Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cząsteczki wirusopodobne (VLP) i cząstki subwirusowe (SVP) są alternatywnym podejściem do projektowania szczepionek wirusowych, które oferują korzyści w postaci zwiększonego bezpieczeństwa biologicznego i stabilności w porównaniu z użyciem żywych patogenów. Niezakaźne i samoorganizujące się VLP są używane do prezentowania białek strukturalnych jako immunogenów, omijając potrzebę stosowania żywych patogenów lub rekombinowanych wektorów wirusowych do dostarczania antygenu. W tym artykule pokazujemy różne etapy projektowania i rozwoju VLP pod kątem przyszłych zastosowań w przedklinicznych testach na zwierzętach. Procedura obejmuje następujące etapy: wybór antygenu, ekspresję antygenu w wybranej linii komórkowej, oczyszczanie VLP/SVP oraz kwantyfikację do dawkowania antygenu. Demonstrujemy wykorzystanie zarówno linii komórkowych ssaków, jak i owadów do ekspresji naszych antygenów i pokazujemy, jak metodologie różnią się pod względem wydajności. Przedstawiona metodologia może mieć zastosowanie do różnych patogenów i może być osiągnięta poprzez zastąpienie antygenów immunogennymi białkami strukturalnymi mikroorganizmu będącego przedmiotem zainteresowania użytkownika. VLP i SVP pomagają w charakterystyce antygenu i wyborze najlepszych kandydatów na szczepionki.
Wprowadzenie
Cząsteczki wirusopodobne (VLP) są zatwierdzoną technologią do szczepień ludzi. W rzeczywistości niektóre z bardziej współcześnie licencjonowanych szczepionek, w tym szczepionki przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego (HPV) i wirusowemu zapaleniu wątroby typu Β (HepΒ) wykorzystują to podejście. VLP są tworzone z białek strukturalnych zdolnych do samoorganizacji. Zebrane cząstki naśladują morfologię wirusa, ale nie mogą infekować ani replikować się, ponieważ brakuje im genomów wirusowych. VLP mogą być wyrażane i oczyszczane z wielu systemów prokariotycznych i eukariotycznych. Przegląd piśmiennictwa wykazał, że w zależności od częstości występowania w organizmie stosowa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. System ekspresji ssaków do generowania wirusa grypy H3N2 VLP
- Subklonowane wirusowe glikoproteiny strukturalne hemaglutynina (HA), neuraminidaza (NA) i ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) Gag p55 do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych, takich jak wcześniej opisany pTR600. 7
- Amplifikować DNA w chemicznie kompetentnych Escherichia coli (np. DH5α) i wyizolować plazmid klasy transfekcyjnej za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Ilość DNA jest uzależniona od plonu i potrzeb użytkownika.
- Utrzymać linię komórkową ssaków, 293T, w pożywce wzrostowej zawierającej 10% płodowo-bydl....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wydajność VLP była zmienna w zależności od projektu konstruktu antygenu wirusowego. W niniejszym protokole zaprezentowano wykorzystanie komórek owadziego i ssaków do produkcji SVP lub VLP w supernatancie oraz ich oczyszczanie za pomocą ultrawirowania. Do stworzenia wersji SVP DENV (oznaczonych jako 1-4 w Table 1) wykorzystano cztery podtypy kaset ekspresyjnych strukturalnego genu prM/E DENV, co pozwoliło uzyskać zakres od 1,1 do 2,6 mg całkowitego białka w objętości 0,6 m.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowaliśmy opisane powyżej techniki, aby skutecznie wyrazić i oczyścić SVP i VLP złożone z wielu białek strukturalnych dla różnych patogenów. Ogólnie rzecz biorąc, używamy systemów ekspresji ssaków do generowania naszych VLP. Jednak w naszych rękach plony CHIK VLP pochodzące z komórek ssaków były niskie. Wydajność CHIK VLP była bardziej solidna przy użyciu rekombinowanego systemu komórkowego bakulowirusa i owadów. Ogólnie rzecz biorąc, systemy komórkowe bakulowirusa-owada dają większe ilości rekombinowanych białek, c.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować poprzednim członkom laboratorium Ross, którzy pomogli zoptymalizować protokół pod kątem maksymalnej wydajności i wydajności.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| System ekspresji bakulowirusa Bac-to-Bac | Life Technologies | 10359-016 | |
| Mieszadło wielopunktowe Cimarec I 6 | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Probówki ultrawirówkowe Polyclear | Seton | 7025 | Potwierdź odpowiednie probówki do ultrawirówki i rozmiar wiadra |
| Zestaw do oznaczania białek Micro BCA | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Bufor cytrynianu fosforanowego | Sigma | P4922 | |
| o-fenylenodiamina dichlorowodorek | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μ m górny filtr próżniowy (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| SF-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Bibliografia
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug De....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
