Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne organoidy jelitowe są cennym modelowym systemem, który ma potencjał, aby znacząco wpłynąć na dziedzinę immunologii błony śluzowej. Jednak złożoność charakterystyki wzrostu organoidów niesie ze sobą istotne zastrzeżenia dla badacza. W szczególności wzorce wzrostu każdego pojedynczego organoidu są bardzo zmienne i tworzą niejednorodną populację komórek nabłonkowych w hodowli. Przy takich zastrzeżeniach powszechnych praktyk hodowli tkankowych nie można po prostu zastosować do systemu organoidowego ze względu na złożoność struktury komórkowej. Liczenie i posiastanie wyłącznie na podstawie liczby komórek, co jest powszechne w przypadku indywidualnie oddzielonych komórek, takich jak linie komórkowe, nie jest niezawodną metodą dla organoidów, chyba że zastosuje się jakąś technikę normalizacji. Normalizacja do całkowitej zawartości białka jest złożona ze względu na rezydentną matrycę białkową. Te cechy pod względem liczby komórek, kształtu i typu komórek powinny być brane pod uwagę przy ocenie zawartości wydzielanej z masy organoidu. Protokół ten został opracowany w celu nakreślenia prostej procedury hodowli i leczenia organoidów jelita cienkiego patogenami mikrobiologicznymi i wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP). Podkreślono również techniki normalizacji, które należy zastosować, gdy analiza białek jest przeprowadzana po takim wyzwaniu.
Wprowadzenie
Zdolność do zbierania i hodowli pierwotnych organoidów została opisana dla jelita cienkiego, okrężnicy, trzustki, wątroby i mózgu i stanowi ekscytujący postęp w zrozumieniu bardziej fizjologicznie reprezentatywnych zjawisk dla biologii tkanek1-5. Pierwsze metody opisujące hodowlę i utrzymanie organoidów w jelicie cienkim zostały opisane przez Sato i wsp. z laboratorium Hansa Cleversa1. Przed tą metodą pobieranie i hodowla pierwotnych komórek nabłonka jelitowego okazywały się ograniczone i nieskuteczne w podtrzymywaniu wzrostu komórek nabłonka. Metody obejmowały dysocjację tkanki poprzez inkubację z enzymami, takimi jak kolagenaza i dyspaza, co ostatecznie doprowadziłoby do wzrostu mieszanych pierwotnych komórek fibroblastów6. Warunki te byłyby również ograniczone czasowo w utrzymaniu hodowli komórek nabłonkowych. Uformowałaby się minimalna lub żadna nisza komórek nabłonkowych, ponieważ komórki nabłonkowe weszłyby w apoptozę z powodu braku odpowiednich czynników wzrostu lub utraty integralności kontaktu, co określa się mianem anokis7. Pojawienie się systemu hodowli organoidów 3D zapewniło metodę hodowli pierwotnych komórek jelitowych zawierających spektrum typów komórek jelitowych w trwałej hodowli1. Te organoidy nabłonkowe mają przewagę nad liniami komórkowymi, ponieważ składają się z kilku zróżnicowanych komórek i lepiej naśladują narząd, z którego pochodzą in vivo8. Proces ostatecznie "wyhodowania mini jelita w naczyniu" okazał się cennym narzędziem do oceny reakcji nabłonka jelitowego na różne bodźce. Badanie interakcji pierwotnych komórek jelitowych z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami mikrobiologicznymi (PAMP) jest istotne dla dziedziny immunologii, ponieważ te wzorce molekularne mogą regulować różne reakcje zarówno gospodarza, jak i drobnoustroju9. Badacze mogą teraz nie tylko badać te interakcje z organoidami myszy, ale mogą być one również hodowane od ludzi2. Technologia ta ma potencjał, aby radykalnie zmienić medycynę spersonalizowaną i kuszące jest spekulowanie na temat postępów, które ta technika umożliwi w najbliższej przyszłości.
Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie protokołu do hodowli, ekspansji i leczenia organoidów jelitowych za pomocą różnych bodźców. Takie bodźce mogą ostatecznie obejmować szczepionki, bakteryjne PAMP, żywe patogeny, leki żołądkowo-jelitowe (GI) i przeciwnowotworowe. Izolacja i hodowla organoidów jelitowych myszy została zaadaptowana z Sato i wsp. Chociaż istnieją niewielkie odchylenia od oryginalnej metody, produkt końcowy, jakim jest kultura organoidowa, jest nadal osiągany przy przestrzeganiu tego protokołu. Metoda ta koncentruje się na opisie odpowiedniej techniki prawidłowej normalizacji podczas pracy z niejednorodnymi strukturami komórkowymi, co należy wziąć pod uwagę przy przeprowadzaniu testu na podstawie liczby komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie badania zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC Virginia Tech
1. Przygotuj pożywkę kondycjonowaną R-Spondin1 z linii komórkowej HEK293T-RSPo1
- Wytwarzanie komórek HEK293T-Rspondin1 zostało wcześniej opisane10. Komórki wydzielające HEK293T-Rspondin1 nasienne przy 5-10% zbiegu, około 8 x 10 5-1,7 x 106 komórek, w kolbie T-175 z 40 ml 1x Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) jako pożywka wzrostowa i inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .
UWAGA: Pożywki wzrostowe dla komórek wydzielających HEK293T-Rspondin1 będą służyć jako pożywki kondycjonowane R-spondyną1. R-spondin1 można alternatywnie nabyć w postaci rekombinowanego czynnika wzrostu stosowanego w końcowym stężeniu 500 ng/ml. - Hoduj komórki HEK293T-Rspondin1 przez siedem dni lub do osiągnięcia 95% zbiegu określonego za pomocą mikroskopii jasnego pola. Zebrać 40 ml kondycjonowanej pożywki i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wyrzucić kolbę T-175 z komórkami wydzielającymi HEK293T-Rspondin1.
- Odwirować probówkę zawierającą kondycjonowane podłoże o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych. Zebrać supernatant, nazwany pożywką kondycjonowaną R-spondyną1, i podwielokrotność do probówek o pojemności 15 ml. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
UWAGA: Po rozmrożeniu pożywka kondycjonowana R-Spondin1 może być przechowywana do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie pożywek i odczynników do zbioru krypt jelita cienkiego
- Na jeden dzień przed zbiorem zamrożoną matrycę białkową umieścić na lodzie i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C. Autoklaw Nożyczki preparacyjne, kleszcze i szkiełka podstawowe, które będą używane do zbioru krypt.
- Następnego dnia zacznij od przygotowania 40 ml organoidowych pożywek wzrostowych zawierających suplementy i czynniki wzrostu, dodając stężenia podstawowe do 40 ml 1x DMEM/F-12. Pożywki zawierają 10 mM kwasu2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowego (HEPES) - 400 μl, 1x suplement glutaminy - 400 μl, 1x B27 bez witaminy A - 400 μl, 1x N2 - 200 μl, 1 mM N-acetylo-cysteiny - 40 μl, 100 ng/ml m-Noggin - 40 μl, 50 ng/ml m-EGF - 4 μl i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC do czasu użycia. Podgrzać 15 ml porcji R-spondyny1 do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Ogrzewać trzy sterylne płytki 24-dołkowe do temperatury 37 °C przez co najmniej 30 minut, umieszczając je w inkubatorze. Przygotować 50 ml na mysz 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) + 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i schłodzić do 4 °C. Przygotować 100 ml na mysz 1x PBS zawierający 10% FBS i schłodzić do 4 °C.
3. Zbieranie krypt jelita cienkiego Mus musculus do hodowli organoidów1
- Poświęć samca myszy C57B6/J w wieku 6-12 tygodni, wychowanego na standardowej karmie dla gryzoni i wodzie dostępnej ad libitum zgodnie z wytycznymi instytucji. Eutanazja przez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
UWAGA: Tuszę należy przechowywać na lodzie do czasu pobrania tkanek i przeprowadzić pobieranie tkanek w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko zakażenia.
Uwaga: Samiec lub samica myszy może być użyta do generowania organoidów. - (Opcjonalnie) Ogol mysz, aby usunąć sierść przed zanurzeniem w 70% etanolu. Zanurz mysz w 70% etanolu na 2 minuty i przypnij kończyny do deski do przypinania tak, aby grzbietowa strona myszy dotykała deski.
- Użyj wstępnie wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby wykonać nacięcie w linii środkowej brzusznej części myszy. Wykonaj nacięcie na genitaliach biegnąc czaszką do podstawy szyi. Otwórz nacięcie skóry z boku za pomocą pęsety i przypnij skórę do deski do przypinania, aby odsłonić otrzewną.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej otrzewnej brzucha za pomocą nożyczek preparacyjnych i złóż otrzewną kleszczami na boki i przypnij do deski do przypinania, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć narządów jamy brzusznej. - Usuń jelito cienkie z jamy brzusznej za pomocą kleszczy preparacyjnych i nożyczek, przecinając bliższe połączenie jelita cienkiego połączone z żołądkiem i dystalne połączenie połączone z kątnicą. Umieść jelito cienkie na sterylnej szalce Petriego zawierającej 10 ml lodowatego zimnego 1x PBS.
- Przepłukać zawartość znajdującą się w świetle jelita cienkiego lodowatym środkiem 1x PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Powtarzaj ten krok, aż zanieczyszczenia w świetle jelita cienkiego zostaną usunięte.
- Przeciąć jelito cienkie nożyczkami preparacyjnymi na 3-4 paski o mniej więcej równej długości i ułożyć paski wzdłuż na nowej sterylnej szalce Petriego. Dla każdego paska włóż krawędź tnącą nożyczek preparacyjnych do światła jelita cienkiego, aby wykonać nacięcie na całej długości paska. Użyj kleszczy, aby bocznie rozchylić nacięcie, aby odsłonić światło jelita cienkiego.
- Użyj sterylnego szkiełka szkiełkowego, aby delikatnie zeskrobać kosmki na powierzchni światła jelita cienkiego. Pokrój jelito cienkie na paski o długości 1-2 cm nożyczkami preparacyjnymi i przenieś te paski do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego 1x PBS.
- Delikatnie wymieszać zawartość, odwracając probówkę stożkową o pojemności 50 ml i pozwolić, aby zawartość tkanki osiadła na dnie probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Odessać 1x PBS i powtórzyć to trzy razy, myjąc tkankę 10 ml lodowatego 1x PBS. Podczas końcowego płukania pozostaw stożkową probówkę na lodzie na 10 minut, zawierającą 10 ml 1x PBS i segmenty tkanki jelita cienkiego.
- Odessać 1x PBS i dodać 25 ml 1x PBS + 2 mM EDTA. Umieścić na bujanej platformie w temperaturze 4 °C lub w wiaderku na lód na 45 minut. Podczas inkubacji tkanki oznacz sześć stożkowych probówek o pojemności 15 ml jako "frakcja #1-6".
- Po inkubacji pozwól, aby zawartość tkanki osiadła na dnie probówki i odessać 1x PBS + 2 mM EDTA. Dodaj 10 ml 1x PBS +10% FBS i energicznie wstrząśnij probówką ręcznie 10 razy.
- Pozwól, aby zawartość tkanki osiadła na dnie probówki. Usunąć i przenieść supernatant do probówki o pojemności 15 ml stożkowej oznaczonej jako "frakcja 1". Powtórzyć etap wytrząsania 1x PBS + 10% FBS (3.11) pięć razy i przenieść zawartość supernatantu w kolejności do odpowiednio oznakowanej probówki z frakcją.
- Wirować przy 125 x g przez 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w 5 ml wstępnie podgrzanych 1x DMEM/F-12, bez dodatku czynników wzrostu.
- Wirować przy 78 x g przez 2 min. Odessać 4 ml supernatantu i ponownie zawiesić każdą pożywkę w 1 ml pozostałej pożywki.
- Usunąć 20 ml z każdej frakcji i dodać do szkiełka podstawowego. Wizualizuj krypty i szczątki pod mikroskopem świetlnym i określ, które frakcje należy odpowiednio połączyć i połączyć, aby osiągnąć jak największy stosunek procentowy krypt do gruzu.
UWAGA: Ułamki 2-6 dają największy procent krypt do platerowania. Frakcje do puli to najczęściej ułamek 3 z ułamkiem 4 i ułamek 5 z ułamkiem 6. - Frakcje odwirować do posiewu w temperaturze 125 x g przez 5 min. Odessać supernatant pozostawiając 50-100 μl pozostające nad osadem.
- Trzymaj probówki na lodzie i dodaj 1 ml matrycy białkowej do połączonych frakcji. Powoli pipetować w górę i w dół, aby zapobiec dodawaniu się pęcherzyków powietrza.
- Wyjąć wstępnie ogrzane 24-dołkowe płytki z inkubatora w temperaturze 37 °C i dodać 50 μl zawiesiny matrycy białkowej/krypty na środku każdej studzienki. Przenieść płytkę z nasionami do inkubatora o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy białkowej.
- Dodać 450 μl wcześniej przygotowanych pożywek wzrostowych organoidów + 50 μl pożywki kondycjonowanej R-spondyną1 do studzienki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez noc.
- Dodawać 50-100 μl pożywki kondycjonowanej R-spondyną1 dziennie na studzienkę. Co 3dni zastępować całe organoidowe podłoża wzrostowe świeżo przygotowanymi organoidowymi pożywkami wzrostowymi o pojemności 450 μl/studzienkę opisaną w kroku 2.2. Dodatkowo dodać 50-100 μl pożywki kondycjonowanej R-spondyną1 na studzienkę.
UWAGA: Kropla macierzy białkowej zachowuje swoją integralność przez tydzień, ale po 7 dniach przechodzi do organoidów pasujących.
4. Organoidy pasujące co 7 dni
- Rozmrozić matrycę białkową na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C na dzień przed pasażowaniem. Ogrzewać jedną sterylną płytkę 24-dołkową do temperatury 37 °C przez co najmniej 30 minut. Przygotować organoidowe podłoża wzrostowe opisane w kroku 2.2 i przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
- Wyjąć płytkę organoidową z inkubatora i rozpocząć pasowanie płytki na lodzie. Na początek odessać pożywkę wzrostową pipetą o pojemności 10 ml z 3-4 dołków.
UWAGA: Trzymaj zasysaną pożywkę w pipecie o pojemności 10 ml, ponieważ w następnym kroku zostanie ona wykorzystana do usunięcia kropli matrycy białkowej. - W studzienkach zasysanych pipetować w górę i w dół, aby usunąć kroplę matrycy białkowej z płytki. Delikatne skrobanie końcówką pipety o pojemności 10 ml jest pomocne w usuwaniu kropli z matrycy białkowej. Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Inkubować stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie przez 10 minut i wirować przy 125 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Obserwować biały osad na dnie stożkowej probówki. Delikatnie odessać i wyrzucić większość supernatantu/starych pożywek wzrostowych organoidów powyżej osadu organoidowego, pozostawiając 100-200 μl nad osadem.
- Rozbij krypty organoidów za pomocą igły o rozmiarze 23 dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Zasysaj i katapultuj się 10-15 razy, aby oddzielić krypty. Zminimalizuj tworzenie się pęcherzyków powietrza z powodu nadmiernego pipetowania.
- Ponownie zawiesić organoidy w 500 μl matrycy białkowej i dodać 50 μl na studzienkę do nowej, wstępnie ogrzanej 24-dołkowej płytki. Dodać 450 μl wcześniej przygotowanych pożywek wzrostowych organoidów + 50 μl pożywki kondycjonowanej R-spondyną1 do studzienki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
5. Posiewanie organoidów w dniu 14 w celu stymulacji receptorów rozpoznawania wzorców za pomocą PAMP i Listeria monocytogenes do analizy ekspresji genów
- Dwa dni przed prowokacją rozprowadź L. monocytogenes na płytce agarowej BHI.
- Następnego dnia wybierz kolonię L. monocytogenes i hoduj w 10 ml bulionu BHI w temperaturze 37 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.
- Rozmrozić matrycę białkową na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C na dzień przed prowokacją organoidową. Ogrzewać jedną sterylną płytkę 24-dołkową do temperatury 37 °C przez co najmniej 30 minut. Przygotować organoidowe podłoża wzrostowe opisane w kroku 2.2 i przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
- Usuń kulturę organoidów z inkubatora i rozpocznij pasażowanie organoidów.
- Odessać pożywkę z 3-4 dołków i trzymać zasysaną pożywkę w pipecie o pojemności 10 ml, ponieważ zostanie ona wykorzystana do usunięcia kropli matrycy białkowej. Pipetować w górę i w dół, aby usunąć kroplę matrycy białkowej z płytki. Delikatne skrobanie końcówką pipety o pojemności 10 ml jest pomocne w usuwaniu kropli z matrycy białkowej. Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Inkubować stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie przez 10 minut. Wirować przy 125 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Obserwować białą osadkę na dnie stożkowej probówki. Delikatnie zassać supernatant, pozostawiając około 100 μl pozostałego supernatantu.
- Zawiesić osad organoidowy w 5 ml lodowatego pojemnika 1x PBS i usunąć 10 μl porcji do policzenia. Dodać 10 μl podwielokrotności do środka hemocytometru bez szkiełka nakrywkowego. Delikatnie nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na wierzch kropli.
UWAGA: Hemocytometr zatka się organoidami, jeśli szklane szkiełko nie zostanie najpierw usunięte. - Policz całkowitą liczbę organoidów za pomocą mikroskopu świetlnego w każdej siatce/całej komorze hemocytometru i określ stężenie organoidów: liczbę wszystkich organoidów policzonych na 10 μl.
- Pobrać odpowiednią objętość z probówki stożkowej o pojemności 15 ml, która pozwoli na wysianie odpowiedniej liczby organoidów do testu i odwirować tę zawiesinę w sile 125 x g przez 10 min.
UWAGA: Zakres od 40 do 100 organoidów na studzienkę na płytce 24-dołkowej jest wystarczający do analizy RNA. Typowy rozmiar organoidu może wynosić od 300 μm do 1 000 μm średnicy. - Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 ml matrycy białkowej, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza. Dodać 50 ml zawiesiny organoidu/matrycy białkowej na dołek do płytki 24-dołkowej.
UWAGA: Ilość matrycy białkowej użytej do ponownego zawieszenia organoidów będzie się różnić w zależności od liczby warunków leczenia i kontrprób technicznych. - Dodać 500 μl organoidowych pożywek wzrostowych (bez N-acetylo-cysteiny) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 1 godzinę.
- Przygotuj 2x stężenia PAMP (tj. flageliny, lipopolisacharydu) i żywych L. monocytogenes. Zmierz OD żywego L. monocytogenes i steku na płytce BHI w celu policzenia. Traktuj organoidy w 1 x 106 jednostkach tworzących kolonie (CFU)/ml.
UWAGA: Oznaczanie OD do CFU będzie się różnić w zależności od rodzaju bakterii i powinno być oceniane przed stymulacją organoidów. Na przykład OD 0,6 ≈ 1 x 109 jtk/ml dla L. monocytogenes, ale powinien być również oceniany niezależnie przed eksperymentem. - Usunąć seryjne rozcieńczenie L. monocytogenes z zapasu do traktowania, aby dokładnie określić CFU/ml do traktowania. Autorzy stwierdzają, że rozcieńczenie 1 x 108 100 μl na płytce agarowej BHI jest wystarczające do policzenia kolonii w celu określenia dokładnej jtkówki/ml.
- Przygotować roztwór L. monocytogenes zabity termicznie, pobierając 1 ml podwielokrotności żywego roztworu L. monocytogenes i odwirować przy 5 000 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i przemyć osad bakteryjny 1 ml 1x PBS.
- Odwirować L. monocytogenes przy 5 000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS. Zabijanie L. monocytogenes na gorąco w probówce polipropylenowej o pojemności 1,7 ml przez ogrzewanie w temperaturze 80-90 °C przez 1 godzinę. Hodowla 100 μl podwielokrotności ciepła zabiła L. monocytogenes na płytce agarowej BHI, aby potwierdzić, że nie pozostały żadne żywe bakterie.
- Dodać 500 μl odpowiedniego 2x PAMP i/lub obróbki mikrobiologicznej do 500 μl pożywek rezydacyjnych w wyznaczonych dołkach określonych przez użytkownika. Inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 24 godziny
UWAGA: Dodanie 500 μl podwielokrotności 2x PAMP/mikrobiologicznej do 500 μl pożywki rezydentnej spowoduje zwiększenie stężenia poddanego działaniu środka do 1x w całkowitej objętości 1 ml.
- Następnego dnia należy ręcznie policzyć kolonie L. monocytogenes w celu dokładnego określenia traktowanej CFU/ml. Odessać pożywkę z płytki poddanych działaniu organoidów i trzykrotnie przemyć studzienki 1x PBS.
- Przejdź do ekstrakcji RNA za pomocą fenolu/chloroformu11 lub zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oceń ekspresję genów za pomocą standardowego qRT-PCR12.
6. Posiew organoidów w dniu 14 dla PAMP i L. monocytogenes Wyzwanie do analizy białek w supernatancie
- Dwa dni przed prowokacją rozpocząć hodowlę komórkową komórek Caco-2, gęstość wysiewu ≈1 x 106 komórek w kolbie T-75 z 1x DMEM + 20% FBS i inkubować komórki Caco-2 w temperaturze 37 °C + 5% CO2 . Rozpocząć hodowlę bakterii L. monocytogenes na płytce BHI i inkubować płytkę w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C.
- Następnego dnia należy pobrać kolonię L. monocytogenes i hodować ją w 10 ml bulionu BHI w temperaturze 37 °C przez noc. Rozmrozić matrycę białkową na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C na dzień przed prowokacją organoidową.
- Następnego dnia ogrzej jedną sterylną 96-dołkową płytkę o czarnych ściankach do temperatury 37 °C przez co najmniej 30 minut. Przygotuj organoidowe podłoże wzrostowe bez N-acetylo-cysteiny opisanej w kroku 2.2 i trzymaj w temperaturze 37°C do momentu użycia. Usunąć kulturę organoidową z inkubatora i rozpocząć pasażowanie organoidów.
UWAGA: Typowy rozmiar organoidu może wynosić od 300 μm do 1,000 μm średnicy. - Odessać pożywkę z 3-4 dołków i trzymać zasysaną pożywkę w pipecie o pojemności 10 ml, ponieważ zostanie ona wykorzystana do usunięcia kropli matrycy białkowej. Zawiesić pipetą, aby usunąć kroplę z matrycy białkowej z płytki. Delikatne skrobanie pipetą o pojemności 10 ml jest pomocne w usuwaniu kropli macierzy białkowej. Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Inkubować stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie przez 10 minut. Wirować przy 125 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Obserwować białą osadkę na dnie stożkowej probówki. Delikatnie odessać supernatant, pozostawiając 100 μl pozostałego supernatantu.
- Zawiesić osad organoidowy w 5 ml lodowatego pojemnika 1x PBS i usunąć 10 μl podwielokrotności do policzenia. Dodać 10 μl podwielokrotności do środka hemocytometru i delikatnie nałożyć na szklane szkiełko nakrywkowe.
UWAGA: Hemocytometr zatka się organoidami, jeśli szklane szkiełko nie zostanie najpierw usunięte. - Policz całkowitą liczbę organoidów za pomocą mikroskopu świetlnego w każdej siatce hemocytometru/całej komory i określ stężenie organoidów: liczbę wszystkich organoidów policzonych na 10 ml.
- Pobrać odpowiednią objętość z probówki stożkowej o pojemności 15 ml, która pozwoli na wysianie odpowiedniej liczby organoidów do testu i odwirować tę zawiesinę w sile 125 x g przez 10 min.
UWAGA: Ilość matrycy białkowej użytej do ponownego zawieszenia organoidów będzie się różnić w zależności od ilości warunków leczenia i kontrprób technicznych. Autorzy stwierdzają, że 40-100 organoidów jest wystarczające do analizy wydzielanych białek. - Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl matrycy białkowej /studzienka bez generowania pęcherzyków powietrza.
UWAGA: Ilość matrycy białkowej użytej do ponownego zawieszenia organoidów będzie się różnić w zależności od ilości warunków leczenia i kontrprób technicznych. - Pozostaw co najmniej dwie puste kolumny na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o czarnych ściankach, ponieważ będą one służyć jako studzienki wysiane komórkami Caco-2 do wytworzenia krzywej wzorcowej. Dodaj 50 μl matrycy białkowej + zawiesiny organoidów na basenik do wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek czarnościennych. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy białkowej.
- Dodać 100 μl organoidowych pożywek wzrostowych (bez N-acetylo-cysteiny) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 1 godzinę.
- Przygotuj 2x stężenia PAMP i żywych L. monocytogenes. Dodać 100 ml każdego podanego warunku leczenia do dołka i inkubować przez 24 godziny.
- Następnego dnia umieść komórki Caco-2 w studzienkach o krzywej standardowej. Zacznij od podgrzania sterylnego 1x PBS, 0,25% trypsyny i 1x DMEM + 20% FBS do 37 °C.
- Wyjąć kolbę T-75 zawierającą komórki Caco-2 i odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Umyj komórki 10 ml 1x PBS. Odessać 1x PBS, dodać 2 ml 0,25% trypsyny i umieścić kolbę T-75 w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 15 minut.
- Wizualizuj kolbę pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórki się odłączyły, a następnie dodaj 8 ml 1x DMEM + 20% FBS do odłączonych komórek Caco-2 i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Usunąć podwielokrotność 10 μl i policzyć komórki za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu hemocytometru.
UWAGA: Górna liczba komórek wynosząca 60 000 komórek / studzienkę działa dobrze i można przeprowadzić rozcieńczenia w celu wygenerowania krzywej standardowej do 2 500 komórek / studzienkę. - Ponownie zawiesić komórki Caco-2 w matrycy białkowej i dodać 50 μl na studzienkę do odpowiednich studzienek. Pozostawić matrycę białkową do zestalenia się w temperaturze 37 °C dla komórek Caco-2.
UWAGA: Pożywki wzrostowe dla komórek Caco-2 nie muszą być dodawane po zestaleniu matrycy białkowej. - Po 24-godzinnym czasie obróbki w teście organoidowym, należy odessać i zapisać organoidowe pożywki z supernatantu komórkowego i przechowywać na lodzie. Umyj studzienki trzy razy za pomocą 1x PBS. Dodać 100 μl 100% metanolu do każdej studzienki, w tym studzienki o krzywej wzorcowej Caco-2 i inkubować w temperaturze 4 °C lub na lodzie przez 20-30 minut w celu utrwalenia organoidów.
UWAGA: Nie jest wymagane, aby studzienki o krzywej standardowej Caco-2 były myte 1x PBS, ponieważ mogą one zawierać metanol dodawany bezpośrednio. - Po inkubacji metanolu umyć studzienki trzykrotnie lodowatym 1x PBS. Płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 1-2 tygodni.
- Dodać barwnik do barwienia jądrowego o stężeniu 1 μg/ml na studzienkę, przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Użyj 96-dołkowego czytnika płytek, aby zmierzyć wzbudzenie/emisję barwnika barwienia jądrowego (odpowiednio 350 nm / 461 nm) i dobrze znormalizować każdy organoid do standardowej krzywej komórek Caco-2.
- Przejdź do dalszych testów, takich jak ELISA12, supernatantu do hodowli komórkowej normalizującego się do liczby komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podczas stosowania niniejszego protokołu w celu hodowli organoidów jelitowych, po zbiorze obecne będą charakterystyczne organoidy o kształcie sfery. Codzienne dodawanie pożywki warunkowanej R-spondin1 zapoczątkuje wzrost i pączkowanie organoidów. Wzrost organoidów przedstawiono na rysunku 1A-F, który jest reprezentatywny dla organoidów jelitowych w dniach 1, 2, 4, 5, 6 oraz 14. Rysunek 1F obrazuje niejednorodne cechy wzro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Hodowla i utrzymanie organoidów jelitowych to procedura, którą może opanować każda osoba posiadająca odpowiednią technikę hodowli tkankowej. Istnieją subtelności w pasażowaniu w porównaniu z hodowlą komórek w bardziej konwencjonalnej monowarstwie, ale te subtelności nie są trudne do pokonania. Kluczowe etapy tej metody obejmują możliwość wyhodowania organoidów do wystarczająco dużej gęstości, aby zapewnić optymalny wysiew. Eksperymenty muszą być zmniejszone w przypadku organoidów, ponieważ duże gęstości wysiewu, które mo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylanowi McDanielowi i Bettiny Heid za dyskusje techniczne. Autorzy dziękują dr Nandzie Nanthakumar za dostarczenie komórek Caco-2. Autorzy dziękują również Programowi Wielokulturowych Możliwości Akademickich (MAOP) w Virginia Tech. Prace te były wspierane przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (dla ICA). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (sekcja 1,3,6) Lub równoważna marka |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (sekcja 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (sekcja 1,6) Do komórek Caco-2 i HEK293 Rspondin1 |
| HEK293T-Linia komórkowa | wydzielająca Rspondin1(Sekcja 1) Opisane i zmodyfikowane na podstawie Kim, K.A. et al. Cząstki lentiwirusowe zawierały cDNA RSPO1(NM_138683) ORF sklonowane do szkieletu pReceiver-Lv105 zamówionego i zakupionego w GeneCopoeia. | ||
| Probówka stożkowa 50 ml | Falcon | 352070 | (sekcja 1) Lub równoważna marka |
| T-175 | Kolba Corning | 431079 | (sekcja 1) Lub równoważna marka |
| Białko Matrix | Corning | 356231 | (Sekcja 2,3,4,5,6) Obniżony czynnik wzrostu Matrigel |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (sekcja 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (sekcja 2,3) Zaawansowane płytki TC DMEM/F12 |
| Corning 24 dołki | Corning | 3524 | (sekcja 2) |
| N2 Suplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Sekcja 2) |
| B27 bez witaminy A 50x | Technologie życiowe | 12587-010 | (Sekcja 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026( | Sekcja 2) |
| Suplement glutaminy (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Sekcja 2) Może łączyć się z Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (sekcja 2) Może łączyć się z Advanced DMEM/ F12 |
| 10 ml Pipet serologiczny | Falcon | 357551 | (sekcja 2) Lub równoważna marka |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (sekcja 2) Zapas = 100 mg / ml |
| N-acetylo-L-cysteiny | Sigma-Aldrich | A9165 | (sekcja 2) Zapas = 1 m |
| rekombinowana mysz EGF | Biolegend | 585608 | sekcja 2) Zapas = 500 mg / ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Sekcja 3) | |
| Nożyczki | (Sekcja 3) | ||
| Kleszcze | (Sekcja 3) | ||
| Szkiełka podstawowe | (Sekcja 3) | ||
| Pęseta | (Sekcja 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Sekcja 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (sekcja 3) 0,5 m lub alternatywna |
| sterylna szalka Petriego EDTA klasy TC 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | (sekcja 3) Lub jednakowej wielkości naczynie TC |
| 1 ml Strzykawka | Becton Dickinson | 309659 | (sekcja 4) |
| Precyzyjna igła ślizgowa | Becton Dickinson | 305120 | (sekcja 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm) |
| Wiciowiec z Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Sekcja 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (sekcja 5,6) ( Murray et al.) |
| Hemocytometr | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (sekcja 5,6) Lub równoważna marka |
| BBL Agar do infuzji serca | mózgu Becton Dickinson | 211065 | (sekcja 5) |
| Napar do mózgu Bacto Becton | Dickinson | 237500 | (sekcja 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (sekcja 6) |
| Trypsyna | Gibco | 25200056 | (sekcja 6) |
| Metanol | Fisher | A412-4 | (sekcja 6) |
| Urządzenia molekularne | SpectraMax M5 | (sekcja 6) | |
| 96 Płytka testowa Corning | 3603 | (sekcja 6) płytka, przezroczyste dno Technologia | |
| barwienia jądrowego | H1399 | (sekcja 6) Kolba Hoechst 33342 | |
| T-75 | Corning | 430641 | (Sekcja 6) Lub równoważna marka |
| 15 ml stożkowa tubka | Falcon | 352096 | (Sekcja 1,3) Lub równoważna marka |
| 1,7 ml probówka polipropylenowa | Bioexpress | C-3262-1 | Lub równoważna marka |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Lub równoważna marka |
| TNF-alfa | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman |
| IL-18 | Applied Biosystems | Zestaw | oznaczania ekspresji genów Mm 00434225_m1 Taqman |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman |
| 7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna, 0,1 ml | Life Technologies/Applied Biosystems | ||
| Rekombinowane mysie białko R-spondyny 1 R& | D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
Bibliografia
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. Culture of epithelial cells. 2nd edn. , Wiley-Liss. (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228(2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
