Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54016

⸱

10 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Metabolism Research Institute, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

Streszczenie

Komórki macierzyste i progenitorowe z dorosłej trzustki mogą być potencjalnym źródłem terapeutycznych komórek beta-podobnych do leczenia pacjentów z cukrzycą typu 1. Jednak nadal nie wiadomo, czy komórki macierzyste i progenitorowe istnieją w dorosłej trzustce. Strategie badawcze wykorzystujące śledzenie linii cre-lox u dorosłych myszy przyniosły wyniki, które albo potwierdzają, albo obalają ideę, że komórki beta mogą być generowane z przewodów, przypuszczalnego miejsca, w którym mogą znajdować się dorośli przodkowie trzustki. Te metody śledzenia linii in vivo cre-lox nie są jednak w stanie odpowiedzieć na pytania o samoodnawianie i różnicowanie wielu linii – dwa kryteria niezbędne do zdefiniowania komórki macierzystej. Aby rozpocząć wypełnianie tej luki technicznej, opracowaliśmy trójwymiarowe testy kolonii dla komórek progenitorowych trzustki. Wkrótce po naszej pierwszej publikacji inne laboratoria niezależnie opracowały podobną, ale nie identyczną metodę zwaną testem organoidowym. W porównaniu z testem organoidowym, nasza metoda wykorzystuje metylocelulozę, która tworzy lepkie roztwory, które umożliwiają włączenie białek macierzy zewnątrzkomórkowej w niskich stężeniach. Testy zawierające metylocelulozę umożliwiają łatwiejsze wykrywanie i analizę komórek progenitorowych na poziomie pojedynczej komórki, co ma kluczowe znaczenie, gdy komórki progenitorowe stanowią niewielką subpopulację, jak ma to miejsce w przypadku wielu dorosłych komórek macierzystych narządów. Łącznie, wyniki z kilku laboratoriów wskazują na samoodnawianie się in vitro i wieloliniowe różnicowanie komórek progenitorowych trzustki u myszy. Obecne protokoły opisują dwa testy kolonii na bazie metylocelulozy w celu scharakteryzowania przodków trzustki myszy; Jeden zawiera komercyjny preparat mysich białek macierzy zewnątrzkomórkowej, a drugi sztuczne białko macierzy zewnątrzkomórkowej znane jako hydrożel lamininy. Przedstawione tutaj techniki to: 1) dysocjacja trzustki i sortowanie komórek przewodowych CD133 + Sox9 / EGFP+ od dorosłych myszy, 2) manipulacja pojedynczymi komórkami posortowanych komórek, 3) analizy pojedynczej kolonii za pomocą mikroprzepływowego qRT-PCR i barwienia immunologicznego całego wierzchowania oraz 4) dysocjacja pierwotnych kolonii na zawiesiny jednokomórkowe i ponowne posiewy w drugorzędowe testy kolonii w celu oceny samoodnowy lub różnicowania.

Wprowadzenie

Trzustka składa się z trzech głównych linii komórkowych; komórki groniaste wydzielają enzymy trawienne, przewody wydzielają mucynę do odpierania patogenów i transportu enzymów trawiennych do jelit, a komórki endokrynne wydzielają hormony, w tym insulinę i glukagon, które utrzymują homeostazę glukozy. Podczas embrionalnego rozwoju trzustki wczesne komórki przewodowe są źródłem trójpotencjałowych komórek progenitorowych, które mogą dać początek trzem liniom w trzustce dorosłych zwierząt 1,2. Ponieważ dorosłe komórki macierzyste i progenitorowe, takie jak komórki macierzyste szpiku kostnego, są już z powodzeniem stosowane w leczeniu różnych chorób 3, istnieje duże zainteresowanie znalezieniem komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłej trzustce. Gdyby możliwa była izolacja i manipulacja dorosłymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi trzustki, komórki te mogłyby być stosowane w leczeniu chorób takich jak cukrzyca typu 1, w której komórki wydzielające insulinę są niszczone przez autoimmunizację.

Czy trójsilne komórki progenitorowe nadal istnieją w przewodach trzustkowych dorosłych po zakończeniu rozwoju embrionalnego, jest kwestią intensywnie dyskutowaną w społeczności naukowej. W tej debacie i przy użyciu technik śledzenia linii in vivo cre-lox, Inada i współpracownicy wykazali, że dorosłe mysie komórki przewodowe znakowane markerem, anhydrazą węglanową II, mogą dać początek wszystkim trzem liniom trzustki. Jednak przy użyciu innych markerów przewodowych, takich jak HNF1b 5 i Sox9 2, stwierdzono, że komórki przewodowe nie są głównym źródłem komórek beta u dorosłych myszy.

Kilka lat temu zasugerowaliśmy, że przyczyną wspomnianej debaty może być brak w dziedzinie 6,7 odpowiednich narzędzi analitycznych, które można by użyć do pomiaru samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego - dwóch kryteriów niezbędnych do zdefiniowania komórki macierzystej. Wspomniana powyżej technika śledzenia linii produkcyjnej cre-lox in vivo może dostarczyć dowodów na pokrewieństwo między przodkiem a potomstwem na poziomie populacji. Jednak ta technika śledzenia linii ma ograniczoną moc rozpoznania, czy pojedyncze komórki progenitorowe mogą się samoodnawiać i różnicować w wiele linii. Analiza pojedynczych komórek jest ważna, ponieważ jeśli kilka monosilnych komórek progenitorowych, z których każdy ma inny potencjał liniowy, zostanie przeanalizowanych razem, może się wydawać, że mają one zdolność do różnicowania wieloliniowego. Ponadto komórki macierzyste stanowią zwykle niewielką populację dorosłego narządu. Aktywność mniejszej populacji komórek może być maskowana przez dużą populację. W związku z tym negatywny wynik badania populacyjnego niekoniecznie wskazuje na brak komórek macierzystych. Wreszcie, śledzenie linii cre-lox nie pozwala obecnie na pomiar samoodnawiania się.

Aby rozpocząć wypełnianie luki technicznej w dziedzinie biologii komórek progenitorowych trzustki, opracowano testy kolonii 7-11 lub organoidów 12-15 przy użyciu systemów hodowli 3D. W naszym laboratorium opracowano dwa testy kolonii dla komórek progenitorowych trzustki: jeden zawiera komercyjny preparat mysich białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (patrz tabela metod i sprzętu), a drugi zawiera hydrożel z lamininą, zdefiniowane sztuczne białko ECM 7-11. Komórki progenitorowe miesza się w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Metyloceluloza jest biologicznie obojętnym i lepkim materiałem przygotowanym z włókien drzewnych i jest rutynowo stosowana w testach kolonii krwiotwórczych 16. Półstałe podłoże zawierające metylocelulozę ogranicza ruch pojedynczych komórek progenitorowych, tak że nie mogą one ponownie agregować. Jednak podłoże jest wystarczająco miękkie, aby umożliwić komórce progenitorowej wzrost i różnicowanie się w kolonię komórek w przestrzeni 3D. Zgodnie z tradycją hematologów, komórka progenitorowa trzustki, która była zdolna do powstania kolonii komórek, została nazwana jednostką tworzącą kolonię trzustki (PCFU). PCFU, gdy są hodowane w mysim teście kolonii zawierającym ECM, dają początek koloniom torbielowatym, które są nazywane koloniami "pierścieniowymi" 7. Po dodaniu agonisty Wnt, R-spondyny1, do mysiej kultury zawierającej ECM, niektóre kolonie pierścieniowe przekształcają się w "gęste" kolonie 7. W tym artykule te dwa typy kolonii hodowanych w mysiej kulturze ECM są zbiorczo określane jako kolonie "pierścieniowe/gęste". Kiedy kolonie pierścieniowe / gęste są dysocjowane na zawiesinę pojedynczej komórki i ponownie posiewane do kultur zawierających hydrożel lamininy, powstają kolonie "endokrynne / acinarne" 7.

Korzystając z analiz pojedynczych kolonii, stwierdzono, że większość kolonii pierścieniowych/gęstych i endokrynologicznych/groniastych, zarówno z dorosłej (2-4 miesiące) 7,11, jak i młodej (1 tydzień) 9 mysich trzustek, wykazuje wszystkie trzy markery linii. Sugeruje to, że większość pochodzących PCFU jest trójsilna. W teście kolonii zawierającym mysie ECM, dorosłe mysie PCFU silnie samoodnawiają się i rozszerzają około 500 000 razy w ciągu 11 tygodni w hodowli 7. Mysi ECM preferencyjnie wspiera różnicowanie komórek przewodowych w stosunku do linii endokrynnych i zrazikowych, podczas gdy w obecności hydrożelu z lamininą mysie PCFU są zachęcane do preferencyjnego różnicowania się w komórki endokrynne i groniaste, a w mniejszym stopniu w linię przewodową 7,9,11. Co ważne, w hodowli hydrożelu z lamininą powstają komórki monohormonalne Insulina+Glukagon- które wydzielają insulinę w odpowiedzi na stymulację glukozą in vitro 7,9, co sugeruje dojrzałość funkcjonalną. Trójliniowy potencjał różnicowania 7,9 i samoodnawiania się 11 poszczególnych PCFU potwierdza się za pomocą mikromanipulacji pojedynczej komórki, tj. hodowli jednej komórki na studzienkę w celu utworzenia kolonii. Łącznie wyniki te dostarczają dowodów na to, że w poporodowej mysiej trzustce znajdują się samoodnawiające się, trójpotencjałowe, progenitorowe komórki, które wykazują aktywność w hodowli 3D.

Testy PCFU na myszach opisane w tym artykule pochodzą z wcześniejszego testu kolonijnego zaprojektowanego dla komórek progenitorowych zróżnicowanych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) 17. Protokół ten został szczegółowo udokumentowany w innej publikacji JoVE 18. Składniki i techniki hodowli wymagane do przeprowadzenia mysiego testu kolonii zawierającego ECM dla dorosłych PCFU są takie same, jak w przypadku progenitorów pochodzących z mESC 17,18. Dlatego te aspekty testu nie będą tutaj powtarzane; Zamiast tego omówione zostaną następujące procedury: 1) dysocjacja dorosłej trzustki i sortowanie komórek przewodowych CD133 + Sox9 / EGFP +, które wzbogacają PCFU od dorosłych myszy 7, 2) manipulacja pojedynczymi komórkami posortowanych komórek, 3) analizy pojedynczej kolonii za pomocą mikroprzepływowego qRT-PCR i barwienia immunologicznego całego wierzchowania oraz 4) dysocjacja kolonii do zawiesiny pojedynczej komórki i ponowne posiew do mysich testów kolonii ECM lub lamininy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Przestrzegamy powszechnie przyjętych standardów etycznych podczas prowadzenia badań, aby zapewnić jakość i integralność wyników. Eksperymenty na zwierzętach są prowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w City of Hope.

1. Przygotuj zawiesinę jednokomórkową z dorosłej mysiej trzustki

UWAGA: We wcześniejszych publikacjach 7,11 użyto myszy tła CD-1 lub B6; oba tła dały podobne wyniki. Transgeniczna linia myszy (oznaczona jako Sox9 / EGFP) ze wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji napędzanym przez loci Sox9 19,20 została stworzona na tle CD-1.

  1. Poddaj eutanazji od 3 do 5 dorosłych myszy za pomocą gazu CO2 przez 1-2 minuty lub do momentu ustania oddychania. Następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy na każdej myszy.
  2. Wypreparuj i przygotuj trzustkę.
    UWAGA: Przeprowadź sekcję myszy tak szybko, jak to możliwe po eutanazji. Jest to ważne, aby uniknąć samoczynnego trawienia trzustki z powodu zmian pośmiertnych.
    1. Wykonaj pionowe nacięcie na linii środkowej ściany brzucha myszy za pomocą nożyczek i otwórz jamę brzuszną. Znajdź śledzionę i użyj kleszczy, aby delikatnie ją podnieść. Przetnij nożyczkami tkankę łączną między śledzioną a płatem śledziony trzustki.
      1. Powtórz tę praktykę dla dwunastnicy i płatów żołądkowych trzustki. Umieścić tkanki trzustki na szalce Petriego na lodzie zawierającym zimny zmodyfikowany roztwór buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS), 0,1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz penicylinę i streptomycynę (P/S; kompletny roztwór oznaczony jako PBS/BSA).
    2. Usuń tkankę tłuszczową z trzustki pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy z cienką końcówką.
      UWAGA: Ma to kluczowe znaczenie dla zdrowia zdysocjowanych komórek trzustki w następujących krokach.
      1. (Opcjonalnie) Sprawdź trzustkę pod kątem zielonej fluorescencji pod stereomikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu wzbudzenia 488-509 nm, aby zapewnić ekspresję EGFP.
    3. W kapturze do hodowli tkankowej przepłukać tkankę trzy razy kolejno na trzech 100-milimetrowych szalkach Petriego zawierających 10 ml zimnego PBS/BSA.
  3. Generuj małe kawałki tkanek.
    1. Przenieść wypreparowaną trzustkę na suchą, sterylną szalkę Petriego, aby usunąć jak najwięcej PBS/BSA, i przenieść ją na inną suchą szalkę Petriego na lodzie.
    2. Przygotować PBS/BSA zawierającą DNazę I, dodając 2 μl roztworu podstawowego DNazy I (1 milion jednostek [m] /ml) na 1 ml PBS/BSA.
      UWAGA: Ten roztwór jest oznaczony jako PBS/BSA/DNaza I. Przygotuj ~200 ml tego roztworu na raz, co pokryje jeden eksperyment sortowania.
    3. Miel trzustkę za pomocą nożyczek sprężynowych przez 2-3 minuty lub do momentu, gdy tkanka będzie na drobne kawałki. Dodać 2-3 ml zimnego PBS/BSA/DNazy I do kawałków tkanek na szalce Petriego, aby je zawiesić.
    4. Przenieść kawałki tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Doprowadzić całkowitą objętość do 10 ml za pomocą PBS/BSA/DNazy l po odzyskaniu jak największej ilości tkanki.
  4. Trawią kawałki trzustki na przeważnie pojedyncze komórki.
    1. Dodać kolagenazę B (100 mg/ml bulionu) w stężeniu 350-450 μl/10 ml do kawałków tkanki i inkubować tkankę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 8 minut, mieszając co 3-4 minuty. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 16 1/2 G nabrać, a następnie rozpylić roztwór tkankowy po ściance probówki o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej (RT). Powtórz to siedem razy.
      UWAGA: Użyj wystarczającej siły, aby rozbić skupiska komórek, ale unikaj generowania pęcherzyków, które mogą zabić komórki.
    2. Umieścić probówkę z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 8 minut i mieszać, mieszając co 3-4 minuty. Strzykawkę strzykawkę w górę i w dół siedem razy, jak wspomniano powyżej, i umieścić próbkę (10 μl) roztworu tkankowego na suchej szalce Petriego. Obserwuj roztwór tkankowy pod odwróconym mikroskopem świetlnym z kontrastem fazowym z soczewką obiektywową 10X. Spodziewaj się, że obecne będą pojedyncze komórki i niektóre małe skupiska komórek.
    3. Od tego momentu należy obchodzić się z komórkami na lodzie, aby spowolnić lub zatrzymać aktywność kolagenazy. Dostosować objętość do 50 ml przy użyciu zimnego PBS/BSA/DNazy I. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 5 ml zimnego PBS/BSA/DNazy I za pomocą pipetora P1000.
  5. Przefiltrować, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek i przepłukać.
    1. Przefiltruj komórki przez kubek filtracyjny z siatki nylonowej o średnicy 70 μm, a następnie przez kubek filtracyjny z siatki nylonowej o średnicy 40 μm.
    2. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml zimnego PBS/BSA/DNazy I i policzyć komórki.
      UWAGA: W przypadku 2-4 miesięcznych myszy B6 lub CD-1 każda trzustka może wytwarzać odpowiednio ~ 5 lub 10 milionów komórek. Liczby te mogą się różnić u różnych eksperymentatorów. Jeżeli podczas liczenia zostanie stwierdzona nadmierna ilość resztek komórek, należy zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą zimnego PBS/BSA/DNazy I i odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Dostosować objętość zawiesiny komórek do stężenia 2 x 107 komórek/ml za pomocą zimnego PBS/BSA/DNazy I.

2. Sortuj komórki, aby wzbogacić przodków tworzących kolonie trzustki

UWAGA: Od myszy B6 komórki CD133 +, ale nie CD133, są wzbogacone o PCFU 7,9,11. Komórki CD133 + reprezentują ~ 13% wszystkich zdysocjowanych komórek trzustki po zastosowaniu wszystkich parametrów bramkowania11. Z myszy CD-1 komórki CD133 + Sox9-EGFP + zwykle reprezentują ~ 4% wszystkich komórek trzustki, a ta populacja komórek jest wzbogacona o PCFU 7. Sortowanie komórek CD133+Sox9/EGFP+ opisano tutaj.

  1. Barwić zdysocjowane komórki trzustki.
    1. Zablokuj całą zawiesinę jednokomórkową trzustki, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie, inkubując zawiesinę jednokomórkową z anty-mysim CD16/32 w końcowym stężeniu 10 μg/ml przez 5 minut na lodzie.
    2. Usunąć podwielokrotność 1 x 106 komórek (50 μl) w celu barwienia przeciwciałem kontrolnym izotypu, szczurzym IgG1 sprzężonym z biotyną w końcowym stężeniu 5 μg/ml, przez 20 minut na lodzie, wirując co 5-7 minut.
    3. Usunąć podwielokrotność 1 x 106 komórek (50 μl) i przechowywać na lodzie jako niezabarwioną kontrolę.
    4. Pozostałe komórki barwić pierwszorzędowym przeciwciałem anty-mysim CD133 sprzężonym z biotyną, w końcowym stężeniu 5 μg/ml, przez 20 minut na lodzie, wirując co 5-7 minut.
  2. Mycie komórek.
    1. Przemyć próbki kontrolne izotypu i próbki barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami, doprowadzając objętość do 1 ml za pomocą PBS/BSA/DNazy I i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten etap mycia.
    2. Zawiesić kontrolę izotypu i pierwszorzędowe próbki barwione przeciwciałami w PBS / BSA / DNaza I, tak aby końcowe stężenie wynosiło 2 x 107 komórek / ml.
  3. Wybarwić próbki kontrolne izotypu i pierwszorzędowe wybarwione przeciwciałami allofikocyjaniną znakowaną streptawidyną (STV) w stężeniu końcowym 2 μg/ml. Inkubować przez 15 minut na lodzie, mieszając co 5-7 minut.
  4. Mycie komórek i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI).
    1. Przemyć dwukrotnie próbki kontrolne izotypu i próbki barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami PBS/BSA/DNaza I, jak w kroku 2.2. Zawiesić komórki w PBS/BSA/DNazie I za pomocą DAPI (0,2 μg/ml stężenie końcowe). Końcowa objętość próbki kontrolnej izotypu powinna wynosić 0,5 ml.
      UWAGA: Upewnij się, że końcowa gęstość pierwotnej próbki barwionej przeciwciałami jest odpowiednia dla sortera, który ma być użyty. Stężenie 5 x 106 komórek/ml jest rutynowo stosowane do sortowania.
    2. Dostosuj objętość niebarwionych komórek do 0,5 ml za pomocą PBS/BSA/PS/DNaza I. Przefiltruj wszystkie komórki przez siatkę 20 μm przed sortowaniem i trzymaj komórki na lodzie w ciemności.
  5. Sortowanie komórek.
    1. Do sortowania należy używać dyszy o średnicy 80 μm lub większej.
      UWAGA: Mysie komórki endokrynne trzustki są podatne na stres fizyczny. Wydaje się jednak, że mysie PCFU nie są dotknięte stresem spowodowanym przejściem przez sorter 7.
    2. Pobieraj zdarzenia komórkowe i parametry analizy w sortowniku. Bramkowanie komórek dla obszarów rozproszenia do przodu i z boku, aby wykluczyć resztki komórek 7. Bramka dla szerokości rozproszenia do przodu i z boku, aby wykluczyć dublety komórek. Bramka wykluczająca martwe komórki DAPI+ 7. Wybierz parametry bramkowania dla sygnałów EGFP i CD133-APC na podstawie wartości z komórek kontrolnych izotypu (rysunek 1).
    3. Zebrać posortowane komórki do 5 ml probówek polistyrenowych zawierających 1,5 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą (FCS). Odwirować posortowane populacje przy 400 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w małej objętości (~200 μl) DMEM/F12 lub PBS/BSA/DNazy I uzupełnionej 5% FCS. Trzymaj komórki na lodzie do czasu użycia.
  6. Policz liczbę komórek CD133+Sox9-EGFP+ uzyskanych z sortera. Pobrać próbkę komórek o objętości 10 μl i policzyć je za pomocą hemacytometru, aby określić gęstość komórek.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie hemacytometru, ponieważ zliczanie z sortera jest często niewiarygodne.

3. Umieść posortowane komórki w teście kolonijnym zawierającym mysie białka ECM

UWAGA: Proszę zapoznać się ze szczegółowymi protokołami posiewu komórek do mysiego testu kolonijnego zawierającego ECM w innej publikacji JoVE 18.

  1. Przygotuj pożywki hodowlane.
    1. Przygotować pożywkę zawierającą pożywkę DMEM/F12, 1% (wag./v) metylocelulozę, 5% (v/v) mysich białek ECM, 50% (v/v) kondycjonowaną pożywkę z komórek trzustkowych pochodzących z mESC, 5% (v/v) FCS, 10 mmol/l nikotynamidu, 10 ng/ml ludzkiej rekombinowanej aktywiny B, 0,1 nmol/L eksendyny-4 i 1 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-A. Metody wytwarzania kondycjonowanego podłoża są szczegółowo opisane w innym miejscu 18.
    2. Dodać 750 ng/ml RSPO-1 do pożywki, jeśli pożądane jest tworzenie gęstych kolonii.
    3. Inkubować mysią kulturę białka ECM w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 tygodnie.

4. Hoduj posortowane komórki po 1 komórce na studzienkę

UWAGA: Poniższe procedury mają zastosowanie do manipulowania pojedynczymi komórkami za pomocą pipet ręcznych i ustnych. Alternatywnym podejściem jest zakup mikromanipulatora. Typowy mikromanipulator zawiera odwrócony mikroskop z napędzaną joystickiem, zmotoryzowaną platformą.

  1. Przygotuj szklane pipety Pasteura.
    1. Za pomocą palnika Bunsena wyciągnij końcówkę szklanej pipety Pasteura na drobny punkt (~30 μm przy otworze). Szklane pipety Pasteura powinny być wyposażone w bawełniany korek, który tworzy barierę dla przepływu powietrza przez operatora.
    2. Pipety Pasteura ze szkła płomieniowanego należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut w celu sterylizacji.
  2. Przygotuj 96-dołkowe płytki do hodowli.
    1. Przygotować zimną, półstałą pożywkę hodowlaną zgodnie z wcześniej opisanym protokołem 18.
    2. Dozować pożywkę do wewnętrznych dołków 96-dołkowej płytki o płaskim dnie o niskim poziomie wiązania w temperaturze 100 μl/basenik za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Napełnij zewnętrzne studzienki sterylną wodą, aby utrzymać wilgotność.
    3. Umieść naczynie hodowlane na lodzie do czasu użycia.
  3. Przygotuj posortowane komórki.
    1. Dodaj ~ 6,000 komórek zebranych z sortera do 2,5 ml końcowej objętości DMEM/F12/PS zawierającej 10% FCS i 1% metylocelulozy w probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml. Wstrząśnij energicznie, aby wymieszać składniki. Odczekaj 5 minut lub do momentu, gdy bąbelki uniosą się na górę tuby. Ten krok nie musi być wykonywany na lodzie.
    2. Dozować roztwór komórek do dwóch szalek o średnicy 35 mm w ilości 1 ml na miskę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 18 1/2 G.
    3. Rozprowadź roztwór komórkowy w naczyniu, delikatnie kołysząc naczynie ręką. Nie dopuścić do tego, aby półstałe podłoże dotarło do brzegu szalki o średnicy 35 mm, ponieważ pojedyncze komórki na brzegu studzienki nie mogą być wyraźnie obserwowane za pomocą mikroskopu ze światłem odwróconym.
  4. Przygotuj obszar roboczy wokół mikroskopu.
    1. Sporządzić roztwór zawierający pożywkę DMEM/F-12 i 1% metylocelulozy bez żadnych komórek (pożywka 'bezkomórkowa') i dozować roztwór (jak opisano w ppkt 4.3.2) do dwóch szalek Petriego o średnicy 35 mm (1 ml na szalkę).
    2. Oczyść i przetrzyj obszar roboczy wokół mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym 70% roztworem alkoholu.
  5. Zmontuj pipetę z ustnikiem.
    1. Wybierz sterylną szklaną pipetę Pasteura, która została przygotowana w kroku 4.1. Przymocuj dużą końcówkę plastikowej końcówki pipety o pojemności 1 ml do górnej części szklanej pipety Pasteura. Przymocuj małą końcówkę plastikowej końcówki pipety o pojemności 1 ml do jednego końca cienkościennej gumowej rurki, a ustnik do drugiego końca probówki. Użyj tej samej szklanej pipety do pobrania wielu komórek z tej samej grupy.
    2. Pobrać szklaną >
  6. Zaznacz pojedynczą komórkę.
    1. Umieść naczynie o średnicy 35 mm zawierające posortowane komórki na stoliku mikroskopu i zdejmij pokrywkę.
    2. Znajdź komórki za pomocą soczewki obiektywowej 10X i skup się na odpowiedniej komórce, która ma zostać pobrana.
    3. Znajdź i umieść otwór końcówki pipety obok interesującej Cię komórki. Zastosuj ssanie przez usta.
      UWAGA: Ruch ogniwa powinien być dość powolny, aby nie było ryzyka utraty ogniwa podczas późniejszego procesu. Ruch kuwety wchodzącej do otworu pipety powinien być widoczny. Jeśli przepływ przepływa zbyt szybko, zmień pipetę na pipetę z węższym otworem.
  7. Umieść pojedynczą komórkę w dołku hodowlanym.
    1. Gdy komórka znajdzie się w pipecie, użyj języka, aby zatrzymać przepływ, blokując otwór ustnika. Zatrzymaj się na chwilę przed wyjęciem końcówki z półstałego podłoża, aby upewnić się, że półstałe podłoże przestało płynąć.
    2. Umieścić końcówkę pipety w studzience w 96-dołkowej płytce przygotowanej w kroku 4.2. Powoli wypchnij komórkę, delikatnie w ustnik. Zaznacz dołek po zdeponowaniu komórki, aby uniknąć platerowania dwóch komórek w studzience.
  8. Upewnij się, że pojedyncza komórka jest umieszczona w dołku hodowlanym.
    1. Umieścić końcówkę pipety w podłożu "bezkomórkowym" przygotowanym w kroku 4.4.1. Obserwując otwór końcówki pod mikroskopem, wypchnij pozostały roztwór półstały. Należy się spodziewać, że żadna komórka nie wypłynie z końcówki pipety.
    2. Aby dokładnie sprawdzić, znajdź miejsce w dołku hodowlanym, w którym wszczepiono pojedynczą komórkę.
  9. Hodować pojedyncze komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez okres do 3 tygodni.

5. Wybierz poszczególne kolonie z kultury półstałej do mikroprzepływowej analizy qRT-PCR

UWAGA: Trzy tygodnie po posiewie posortowanych komórek CD133 + Sox9 / EGFP + do mysiego testu kolonii zawierającego ECM, tworzą się kolonie pierścieniowe lub gęste 7 (ryc. 2). Kiedy kolonie pierścieniowe / gęste są dysocjowane do zawiesiny pojedynczej komórki i ponownie posiane w kulturze hydrożelu lamininy, kolonie endokrynne / ziarniaste są generowane po około jednym tygodniu 7 (ryc. 2). Aby określić skład linii każdej kolonii, stosuje się mikroprzepływową analizę qRT-PCR w celu wykrycia ekspresji markerów linii 7. W celu wstępnego amplifikacji kolonia jest mieszana w mieszance głównej zawierającej mieszankę sondy TaqMan, bufor reakcyjny i SuperScript III 21. Układ 48.48 jest następnie wykorzystywany do mikroprzepływowych reakcji PCR 21.

  1. Przygotuj mieszaninę PCR do wstępnego amplifikowania zawierającą 48 sond.
    1. Odpipetować 1,5 μl każdej sondy TaqMan (20x zapas) w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 78 μl buforu TE, aby dostosować objętość do 150 μl.
  2. Przygotuj mieszankę główną, postępując zgodnie z protokołami producenta 21.
  3. Umieścić 9 μl mieszanki wzorcowej w każdej cienkościennej probówce reakcyjnej o pojemności 0,2 ml nadającej się do PCR i powtórzyć ten krok dla maksymalnie 48 probówek.
  4. Zbieraj pojedyncze kolonie z kultury półstałej.
    UWAGA: Kolonie pierścieniowe/gęste są większe niż kolonie endokrynologiczne/groniaste, o średnicach od ~50 do 400 μm 9,11. W związku z tym pojedyncze pierścienie/gęste kolonie są pobierane za pomocą pipetora P10 wyposażonego w końcówkę pipety o pojemności 10 μl, która jest wygięta w zakrzywiony kształt. Aby wybrać małe kolonie endokrynologiczne/groniaste (rysunek 2), patrz krok 4.
    1. Zlokalizuj interesującą Cię kolonię pod dużym powiększeniem (np. soczewkę obiektywową 20X), zmniejsz powiększenie i zaaspiruj kolonię. (Opcjonalnie) Na tym etapie wykonaj obraz kolonii z kontrastem fazowym, aby udokumentować widoczne cechy kolonii.
    2. Przenieść kolonię do probówki do PCR zawierającej 9 μl mieszanki wzorcowej.
    3. Wybierz następną kolonię. W sumie można przeanalizować do 45 kolonii w jednym cyklu PCR, pozostawiając 3 miejsca na kontrole.
  5. Ekstrakcja RNA i synteza cDNA ze wstępną amplifikacją.
    1. Energicznie wirować próbki przed przeprowadzeniem reakcji termicznej.
    2. Reakcje cykli termicznych należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta 21. Kolonie pierścieniowe/gęste wymagają 14 cykli, kolonie endokrynologiczne/groniaste wymagają 16-20 cykli, a pojedyncze komórki wymagają 22 cykli.
      UWAGA: CDNA przed amplifikacją można przechowywać w temperaturze -20 °C przed analizą mikroprzepływową PCR.
  6. Przeprowadzaj kolejne reakcje PCR, używając chipa mikroprzepływowego, zgodnie z instrukcją producenta 21.

6. Barwienie immunologiczne całego wierzchowca kolonii

  1. Zbieraj i naprawiaj kolonie.
    1. Zebrać kolonie pod mikroskopem, jak w krokach 4 lub 5.4, i dodać je do 4% roztworu paraformaldehydu. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
    2. Przemyć kolonie 1X PBS dwukrotnie przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Utrwalone kolonie przechowywać w temperaturze 4 °C w 1,5 ml probówkach zamkniętych parafiną.
  2. Zabarwić kolonie przeciwciałami.
    1. Przenieś kolonie do jednego dołka na 96-dołkowej czarnej płytce z przezroczystym dnem zawierającym 200 μl buforu blokującego (5% surowicy osła i/lub kozy, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS). Inkubować O/N w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
    2. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do wcześniej określonego stężenia (np. 1:500 dla przeciwciała anty-Mucyny 1 chomika) za pomocą buforu blokującego. Przenieść kolonie do czystej studzienki z 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować O/N w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Umyj kolonie 3 razy PBS zawierającym 0,1% Tween 20. Przenieś kolonie do nowej studzienki z 200 μl 1x PBS/0,1% Tween 20 przez 10 minut w temperaturze pokojowej dla każdego przemycia.
    3. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe do wcześniej określonego stężenia (np. 1:2 000 dla przeciwciała przeciwko chomikowi ormiańskiemu kóz) za pomocą buforu blokującego. Trzymaj roztwór w ciemności. Przenieść kolonie do czystych studzienek zawierających 200 μl przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyć kolonie 3 razy za pomocą PBS/0,1% Tween 20, jak w kroku 6.2.2.
  3. Przeciwdziałaj plamom kolonii za pomocą DAPI i wizualizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej.
    1. Przenieść kolonie do studzienek z PBS zawierającym 300 nM DAPI i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś kolonie zabarwione DAPI na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem w celu wizualizacji. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu kolonii, aby zapobiec parowaniu.
    3. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby uchwycić obrazy. Aby zobrazować barwienie DAPI, użyj dwufotonowej długości fali wzbudzenia 730-950 nm. Użyj lasera argonowego o długości fali 458 nm do wzbudzenia fluorochromów o długości fali emisji 519 i 561 nm. Użyj lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm, aby wzbudzić fluorochromy o długości fali emisyjnej 665 nm.

7. Dysocjacja i ponowne przeszczepienie pierwotnych pierścieni/gęstych kolonii na wtórne testy kolonii

UWAGA: Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. W miarę możliwości należy unikać szoku zimnego dla komórek w tej procedurze, takiego jak umieszczanie komórek na lodzie lub mycie komórek zimnym PBS/BSA. Takie praktyki zmniejszają żywotność ponownie posianych komórek.

  1. Przygotuj rozwiązania.
    1. Bufor do płukania w cieple (DMEM/F12; P/S; 0,1% BSA) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Rozgrzać 96-dołkową płytkę (płaskie dno; niskie wiązanie) w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Dodaj 100 μl 100% FCS do jednego dołka płytki i 100 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do drugiego dołka.
  2. Zbieraj kolonie.
    1. Zbierz i połącz łącznie 20 lub więcej kolonii pierścieniowych/gęstych w kulturach podstawowych, używając końcówek do pipet o pojemności 10 μl, zgodnie z opisem w kroku 5.4.
    2. Umieścić kolonie w ciepłym (co najmniej RT) buforze do przemywania (~1 000 μl) w probówce o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
  3. Dysocjuj kolonie na zawiesiny jednokomórkowe za pomocą trypsyny.
    1. Przenieść pozostałą objętość (20 μl lub mniej), która zawiera kolonie, do studzienki zawierającej ciepły roztwór trypsyny (przygotowany w 7.1).
    2. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C (nie w łaźni wodnej) przez 1,5 minuty. Wyjąć płytkę i kilkakrotnie odpipetować kolonie. Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 1,5 minuty.
    3. Wyjmij płytkę i pipetę w górę i w dół jeszcze kilka razy, aby rozbić kolonie. Sprawdź pod mikroskopem, czy kolonie zostały rozproszone głównie w zawiesinie jednokomórkowej. Unikaj nadmiernego trawienia kolonii.
  4. Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając FCS.
    1. Przenieś 100 μl ciepłego FCS do studzienki, w której znajdują się komórki. Pipetuj kilka razy w górę i w dół. Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 000 μl ciepłego buforu do płukania. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Umyć dwukrotnie ciepłym buforem.
    3. Ponownie zawiesić komórki w ~200 μl buforu lub pożywki hodowlanej.
  5. Policz liczbę komórek za pomocą hememytometru. Utrzymuj zawiesinę ogniw w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie umieścić zdysocjowane komórki w drugorzędowych testach kolonijnych zawierających mysie białka ECM (5% v/v) lub hydrożel z lamininą (100 μg/ml) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Do ponownego posiewu komórek w mysie białka ECM użyj 2,500-5,000 komórek na studzienkę i hoduj przez 2-3 tygodnie. Do ponownego wprowadzenia do hodowli hydrożelu z lamininą należy użyć 10 000-25 000 komórek na studzienkę i hodować przez 7-12 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dorosłe komórki progenitorowe trzustki można wzbogacić za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (Rysunek 1). Linia myszy transgenicznych Sox9/EGFP użyta w tej pracy została po raz pierwszy stworzona w ramach projektu GENSAT Brain Atlas Project 19, a reporter EGFP znajduje się pod kontrolą bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego sekwencje około 75 kb powyżej i około 150 kb poniżej genu Sox9 20. U tych myszy EGFP wydajnie i specyficznie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj testy kolonii trzustki i analizy pojedynczych kolonii zostały zainspirowane testami kolonii krwiotwórczych zawierających metylocelulozę, które odegrały główną rolę w rozszyfrowaniu biologii hematopoetycznych komórek progenitorowych w ciągu ostatnich dziesięcioleci 23. W tych testach (ryc. 5) zdysocjowane komórki trzustki są posiewane w półstałe podłoża zawierające metylocelulozę z odpowiednimi czynnikami wzrostu i białkami ECM, które wspierają tworzenie kolonii pierścieniowych, g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Lucy Brown i Alexandrowi Spalla z Analitycznego Rdzenia Cytometrii w City of Hope za pomoc w sortowaniu. Praca ta jest częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01DK081587 i R01DK099734 dla H.T.K. oraz U01DK089533 dla A.D.R., a także przez grant National Science Foundation NSF-DMR-1206121 i grant California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 dla D.A.T. Wsparcie z Instytutu Inżynierii Molekularnej Josepha J. Jacobsa dla Medycyny w Caltech dla D.A.T., a te od Oxnard Foundation i Ella Fitzgerald Foundation do H.T.K. są również wdzięczne.

Finansowanie: Ta praca jest częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01DK081587 i R01DK099734 dla H.T.K., a U01DK089533 dla A.D.R., oraz przez grant National Science Foundation NSF-DMR-1206121 i grant California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 dla D.A.T. Wsparcie od Joseph J. Jacobs Institute for Molecular Engineering for Medicine w Caltech dla D.A.T., a te od Oxnard Foundation i Ella Fitzgerald Foundation do H.T.K. są również wdzięczne. Badania opisane w tej publikacji obejmowały prace wykonane w Analytical Cytometry Core and Light Microscopy Digital Imaging Core, wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA33572.

Sponsor badania: Sponsor nie brał udziału w projektowaniu, zbieraniu, analizie lub interpretacji danych w badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysie białka ECM (Matrigel)Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)354230Zapasy utrzymywane na poziomie -20 ° C
Laminin Hydrogeldostarczony przez Davida Tirrella (Pasadena, CA, USA)Zapasy utrzymywane na poziomie -20 ° C
MetylocelulozaShinetsu Chemical (Tokio, Japonia)1,500 centypuazów (dynamiczna jednostka lepkości równa 15 g/cm/s) (wysoka lepkość)
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineMediatech (Manassas, VA, USA)21-031-CV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco (Grand Island, NY, USA)15070-063
50 ml Flacon Fiolka stożkowaCorning Inc. (Corning, Nowy Jork, USA)352070
100 mm x 20 mm Naczynie do hodowli zawiesinowychCorning Inc. (Corning, NY, USA)430591
Albumina surowicy bydlęcejSigma (St. Louis, MO, USA)A8412
Penicylina/StreptomycynaGibco (Grand Island, NY, USA)15070-063
DNase1Calbiochem (Darmstadt, Niemcy)260913
Kolagenaza BRoche (CH-4070, Bazylea, Szwajcaria),11088831001Stan magazynowy na poziomie -20 ° C
Anti-mouse CD16/32Biolegend (San Diego, CA, USA)101310niska endotoksyna, bez azydków
PE-Cy7 Rat IgG2a i kappa; Isotype ControlBiolegend (San Diego, CA, USA)400522
Rat IgG1 κ Kontrola izotypueBioscience (San Diego, CA, USA)13-4301-82
Anty-CD133-BiotynaeBioscience (San Diego, CA, USA)13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7Biolegend (San Diego, CA, USA)113812
Streptawidyna-AllofikocyjaninaBiolegend (San Diego, CA, USA)405207
4',6-Diamidino-2-fenyloindolInvitrogen ( Waltham, Massachusetts,  USA)3571Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -20 ° C
Antymucyna 1Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)HM-1630-P1
Dylight 649 Koza anty-ormiańska chomikJackson Immuno (West Grove, PA, USA)127-495-160
Zmodyfikowane orło Dulbecco: mieszanka składników odżywczych F-12Mediatech (Manassas, VA, USA)10-092-CV
Hodowla płodowej surowicy bydlęcejTissure Biologicals (Long Beach, CA, USA)101Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -20 ° C
Tris Kwas etylenodiaminotetraoctowyTEKnova (Hollister, CA, USA)T0221
Rneasy Micro KitQiagen (Venlo, Holandia)74004
Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTecQiagen (Venlo, Holandia)205310
CellsDirect One-Step qRT-PCRKit Ambion/Invitrogen (Grand Island, NY, USA)11753-100
ParaformaldehydSanta Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)SC-281692
Surowica koziaJackson Immuno (West Grove, PA, USA)005-000-121Zapas utrzymywany na poziomie -20 i #176; C
Surowica osłaJackson Immuno (West Grove, PA, USA)0017-000-121Zapas utrzymywany na poziomie -20 i #176; C
Triton X-100Sigma (St. Louis, MO, USA)T9284
TrypsinSigma (St. Louis, MO, USA)T-4799
Kwas etylenodiaminotetraoctowyInvitrogen (Waltham, MA,  USA)15575-020
Trypsin-EDTALife Technologies (Waltham, MA, USA)25200-056
Sterylna wodaGibco (Grand Island, NY, USA)15230-147Pipeta Pasteura klasy biologii molekularnej
Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)13-678-8B
40 μ m Siatka filtracyjnaFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)08-771-1
70 μ m siatka filtracyjnaFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)08-771-2
TC Plate 96 Well SuspensionSarstedt83.3924 (poprzednio 83.1835)
cc StrzykawkaBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)309659
10 cc StrzykawkaBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)301604
48.48 Dyanmic Array ChipFluidigm (San Francisco, Kalifornia, Kalifornia, USA)BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Próbka dynamicznej tablicy & Zestaw odczynników do ładowania testuFluidigm (San Francisco, CA, USA)85000800
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (Grand Island, NY, USA) 4304437
Monolaurynian glikolu polietylenowego sorbitanuSigma (St. Louis, MO, USA)P7949
Naczynie ze szklanym dnemMatTek (Ashland, MA, USA)P35G-1.5-14-CSzalka Petriego 35 mm ze szklanym dnem
Ustnik/rurka gumowaRenova Life Inc. (College Park, MD, USA)MP-SET
NicotinamideSigma (St. Louis, MO, USA)N0636Zapasy utrzymywane na poziomie -20 i #176; C
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)293-VEZapasy utrzymywane na poziomie -80 ° C
Activin BR& D Systems (Minneapolis, MN, USA)659-ABStan magazynowy utrzymywany na poziomie -80 ° C
Extendin 4Sigma (St. Louis, MO, USA)E7144Zapasy utrzymywane na poziomie -20 ° C
Rspondin-1R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)3474-RSStan magazynowy utrzymywany na poziomie -80 ° C
Falcon 5 ml polistyrenowa tubka z okrągłym dnemCorning Inc. (Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone)352054
Igła PrecisionGlide 18 G x1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone)305196
Igła PrecisionGlide 16 G x 1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone)305198
Ultra-niska powierzchnia mocowania Costar 24-dołkowa płaska płyta denna Corning Inc. (Corning, NY, Stany Zjednoczone)3473
Costar 96 płyta studzienkowaCorning Inc. (Corning, NY, Stany Zjednoczone)3603Płaskie, przezroczyste dno z pokrywką. polistyren Mikropłytki pokryte TC
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Mikroskop odwróconyCarl Zeiss AG (Oberkochen, Niemcy)
Biomark HD Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell SorterBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)
PBS/BSA1x PBS
0,1% (wag./obj.) BSA
PenStrep (49 jednostek/ml penicyliny, 49 μ g/ml Streptomycyny)
PBS/BSA/Dnaza11x PBS
0,1% (wag./obj.) BSA
PenStrep (49 jednostek/ml penicyliny, 49 μ g/ml Streptomycyny)
Dnaza 1 (2,400 jednostek/ml na trzustkę)
1

Bibliografia

  1. Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
  2. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  3. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
  4. Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
  5. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  6. Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
  7. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  8. Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
  9. Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
  10. Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
  11. Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
  12. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
  13. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  14. Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940(2013).
  15. Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
  16. Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
  17. Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
  18. Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148(2011).
  19. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  20. Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
  21. Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
  22. Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
  23. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
  24. Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
  25. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  26. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
  27. Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
  28. Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki progenitorowe trzustkitesty z metylocelulozCD133 Sox9 EGFPmikrofluidyczna qRT PCRimmunobarwienie ca ych preparat wsamoodnowienier nicowanie wieloliniowebia ka macierzy zewn trzkom rkowejmikroskopia konfokalna
In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.