Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54041

⸱

2 czerwca 2016

 ,  , 
1Center for Vaccines and Immunology, Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Streszczenie

Cząsteczki wirusopodobne (VLP) i cząstki subwirusowe (SVP) są alternatywnym podejściem do projektowania szczepionek wirusowych, które oferują korzyści w postaci zwiększonego bezpieczeństwa biologicznego i stabilności w porównaniu z użyciem żywych patogenów. Niezakaźne i samoorganizujące się VLP są używane do prezentowania białek strukturalnych jako immunogenów, omijając potrzebę stosowania żywych patogenów lub rekombinowanych wektorów wirusowych do dostarczania antygenu. W tym artykule pokazujemy różne etapy projektowania i rozwoju VLP pod kątem przyszłych zastosowań w przedklinicznych testach na zwierzętach. Procedura obejmuje następujące etapy: wybór antygenu, ekspresję antygenu w wybranej linii komórkowej, oczyszczanie VLP/SVP oraz kwantyfikację do dawkowania antygenu. Demonstrujemy wykorzystanie zarówno linii komórkowych ssaków, jak i owadów do ekspresji naszych antygenów i pokazujemy, jak metodologie różnią się pod względem wydajności. Przedstawiona metodologia może mieć zastosowanie do różnych patogenów i może być osiągnięta poprzez zastąpienie antygenów immunogennymi białkami strukturalnymi mikroorganizmu będącego przedmiotem zainteresowania użytkownika. VLP i SVP pomagają w charakterystyce antygenu i wyborze najlepszych kandydatów na szczepionki.

Wprowadzenie

Cząsteczki wirusopodobne (VLP) są zatwierdzoną technologią do szczepień ludzi. W rzeczywistości niektóre z bardziej współcześnie licencjonowanych szczepionek, w tym szczepionki przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego (HPV) i wirusowemu zapaleniu wątroby typu Β (HepΒ) wykorzystują to podejście. VLP są tworzone z białek strukturalnych zdolnych do samoorganizacji. Zebrane cząstki naśladują morfologię wirusa, ale nie mogą infekować ani replikować się, ponieważ brakuje im genomów wirusowych. VLP mogą być wyrażane i oczyszczane z wielu systemów prokariotycznych i eukariotycznych. Przegląd piśmiennictwa wykazał, że w zależności od częstości występowania w organizmie stosowane są różne systemy ekspresji: bakterie – 28%, drożdże – 20%, rośliny – 9%, owady – 28% i ssaki – 15%1. Warto zauważyć, że szczepionki przeciwko HPV oparte na białku kapsydu L1 są produkowane w drożdżach (Gardasil) lub w systemie komórkowym owadów (Cervarix)2. Szczepionki HepΒ, Recombivax i Engerix-Β, są również produkowane w drożdżach i składają się z antygenu powierzchniowego HepΒ3,4.

Używamy systemów ekspresji komórek ssaków i owadów do produkcji VLP wymagających koekspresji wielu białek strukturalnych do montażu. Nasza praca koncentruje się na projektowaniu, produkcji i oczyszczaniu szczepionek opartych na VLP przeciwko ludzkim patogenom: wirusowi grypy, syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV), wirusowi dengi (DENV) i wirusowi chikungunya (CHIKV). Nasze metody są na tyle elastyczne, że pozwalają na koekspresję wielu białek strukturalnych z plazmidów o wielu ekspresjach lub plazmidu o pojedynczej ekspresji (Figura 1). Wcześniej wyprodukowaliśmy i oczyściliśmy VLP H5N1 złożone z koekspresji plazmidów kodujących hemaglutyninę grypy (HA), neuraminidazę (NA) i macierz (M1) w ludzkich embrionalnych komórkach nerki 293T5,6. Geny zoptymalizowano pod kątem kodonów pod kątem ekspresji w komórkach ssaków i sklonowano do pTR600, eukariotycznego wektora ekspresyjnego zawierającego natychmiastowy wczesny promotor wirusa cytomegalii oraz intron A do inicjowania transkrypcji wstawek eukariotycznych i sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu do zakończenia transkrypcji7. Podobne podejście wykorzystujące trójplazmidową koekspresję HA, NA (Figura 1A) i alternatywnego białka macierzy wirusa, HIV Gag p55, zastosowano w tym badaniu do generowania ludzkich podtypów grypy sezonowej H3N2 VLP i wykazano, że generują VLP o podobnej wielkości jak cząstki grypy8. Chociaż szczepionki przeciw grypie w przeważającej mierze wywołują przeciwciała anty-HA, dodanie neuraminidazy grypy pośredniczy w aktywności sialidazy, aby umożliwić pączkowanie VLP z transfekowanych komórek9, a także przedstawia dodatkowe cele immunogenne. Do produkcji VLP RSV wybraliśmy również niepowiązany rdzeń HIV Gag do zaprojektowania prototypowych szczepionek, które prezentują wyłącznie glikoproteiny powierzchniowe RSV, aby jeszcze bardziej wykazać elastyczność tworzenia VLP przy użyciu HIV Gag, jak opisano wcześniej i scharakteryzowano za pomocą mikroskopii elektronowej6,10. Inni wykazali wcześniej, że VLP prezentujące glikoproteiny RSV mogą być składane przy użyciu różnych składników wirusa rzekomego pomoru drobiu (NDV)11 i matrycy grypy12. W tym badaniu wykorzystano sekwencje glikoproteiny powierzchniowej o pełnej długości, aby zachować natywne konformacje, które mogą być niezbędne do funkcjonalnego wiązania receptora i rozpoznawania przeciwciał za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Nasze przykłady użycia pojedynczych systemów ekspresji plazmidu do generowania cząsteczek to DENV i CHIKV. W przypadku DENV możemy wytwarzać cząstki subwirusowe (SVP) bez kapsydu w komórkach 293T z pojedynczego plazmidu zawierającego kasetę13 strukturalnej ekspresji genów prM/E. Termin SVP jest używany do określenia braku białka rdzeniowego lub kapsydu w składaniu białek strukturalnych wirusa. CHIK VLP mogą być również wytwarzane przy użyciu pojedynczego plazmidu zawierającego strukturalną kasetę genową CHIKV, kodującą kapsyd i białka otoczki, lub w komórkach owadów poprzez zakażenie rekombinowanym bakulowirusem kodującym tę samą strukturalną kasetę genów zoptymalizowaną pod kątem ekspresji komórek owadów (figura 1B-C).

Końcowym rezultatem metod ekspresji omówionych powyżej jest uwolnienie VLP do pożywki do hodowli komórkowej, która może być następnie oczyszczona przez ultrawirowanie przez poduszkę z 20% glicerolu. W niniejszym raporcie przedstawiamy metody ekspresji i oczyszczania tych VLP z systemów komórkowych ssaków i owadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. System ekspresji ssaków do generowania wirusa grypy H3N2 VLP

  1. Subklonowane wirusowe glikoproteiny strukturalne hemaglutynina (HA), neuraminidaza (NA) i ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) Gag p55 do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych, takich jak wcześniej opisany pTR600. 7
  2. Amplifikować DNA w chemicznie kompetentnych Escherichia coli (np. DH5α) i wyizolować plazmid klasy transfekcyjnej za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Ilość DNA jest uzależniona od plonu i potrzeb użytkownika.
  3. Utrzymać linię komórkową ssaków, 293T, w pożywce wzrostowej zawierającej 10% płodowo-bydlęcej surowicy (FBS) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  4. Hodować komórki w taki sposób, aby kolba do hodowli tkankowej T-150 zawierała 45-75 x 106 komórek w kolbie, tak aby kolba uzyskała całkowite przyleganie komórek i 85-95% zbieżności komórek do następnego dnia. Sprawdź komórki pod mikroskopem pod kątem pożądanej konfluencji.
    Uwaga: Zazwyczaj zaleca się wysoką gęstość komórek w celu uzyskania optymalnej ekspresji białka przy minimalnej cytotoksyczności przy użyciu komercyjnych odczynników do transfekcji, jednak nadmierna konfluencja może spowodować akumulację produktów ubocznych odpadów komórkowych i zmniejszyć żywotność komórek.
  5. W dniu transfekcji należy przygotować mieszaninę liposomu i DNA zgodnie z zaleceniami producenta i dokonać transfekcji komórek DNA o składzie DNA 1:1:2 HA:NA:Gag o łącznej ilości DNA 40 μg na kolbę T-150. Rozcieńczyć DNA i roztwory liposomów w pożywkach do transfekcji bez surowicy bez antybiotyków, tak aby każda kolba zawierała całkowitą objętość 20-30 ml.
    Uwaga: Stosunek konstruktów genów może wymagać optymalizacji przez użytkownika. Chociaż nie wykazano tego tutaj, podobną procedurę transfekcji przeprowadzono z użyciem syncytialnego wirusa oddechowego (RSV) F i HIV Gag w stosunku 1:1. W przypadku plazmidów o pojedynczej ekspresji DENV i CHIKV w celu uzyskania optymalnej ekspresji stosuje się łącznie 20 μg DNA na kolbę T-150. Proporcje odczynników DNA:transfekcja są zoptymalizowane przez użytkownika. Stosować zalecaną pożywkę do transfekcji w oparciu o metodę transfekcji, tj. polikationowe transfekcje lipidowe zalecają zmniejszenie lub brak płodowej surowicy bydlęcej, dlatego pożywki mogą być uzupełnione hormonami wzrostu i pierwiastkami śladowymi w celu wsparcia wzrostu przy braku surowicy.
  6. Kolby należy przywrócić do temperatury 37 °C za pomocą inkubatora o stężeniu 5% CO2 . Na objętość 200 ml należy użyć 9 kolb T-150. Komórki są utrzymywane w pożywce hodowlanej do transfekcji do dnia zbioru VLP.
  7. Zebrać supernatant kultury z komórek po 72-96 godzinach po transfekcji w zależności od antygenu lub gdy żywotność komórek spadła do 70-80%, zgodnie z oszacowaniem kontroli mikroskopowej. Przenieść supernatant do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych.
    Uwaga: Zastąpienie 3-dniowego supernatantu świeżym, wstępnie ogrzanym, wolnym od surowicy podłożem do transfekcji na przylegające komórki spowoduje uzyskanie drugiej partii VLP o podobnej lub nieznacznie zmniejszonej wydajności i powinno być zoptymalizowane przez użytkownika.
  8. Zebrać supernatant w puli i przefiltrować przez membranę porową 0,22 μm przed sedymentacją za pomocą ultrawirowania.
  9. Zbadać aktywność hemaglutynacyjną VLP wykazujących ekspresję HA za pomocą standardowego testu hemaglutynacji14 przy użyciu 0,8% czerwonych krwinek indyków lub ssaków lub przystąpić do testu ELISA swoistego dla antygenu. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki.

2. Ekspresja CHIK VLP przy użyciu systemu komórkowego bakulowirusa/owadów

  1. Wygeneruj rekombinowanego bakulowirusa wykazującego ekspresję kapsydu wirusa chikungunya i białek otoczki (C-E3-E2-6K-E1) ze szczepu S-27 przy użyciu komercyjnego systemu ekspresji bakulowirusa.
  2. Hodowla komórek Spodoptera frugiperda Sf9 w pożywce wzrostowej Sf9 bez surowicy ze 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 28 °C. Użyć 3-5 x 105 c/ml w celu zainicjowania hodowli w kolbach przędzalniczych w celu wzrostu komórek zawiesinowych. Pasaż rutynowo, gdy osiągną gęstość komórek 2-4 x 106 c/ml (co 3-4 dni).
  3. Hodowla komórek Sf9 w zawiesinie w kolbach wirujących z mieszaniem przy 130 obr./min na wielopunktowym systemie płytek mieszających. W celu prawidłowego napowietrzenia należy utrzymywać objętość kultur na poziomie nie większym niż połowa objętości kolby obrotowej.
  4. W celu ekspresji CHIK VLP należy zainfekować komórki Sf9 o gęstości 2 x 106 komórek/ml rekombinowanym bakulowirusem przy wielokrotności infekcji 1 i powrócić do inkubatora w temperaturze 28 °C. Zazwyczaj należy zainfekować jedną lub dwie kolby przędzarki, zawierające 250 ml komórek Sf9.
    Uwaga: Chociaż nie stosujemy tej metody, komórki Sf9 mogą być hodowane w kolbach wytrząsających w temperaturze 28 °C przy użyciu platformy wytrząsającej.
  5. Kultury należy zbierać po 72-96 godzinach od infekcji lub gdy żywotność komórek spadła do 70-80%, zgodnie z wykluczeniem błękitu trypanowego zgodnie z protokołem producenta.
    Uwaga: Komórki nadal się namnażają po zakażeniu, a w kulturach Sf9 zakażonych rekombinowanym bakulowirusem CHIK VLP występuje ~80% żywotności po 3 dniach od infekcji (dpi). Komórki zakażone bakulowirusem mają większy wygląd. Morfologia może również zmieniać się z okrągłej na podłużną. W późnych stadiach infekcji bakulowirusem komórki zaczęły się lizować.
  6. Przenieść kultury bezpośrednio z hodowli zawiesinowej do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zebrać supernatanty i przefiltrować przez membranę porową 0,22 μm przed sedymentacją za pomocą ultrawirowania.

3. Sedymentacja/Oczyszczanie VLP/SVP

  1. Sterylizuj probówki ultrawirówki ultrawirówki o wymiarach 25 mm x 89 mm z 70% etanolem w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że etanol wysechł przed użyciem.
  2. Załadować do 32 ml supernatantu do czystej probówki. Zalecana jest minimalna objętość 25 ml, aby zapobiec zapadnięciu się i uszkodzeniu nieodpowiednio napełnionych probówek ultrawirówek.
  3. Ostrożnie podkryć supernatanty sterylnymi 3 ml 20% glicerolu w PBS (v/v). Upewnij się, że rurki są wyważone.
  4. Wirować z prędkością 135 000 x g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant, upewniając się, że osad nie wysunie się z probówki.
  6. Zawiesić osadzone VLP na dnie probówek sterylnym PBS, energicznie pipetując w górę iw dół. Ilość PBS potrzebna do ponownego zawieszenia VLP zależy od całkowitej wydajności białka VLP i dalszych zastosowań. Zazwyczaj każdy granulat VLP należy ponownie zawiesić w co najmniej 100 μl.
  7. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania i w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

4. Określanie wydajności białka i określonej wydajności antygenu

  1. Określ całkowitą zawartość białka przy użyciu komercyjnej metody kwantyfikacji białka, takiej jak test BCA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Aby ocenić zawartość swoistego antygenu, należy przeprowadzić bezpośredni test immunoenzymatyczny (ELISA), pokrywając seryjne rozcieńczenia standardowego antygenu i 2-5 μg całkowitej próbki białka na płaskiej płytce ELISA 96-dołkowej.
    1. Następnie należy zastosować przeciwciała specyficzne dla antygenu, aby zbadać obecność antygenów na płytce i użyć konwencjonalnych substratów rozwojowych ELISA w celu uzyskania wykrywalnej absorbancji dla czytnika mikropłytek. Na rysunku 2 przedstawiono reprezentatywne wyniki testu HA i ELISA dla próbki VLP wykazującej ekspresję HA; możliwe są wiele kombinacji HA i NA, ale plony mogą się różnić w zależności od kompatybilności HA-NA15.
      Uwaga: Przeciwciała swoiste dla antygenu mają zmienne powinowactwo i zaleca się określenie miareczkowania przeciwciał do punktu końcowego przed przeprowadzeniem kwantyfikacji VLP. Przeciwciała komercyjne będą miały sugerowane zakresy stężeń lub rozcieńczeń do stosowania w teście ELISA, a także sugerowane protokoły.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność VLP była zmienna w zależności od projektu konstruktu antygenu wirusowego. W niniejszym protokole zaprezentowano wykorzystanie komórek owadziego i ssaków do produkcji SVP lub VLP w supernatancie oraz ich oczyszczanie za pomocą ultrawirowania. Do stworzenia wersji SVP DENV (oznaczonych jako 1-4 w Table 1) wykorzystano cztery podtypy kaset ekspresyjnych strukturalnego genu prM/E DENV, co pozwoliło uzyskać zakres od 1,1 do 2,6 mg całkowitego białka w objętości 0,6 m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowaliśmy opisane powyżej techniki, aby skutecznie wyrazić i oczyścić SVP i VLP złożone z wielu białek strukturalnych dla różnych patogenów. Ogólnie rzecz biorąc, używamy systemów ekspresji ssaków do generowania naszych VLP. Jednak w naszych rękach plony CHIK VLP pochodzące z komórek ssaków były niskie. Wydajność CHIK VLP była bardziej solidna przy użyciu rekombinowanego systemu komórkowego bakulowirusa i owadów. Ogólnie rzecz biorąc, systemy komórkowe bakulowirusa-owada dają większe ilości rekombinowanych białek, c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować poprzednim członkom laboratorium Ross, którzy pomogli zoptymalizować protokół pod kątem maksymalnej wydajności i wydajności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmid Maxi KitQiagen12163
DMEMCellgro10-013
LipofectamineLife TechnologiesL3000075Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM ILife Technologies31985062
System ekspresji bakulowirusa Bac-to-BacLife Technologies10359-016
Mieszadło wielopunktowe Cimarec I 6ThermoFisher Scientific50094596
Probówki ultrawirówkowe PolyclearSeton7025Potwierdź odpowiednie probówki do ultrawirówki i rozmiar wiadra
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher Scientific23235
Bufor cytrynianu fosforanowegoSigmaP4922
o-fenylenodiamina dichlorowodorek SigmaP8287
0.22 μ m górny filtr próżniowy (500 ml)Nalgene569-0020
GlicerolSigmaG5516
H2SO4Sigma339741 
SF-900 II SFMThermoFisher Scientific10902-096

Bibliografia

  1. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
  2. Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
  3. Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
  4. Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
  5. Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
  6. Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
  7. Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
  8. Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501(2008).
  9. Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
  10. Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
  11. Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
  12. Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
  13. Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
  14. Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
  15. Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
  16. Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
  17. Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
  18. Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
  19. Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie VLPekspresja antygenuekspresja w liniach komórkowychultrawirowaniepodkład z glicerolufiltracja supernatantukwantyfikacja białektest BCAtest HA
Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.