatoryFisher Scientific23-400-102
Quanta 250 Środowiskowe SEMFEIQ250 SEM
NapylarkaCressington Scientific Instruments Ltd.Model 108
Aluminiowe kikuty próbek SEMMikroskopia elektronowa Nauki75220-12specyficzne dla miskroskopu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
  2. Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
  3. Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
  4. Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
  5. Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
  6. Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
  7. Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
  8. Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
  9. Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
  10. Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
  11. Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
  12. Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
  13. Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
  14. Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
  15. Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
  16. Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias? Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
  17. Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
  18. Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
  19. Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
  20. Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
  21. Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural ('small vessel') coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
  22. Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
  23. Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
  24. Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
  25. Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
  26. Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
  27. de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
  28. Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy--scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
  29. Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
  30. Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
  31. Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
  32. Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
  33. Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
  34. Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
  35. Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
  36. Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
  37. Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
  38. O'Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
  39. Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
  40. Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
  41. Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
  42. Finsterer, J., Stollberger, C. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  43. Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773(2014).
  44. Caulfield, J. B., Borg, T. K. The collagen network of the heart. Lab Invest. 40, 364-372 (1979).
  45. Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
  46. Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
  47. Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
  48. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
  49. Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Scanning Electron MicroscopyExtracellular MatrixCardiac TissueTissue DecellularizationSample PreparationSEM ImagingGold Palladium CoatingCritical Point DryingOsmium TetroxideSodium Hydroxide

Related Articles