Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Summary

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Abstract

Testy fluorescencyjne są najczęściej używanymi odczytami w mikrofluidyce kropelkowej ze względu na ich jasne sygnały i szybki czas reakcji. Zastosowania takie jak testy multipleksowe, ewolucja enzymów i sortowanie komórek wspomagane biologią molekularną wymagają wykrywania dwóch lub więcej kolorów fluorescencji. Standardowe wielokolorowe systemy detekcji, które łączą lasery wolnej przestrzeni z mikroskopami epifluorescencyjnymi, są nieporęczne, drogie i trudne w utrzymaniu. W tym artykule opisujemy schemat wykonywania detekcji wielokolorowej poprzez wzbudzanie dyskretnych obszarów kanału mikroprzepływowego za pomocą laserów sprzężonych ze światłowodami. Emitowane światło jest zbierane przez światłowód sprzężony z pojedynczym fotodetektorem. Ponieważ wzbudzenie zachodzi w różnych lokalizacjach przestrzennych, tożsamość emitowanego światła może być zakodowana jako przesunięcie czasowe, eliminując potrzebę stosowania bardziej skomplikowanych schematów filtrowania światła. System został wykorzystany do wykrywania populacji kropelek zawierających cztery unikalne kombinacje barwników oraz do wykrywania subnanomolowych stężeń fluoresceiny.

Introduction

Mikrofluidyka kropelkowa stanowi platformę dla biologii o wysokiej przepustowości poprzez dzielenie eksperymentów na dużą liczbę kropel wodnych zawieszonych w oleju nośnikowym ¹. Kropelki są wykorzystywane do tak różnych zastosowań, jak analiza pojedynczych komórek ², cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) ³ i ewolucja enzymów ⁴. Testy fluorescencyjne są standardowym sposobem wykrywania mikrofluidyki kropelkowej, ponieważ ich jasne sygnały i szybki czas reakcji są kompatybilne z wykrywaniem objętości kropel poniżej nanolitrów z szybkością kiloherców. Wiele aplikacji wymaga detekcji fluorescencji dla co najmniej dwóch kolorów jednocześnie. Na przykład nasze laboratorium często przeprowadza eksperymenty sortowania kropelek aktywowanych PCR, które wykorzystują jeden kanał detekcji do uzyskania wyniku testu i wykorzystują wtórny barwnik tła, aby krople ujemne w teście były policzalne ⁵.

Typowe stacje detekcji mikrofluidyki kropelkowej są oparte na mikroskopach epifluorescencyjnych i wymagają skomplikowanych schematów manipulacji światłem, aby wprowadzić do mikroskopu światło wzbudzające z laserów wolnej przestrzeni, aby skupić się na próbce. Po wyemitowaniu fluorescencji z kropli, emitowane światło fluorescencyjne jest filtrowane tak, aby każdy kanał detekcji wykorzystywał jedną lampę fotopowielacza (PMT) wyśrodkowaną w paśmie długości fali. Optyczne systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym stanowią barierę wejścia ze względu na ich koszt, złożoność i wymaganą konserwację. Światłowody zapewniają środki do skonstruowania uproszczonego i solidnego schematu wykrywania, ponieważ światłowody można ręcznie wstawiać do urządzeń mikroprzepływowych, eliminując potrzebę prowadzenia światła w oparciu o lustro i umożliwiając łączenie ścieżek świetlnych za pomocą złączy światłowodowych.

W tym artykule opisujemy montaż i walidację kompaktowego i modułowego schematu do przeprowadzania wielokolorowej detekcji fluorescencji za pomocą szeregu światłowodów i pojedynczego fotodetektora ⁶. Światłowody są sprzężone z pojedynczymi laserami i są wprowadzane normalnie do kanału przepływowego w kształcie litery L z regularnymi przesunięciami przestrzennymi. Włókno zbierające fluorescencję jest zorientowane równolegle do obszarów wzbudzenia i jest połączone z pojedynczym PMT. Ponieważ kropla przechodzi przez wiązki laserowe w różnym czasie, dane zarejestrowane przez PMT pokazują przesunięcie czasowe, które pozwala użytkownikowi rozróżnić fluorescencję emitowaną po wzbudzeniu kropli przez każdą odrębną wiązkę laserową. To przesunięcie czasowe eliminuje potrzebę rozdzielania emitowanego światła w celu oddzielenia PMT za pomocą szeregu dichroicznych luster i filtrów pasmowoprzepustowych. Aby zweryfikować skuteczność detektora, oznaczamy ilościowo fluorescencję w populacjach kropelek zawierających barwniki o różnym kolorze i stężeniu. Czułość systemu jest badana pod kątem wykrywania fluoresceiny jednokolorowej i wykazuje zdolność do wykrywania kropelek o stężeniach do 0,1 nM, co stanowi 200-krotną poprawę czułości w porównaniu z najnowszymi metodami opartymi na włóknach opisanych w literaturze ⁷.

Protocol

1. Produkcja główna SU8

1. Zaprojektuj struktury mikroprzepływowe do produkcji trójwarstwowej za pomocą oprogramowania do projektowania i zleć wydrukowanie projektów dostawcy na folii na płytce drukowanej o rozdzielczości 10 μm. Szczegóły konstrukcji urządzenia podano w załączonym piśmiennictwie ⁶, a geometrie kanałów przedstawiono na rysunku 1. Warstwy powinny zawierać znaczniki wyrównania, aby ułatwić kolokację elementów z każdej warstwy produkcyjnej ⁸.
2. Umieść wstępnie oczyszczoną płytkę silikonową o średnicy 3 cali na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować ją do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1 750 obr./min, uzyskując grubość warstwy 80 μm.
3. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut. Poczekaj, aż wafel ostygnie do temperatury RT, zanim przejdziesz do następnego kroku.
4. Wystawić powlekaną płytkę na maskę z 1^warstwą pod skolimowaną diodą LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 1 minutę, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.
5. Umieść wafel na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować go do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 5,000 obr./min, uzyskując warstwę o dodatkowej grubości 40 μm.
6. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut, a następnie ostudź do temperatury RT przed przejściem do następnego kroku.
7. Dopasuj maskę^2-giej warstwy do geometrii wzorzystej w 1.3 i wystawij powlekaną płytkę na skolimowaną diodę LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po naświetleniu umieść na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 4 minuty i 30 sekund, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.
8. Umieść wafel na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować go do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1,000 obr./min, uzyskując warstwę o dodatkowej grubości 100 μm.
9. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut, a następnie ostudź do temperatury RT przed przejściem do następnego kroku.
10. Dopasuj maskę 3. warstwy do geometrii wzorzystej w 1.3 i wystaw powlekaną płytkę na działanie skolimowanej diody LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po ekspozycji umieść na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 9 minut, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.
11. Opracuj maski, zanurzając się w mieszanej kąpieli octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego na 30 minut. Umyj wafel w izopropanolu i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 1 minutę. Umieść rozwinięty wzorzec na 100-milimetrowej szalce Petriego do formowania polidimetylosiloksanu (PDMS).

2. Produkcja urządzeń PDMS

1. Przygotuj PDMS 10:1, łącząc 50 g bazy silikonowej z 5 g utwardzacza w plastikowym kubku. Wymieszaj zawartość za pomocą narzędzia obrotowego wyposażonego w patyczek do mieszania. Odgazowywać mieszaninę wewnątrz eksykatora przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
2. Wlać PDMS do uzyskania grubości 3 mm na urządzenie główne i umieścić z powrotem w eksykatorze w celu dalszego odgazowania. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków piecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 80 minut.
3. Wytnij urządzenie z formy za pomocą skalpela i umieść na czystej powierzchni wzorzystą stroną do góry i przebij wloty i wyloty płynu dziurkaczem biopsyjnym 0,75 mm. Urządzenie musi być przycięte w taki sposób, aby geometrie o wysokości 120 μm i 220 μm były dostępne z boku urządzenia.
4. Urządzenie należy traktować plazmowo stroną do góry wraz ze wstępnie oczyszczonym szkiełkiem o wymiarach 2 cale na 3 cale przy plazmie 1 mbar O₂ przez 20 sekund w myjce plazmowej o mocy 300 W. Połącz urządzenie PDMS, umieszczając wzorzystą stronę urządzenia PDMS na stronie szkła poddanego obróbce plazmowej. Umieść urządzenie w piekarniku o temperaturze 80 °C i piecz zmontowane urządzenie przez 40 minut.
5. Unieszkodliwić kanały jako hydrofobowe za pomocą strzykawki do przepłukania urządzenia fluorowanym płynem do obróbki powierzchni. Natychmiast piecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby odparować rozpuszczalnik.

3. Przygotowanie komponentów optycznych

1. Przygotować światłowód wzbudzenia laserowego, usuwając izolację z ostatnich 5 mm rdzenia 105 μm, okładziny 125 μm, światłowód NA = 0,22.
2. Przygotuj 2. kolorowe światłowód wzbudzenia laserowego, powtarzając 3.1 dla 2. identycznego włókna
.
3. Przygotuj światłowód do odbioru sygnału fluorescencyjnego powtarzając 3,1 dla rdzenia 200 μm, okładziny 225 μm, światłowód NA = 0,39.
4. Sprawdź końcówki wszystkich włókien — jeśli końcówki nie kończą się płaską powierzchnią, ponownie rozetnij końce rysikiem do włókien.
5. Podłącz sprzęgacz światłowodu laserowego do lasera o mocy 50 mW, 405 nm i podłącz do lasera jedno z włókien rdzeniowych 105 μm. Skieruj odizolowany koniec na czujnik miernika mocy lasera i użyj precyzyjnych regulacji łącznika laserowego, aby zmaksymalizować moc lasera.
6. Powtórz 3,5 dla lasera o mocy 50 mW i długości fali 473 nm.
7. Zamontuj poczwórne filtry pasmowoprzepustowe 446/510/581/703 nm na PMT za pomocą tubusów soczewek do blokowania światła laserowego i przesyłania emitowanej fluorescencji. Zamocuj łącznik światłowodowy tak, aby światło przepływało przez filtry przed uderzeniem w PMT.
8. Podłącz światłowód z 3.3 do urządzenia zmontowanego w 3.7.

4. Generowanie mieszanej emulsji offline

1. Zaopatrz się w mikroprzepływowy wkraplacz z ogniskiem przepływu i kryzą 60 μm x 60 μm.
2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml olejami HFE 7500 z 2% jonowym fluorosurfaktantem ⁹.
3. Napełnić serię strzykawek o pojemności 1 ml następującymi kombinacjami fluoresceiny (FITC) i niebieskich barwników sprzężonych z dekstranem (CB) w PBS: 1 nM FITC/10 nM CB, 10 nM FITC/10 nM CB, 1 nM FITC/100 nM CB i 10 nM FITC/100 nM CB.
4. Zamontuj urządzenie do wytwarzania kropli na stoliku mikroskopu odwróconego, a strzykawki wodne i olejowe na pompach strzykawkowych. Podłączyć strzykawki do urządzeń za pomocą rurki PE-2.
5. Uruchamiając pompy strzykawkowe z prędkością 500 μl/h dla oleju i 250 μl/h dla roztworów wodnych, utworzyć mieszaninę kropelek o wielkości 80 μm zawierających roztwory z ppkt 4.3. Dla każdego rodzaju próbki wodnej należy użyć nowego urządzenia do wytwarzania kropli, aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe. Zebrać ~200 μl emulsji z każdej kombinacji barwników do pustej strzykawki.
6. Po zebraniu 4 rodzajów kropel w jednej strzykawce, należy wymieszać emulsję, kilkakrotnie obracając strzykawkę.
7. Powtórzyć kroki 4.2-4.6 z roztworami wodnymi zawierającymi 0,1, 1, 10 i 100 nM FITC w PBS.

5. Wstawianie światłowodu

1. Umieść chip mikroprzepływowy wykonany w kroku 2 na stoliku mikroskopu odwróconego sprzężonego z kamerą cyfrową zdolną do < czasów otwarcia migawki 100 μs.
2. Pracując ostrożnie z boku, włóż światłowód sprzężony z laserem 473 nm do najdalszego kanału 120 μm, uważając, aby nie przebić się do głównego kanału przepływowego.
3. Włóż światłowód sprzężony z laserem 405 nm do najdalszego kanału bocznego o wysokości 120 μm, zapewniając odstęp między włóknami 300 μm.
4. Włóż światłowód sprzężony z PMT do kanału o wysokości 220 μm normalnego do dwóch światłowodów wzbudzenia laserowego.

6. Wykrywanie fluorescencji mieszanych emulsji

1. Zamontuj strzykawkę o pojemności 5 ml wypełnioną HFE 7500 z 2% jonowym fluorosurfaktantem do wlotu oleju dystansowego urządzenia detekcyjnego z rurką PE-2.
2. Zamontować strzykawkę zawierającą zmieszaną emulsję FITC/CB na pionowo ustawionej pompie strzykawkowej i podłączyć do wlotu do wstrzykiwania kropelek urządzenia za pomocą rurki PE-2. Podłącz odcinek rurki PE-2 od wyjścia urządzenia do pojemnika na odpady.
3. Zalać urządzenie, uruchamiając każdą z pomp z prędkością 1 000 μl/h, aż zobaczysz, że zarówno olej, jak i kropelki regularnie łączą się w urządzeniu i przepływają w dół.
4. Dostosuj natężenie przepływu tak, aby olej dystansowy działał z prędkością 6 000 μl/h, a kropelki z prędkością 100 μl/h, zapewniając znaczne odstępy między kroplami przemieszczającymi się przez obszar wykrywania.
5. Włącz lasery, uruchom program akwizycji danych i dostosuj wzmocnienie PMT, aby zapewnić sygnały, które są ponad 100 razy większe niż podstawowy poziom szumów. Dostosuj moc lasera tak, aby wszystkie piki dubletów były wyraźnie widoczne na jednym, liniowo skalowanym śladzie czasu.
6. Uzyskaj 60 sekund śladu czasu napięcia PMT przy co najmniej 20 kHz. Zaimportuj dane do programu komputerowego, takiego jak Matlab i zmierz wysokości szczytów zarejestrowanych dubletów za pomocą niestandardowego skryptu programu obliczeniowego.
   UWAGA: Jest to informacja uzupełniająca.
7. Powtórz kroki 6.2-6.7, używając mieszanej emulsji tylko z FITC, utworzonej w 4.7, przy wyłączonym laserze 405 nm.

Results

Produkcja urządzenia PDMS, które pozwala na wprowadzenie światłowodów, wymaga wieloetapowej procedury fotolitografii w celu stworzenia kanałów o różnej wysokości (Rysunek 1). Najpierw warstwa SU-8 o wysokości 80 μm jest przędzona na płytce krzemowej i wzorzysta za pomocą maski w celu stworzenia geometrii obsługi płynów. Następnie dodatkowa warstwa SU-8 o grubości 40 μm jest przędzona na płytkę i modelowana za pomocą drugiej maski w celu stworzenia elementów, które utworzą...

Discussion

Detekcja światłowodowa wymaga wyrównania światłowodów względem kanałów płynnych. Ze względu na to, że nasze urządzenie wykorzystuje kanały prowadzące wykonane metodą fotolitografii wielowarstwowej, duże znaczenie ma rozmieszczenie masek względem siebie. Jeśli kanały prowadzące światłowód znajdują się zbyt blisko kanału płynu, istnieje możliwość wycieku płynu; Jeśli kanały prowadzące są umieszczone zbyt daleko lub niewspółosiowo, sygnał fluorescencyjny zbierany przez światłowód detekcyjny może być znacznie osłabiony. Praw...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fotomaski	CadArt Servcies
3-calowe wafle silikonowe, typ P, klasa dziewicza	Wafle uniwersyteckie	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowych	Krayden	4019862
strzykawki 1 ml	BD
strzykawki 10 ml	BD	309604
27 igieł gaugue	BD	305109
PE 2 rurki polietylenowe	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Powszechnie znany jako HFE 7500
surfaktantu			w ref #10
Kaskadowy niebieski barwnik sprzężony z dektranem	Life Technologies	D-1976
Sól sodowa fluoresceiny	Sigma	28803
Filtr	czteropasmowoprzepustowySemrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Port światłowodowy	Tubus obiektywu Thorlabs	PAFA-X-4-A
	Thorlabs	SM1L05
krosowy z 200 μ rdzeń M / 225 μ m okładzina światłowodowa z jednym odizolowanym końcem i jednym złączem FC / PC	Thorlabs	Custom
Patch Cable z 105 i # 956; rdzeń M / 125 μ m światłowód okładzinowy z jednym odizolowanym końcem i jednym złączem FC/PC	Thorlabs	Custom
125 μ m narzędzie do ściągania izolacji z włókien	Thorlabs	T08S13
225 μ m narzędzie do ściągania izolacji z włókien	światłowodowy lasera Thorlabs	T10S13
	OptoEngine	FC/PC
405 nm CW przy 50  mW	OptoEngine	MDL-III-405	Dystrybutor do laserów CNI
Laser 473 nm CW przy 50	Silnik optoowy	MLL-FN-473-50