Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

DOI:

10.3791/54048

⸱

2 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z szybkim rozwojem terapii genowych opartych na komórkach macierzystych przeciwko HIV, istnieje pilne zapotrzebowanie na model zwierzęcy do badania różnicowania hematopoetycznego i funkcji immunologicznej genetycznie modyfikowanych komórek. Humanizowany mysi model szpiku kostnego/wątroby/grasicy (BLT) pozwala na pełną rekonstrukcję ludzkiego układu odpornościowego na obrzeżach, który obejmuje limfocyty T, limfocyty B, komórki NK i monocyty. Ludzki implant grasicy pozwala również na grasiczą selekcję limfocytów T w autologicznej tkance grasicy. Oprócz badań nad zakażeniem wirusem HIV, model ten jest potężnym narzędziem do badania różnicowania, rozwoju i funkcjonalności komórek pochodzących z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Tutaj przedstawiamy konstrukcję humanizowanych, nieotyłych myszy z cukrzycą (NOD) z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) i powszechnym nokautem łańcucha gamma (c γ-/-) ze szpikiem kostnym / wątrobą / grasicą (NSG-BLT) z HSC transdukowanymi wektorem lentiwirusa receptora chimerycznego antygenu CD4 (CD4CAR). Wykazaliśmy, że HSC CD4CAR mogą z powodzeniem różnicować się w wiele linii i mają działanie anty-HIV. Celem badania jest zademonstrowanie wykorzystania mysiego modelu NSG-BLT jako modelu in vivo do zmodyfikowanej odporności przeciwko HIV. Warto zauważyć, że ze względu na to, że wykorzystuje się lentiwirusa i tkankę ludzką, eksperymenty i operacje powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) ze specjalnymi środkami ostrożności (BSL2+).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo sukcesu skojarzonej terapii antyretrowirusowej, zakażenie wirusem HIV jest nadal chorobą trwającą całe życie. Komórkowa odpowiedź immunologiczna przeciwko wirusowi HIV odgrywa bardzo ważną rolę w kontrolowaniu replikacji wirusa HIV. Ostatnie postępy w manipulacji komórkami macierzystymi pozwoliły na szybki rozwój metod terapii genowej w leczeniu HIV1-3. W związku z tym ważne jest, aby dysponować odpowiednim modelem zwierzęcym, który pozwoli na badanie in vivo skuteczności terapii komórkowych przeciwko wirusowi HIV.

Praca z HIV w modelach zwierzęcych jest skomplikowana przez fakt, że wirus infekuje tylko ludzkie komórki. Aby obejść to ograniczenie, naukowcy uciekli się do stosowania modeli chorób, takich jak małpi wirus niedoboru odporności (SIV) u makaków rezusów4,5. Niestety, model ten ma poważne ograniczenia ze względu na nieodłączne różnice między gatunkami oraz różnice między SIV a HIV. Dodatkowo tylko wysoce wyspecjalizowane obiekty są w stanie wspierać pracę z naczelnymi innymi niż ludzie, a każdy makak wymaga dużej inwestycji. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia modelu wykorzystującego ludzki układ odpornościowy, który jest podatny na zakażenie/patogenezę wirusa HIV i jest mniej zaporowy finansowo.

Humanizowany model myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD)-ciężką kombinowaną kombinacją niedoboru odporności (SCID)-częstym nokautem łańcucha gamma (cγ-/-) (lub NSG) Krew/Wątroba/Grasica (BLT) jest coraz częściej okazywany jako ważne narzędzie do badania zakażenia HIV. Poprzez wszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) i grasicy płodowej, myszy są w stanie rozwinąć i zrekapitulować ludzki układ odpornościowy1-3. Jeden z rodzajów terapii genowej opartej na komórkach macierzystych polega na "przekierowaniu" obwodowych limfocytów T na cel wirusa HIV poprzez przeprogramowanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) w celu różnicowania się w limfocyty T specyficzne dla antygenu. Wykazaliśmy wcześniej, że inżynieria HSC z molekularnym sklonowanym receptorem limfocytów T specyficznym dla HIV (TCR) przeciwko epitopowi SL9 (aminokwas 77-85; SLYNTVATL) HIV-1 Gag może przekierowywać komórki macierzyste do tworzenia dojrzałych limfocytów T, które hamują replikację HIV w humanizowanym mysim modelu NSG-BLT6. Zastrzeżenie związane ze stosowaniem sklonowanego molekularnie TCR polega na tym, że jest on ograniczony do określonego podtypu ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), co ograniczy stosowanie tej terapii. Z drugiej strony chimeryczne receptory antygenowe (CAR) mogą być powszechnie stosowane do wszystkich podtypów HLA. Wstępne badania przeprowadzono przy użyciu CAR zbudowanego z zewnątrzkomórkowych i transbłonowych domen ludzkiego CD4 połączonych z wewnątrzkomórkową domeną sygnałową ζ CD3 (określaną jako CD4ζCAR). CD4ζCAR ulega ekspresji na limfocytach T CD8 i może rozpoznawać otoczkę HIV i wyzwalać cytotoksyczną odpowiedź limfocytów T, która jest podobna do tej, w której pośredniczy receptor limfocytów T7. Niedawno wykazaliśmy, że ludzkie HSC mogą być modyfikowane za pomocą CD4ζCAR, który może następnie różnicować się w wiele linii krwiotwórczych, w tym funkcjonalne limfocyty T zdolne do tłumienia replikacji HIV w humanizowanym modelu myszy8. Wraz z szybkim postępem w terapiach chimerycznych receptorów antygenowych w leczeniu raka9 i trwającą charakterystyką silnych przeciwciał neutralizujących10-12 przeciwko HIV, które umożliwiają budowę jednołańcuchowych przeciwciał CAR, można zauważyć, że wiele nowych konstruktów kandydujących, oprócz CD4ζCAR, zostanie wygenerowanych i przetestowanych pod kątem terapii genowej chorób HIV i innych chorób opartej na komórkach macierzystych. Ponadto humanizowany mysi model NSG-BLT zawierający te specyficzne dla antygenu CAR może również stanowić użyteczne narzędzie do dokładnego badania odpowiedzi ludzkich limfocytów T in vivo. Co ważne, nasz protokół różni się od poprzednio opisanych metod budowy humanizowanych myszy BLT13-15 tym, że HSC w galaretowatej mieszaninie białek stosuje się zamiast pni wątroby płodu16. Protokół ten opisuje: 1) budowę humanizowanych myszy BLT zmodyfikowanych za pomocą CD4ζCAR; oraz 2) charakterystyka różnicowania komórek zmodyfikowanych genetycznie; oraz 3) charakterystykę funkcjonalności komórek modyfikowanych genetycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Ludzka tkanka płodowa została uzyskana z Advanced Biosciences Resources lub z Novogenix i została uzyskana bez informacji identyfikujących i nie wymagała zgody IRB na jej użycie. Badania na zwierzętach opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone za pisemną zgodą Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles i Komitetu Badań nad Zwierzętami (ARC) (UCLA) zgodnie ze wszystkimi wytycznymi federalnymi, stanowymi i lokalnymi. W szczególności badania te zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Krajowej Rady ds. Badań Naukowych oraz akredytacją i wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AALAC) na mocy protokołu UCLA ARC o numerze 2010-038-02B. Wszystkie operacje przeprowadzono w znieczuleniu ketamina/ksylazyna i izofluran i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierząt.

1. Budowa humanizowanych myszy z receptorem antygenu chimerycznego CD4

  1. Przetwarzanie grasicy płodu i izolowanie HSC CD34+ z wątroby płodu
    1. Przetwarzanie grasicy
      1. Delikatnie umyj grasicę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Powtórz krok prania 3 - 4 razy.
      2. Dodaj 7 ml pożywki RPMI + 10% FBS + długopis/paciorkowiec. Przelej wszystko na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
      3. Za pomocą skalpeli pokrój grasicę na małe kawałki o wielkości około 1 mm2. Umieść każdy kawałek grasicy w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. Używaj zakrzywionych, kleszczy podczas przenoszenia kawałków grasicy na płytkę 96-dołkową.
        1. Dodaj niewielką ilość pożywki (100 - 200 μl) do wszystkich studzienek, aby tkanka nie wyschła. Wizualizacja pod mikroskopem (te płaty mają płaty i powinny wyglądać jak worki komórek).
          UWAGA: Odrzuć wszystkie elementy, które w jakikolwiek sposób wyglądają wątpliwie; Często występuje tkanka łączna, której nie należy wszczepiać.
      4. Usunąć potwierdzone kawałki grasicy i umieścić je wszystkie w kolbie do hodowli komórek T25. Dodać 7 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS i 450 μg/ml piperacyliny/tazobaktamu i amfoterycyny B. Delikatnie rozdrobnić kolbę do wymieszania. Hodowla kolby przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2,
        UWAGA: Ten krok jest wymagany, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu tkanki.
      5. (Krok opcjonalny) Zamroź grasicę do wykorzystania w przyszłości. Zrównoważ kawałki w 90% ludzkiej surowicy AB z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) przez 10 minut. Zamrozić je w tempie od 1 ºC/min do -50 ºC, a następnie szybko schłodzić do -150 ºC. Gdy będziesz gotowy do rozmrożenia, szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 ºC i delikatnie umyć 3x w kompletnych pożywkach RPMI bez DMSO.
    2. Przetwarzanie wątroby
      1. Delikatnie umyj wątrobę w PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Powtórz krok prania 3 - 4 razy.
      2. Dodać 10 ml (Iscove's Modified Dulbecco's Media) pożywki IMDM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przelej wszystko na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
      3. Homogenizuj tkankę wątroby za pomocą dwóch skalpeli. Pokrój wątrobę na małe kawałki o wielkości około 3 mm2. Wytnij i wyrzuć białą tkankę łączną.
      4. Użyć strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 16 w celu pobrania kawałków wątroby i podłoża. Następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      5. Delikatnie ponownie zawiesić pożywkę i zawiesinę tkankową i wydalić jeszcze 5-7 razy, aby całkowicie zhomogenizować tkankę.
      6. Przygotować 10 ml pożywki IMDM uzupełnionej enzymami: 500 j./ml kolagenazy, 2400 j./ml hyluronidazy i 300 U/ml DNazy, a także 450 μg/ml piperacyliny/tazobaktamu i amfoterycyny B. Przefiltrować pożywkę przez filtr 0,22 μm, a następnie dodać pożywkę do zawiesiny wątrobowej.
      7. Zakryj stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę wątroby i szczelnie zamknij folią samouszczelniającą, taką jak Parafilm, aby zapobiec wyciekom. Obracać w rotatorze probówkowym w inkubatorze w temperaturze 37 ºC przez 90 minut.
      8. Przefiltrować rozpawioną zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 100 μm do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
        UWAGA: Dodać PBS do zawiesiny, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 ml. Podzielić to na dwie probówki po 50 ml każda, z których każda zawiera 25 ml zawiesiny komórek.
      9. Powoli i delikatnie podekryj komórki w każdej probówce pożywką wirówkową o gęstości 10 ml (np. Ficoll). Wirować z prędkością 1 200 x g przez 20 minut bez hamulca. Uwaga: wszystkie wirowania, o których mowa w niniejszym protokole, przeprowadza się w temperaturze pokojowej (25 ºC).
      10. Ostrożnie usunąć interfejs (tj. kożuch) z każdej probówki i przenieść do dwóch oddzielnych probówek o pojemności 50 ml. Doprowadzić objętość każdej probówki z interfejsem do 50 ml za pomocą PBS. Wirować z prędkością 300 x g przez 7 - 10 min. Ostrożnie odessać supernatant.
      11. Połącz dwa granulki. Przemyć jeszcze trzy razy 50 ml PBS zawierającego 2% FBS. Wirować z prędkością 300 x g przez 7 - 10 minut za każdym razem, ostrożnie zasysając supernatant.
      12. Zawiesić granulat w 50 ml pożywki RPMI + 10% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru w tym czasie przed przystąpieniem do sortowania komórek.
      13. Sortuj komórki CD34+ natychmiast za pomocą zestawu do sortowania CD34 (np. mikrokulki CD34), zgodnie z protokołem producenta.
        UWAGA: Alternatywnie komórki można hodować w pożywkach RPMI + 10% FBS w dawce 1 milion/ml przez noc.
      14. Zapisz zarówno CD34+, jak i CD34- frakcja.
        UWAGA: Na tym etapie komórki CD34+ i CD34- można zamrozić za pomocą pożywki do zamrażania Bambanker lub innych pożywek do zamrażania. Zamrozić 1 ml 4 - 6 x 106 komórek CD34+ w probówce i zamrozić 1 ml komórek 40 - 60 x 106 CD34 w probówce.
  2. Transdukcja komórek CD34+
    1. Oblicz liczbę dołków transdukcyjnych wymaganych na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. 1 dołek może być użyty do transdukcji do 8 x 106 komórek. Dla każdej myszy BLT zostanie wszczepione 0,5 x 106 CD34 + wraz z komórkami CD34 i grasicą pod torebką nerkową, a 0,5 x 106 komórek CD34 + zostanie wstrzyknięte dożylnie. Liczba komórek CD34 + do użycia zależy od liczby myszy (1 milion komórek na mysz).
    2. Pokryj wymaganą liczbę dołków 6-dołkowej płytki poddanej hodowli nietkankowej 1,25 ml rekombinowanego roztworu ludzkiej fibronektyny (np. Retronektyny) (20 μg/ml w PBS) do każdej studzienki. Przykryj płytkę i odstaw na 2 godziny w temperaturze pokojowej w czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Odessać roztwór fibronektyny z dołków i dodać 1,25 ml buforu FACS (PBS z 4% FBS) do każdej studzienki w celu zablokowania. Odstawić płytkę w temperaturze pokojowej (25 ºC) na 30 minut.
    4. Odessać bufor FACS i przepłukać studzienki raz za pomocą PBS.
    5. Przechowywać PBS w powlekanych studzienkach do czasu, gdy płytka będzie gotowa do użycia. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 ºC przez noc, jeśli nie zostanie natychmiast użyta.
    6. Umieść komórki CD34 + w pożywce infekcyjnej (2% albuminy ludzkiej surowicy w pożywce z komórek T bez surowicy Yssela) w studzienkach pokrytych roztworem fibronektyny (~2 x 106 komórek/ml) i inkubuj w temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę.
    7. Użyj pipety, aby dodać wektor lentiwirusowy do studzienek przy wielokrotności infekcji (MOI) między 2 a 10. Delikatnie wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 37 ºC.
      UWAGA: Miano użytego wektora lentiwirusa powinno być wcześniej określone.
    8. Zbierz komórki następnego ranka, delikatnie zeskrobując dno studzienek za pomocą skrobaka do komórek. W tym czasie zbierz komórki i policz za pomocą hemocytometru.
    9. Aby przygotować komórki do implantacji, połącz 0,5 x 106 transdukowanych komórek CD34+ z 4,5 x 106 komórek CD34- na mysz, podwielokrotnie w sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Odwiruj komórki w dół z prędkością 300 x g, aby je ogarnąć, odessać supernatant. Odwirować je ponownie przy 300 x g i odessać pozostały supernatant za pomocą pipety P10 i bardzo ostrożnie zasysając. Utrzymuj suche granulki na lodzie przez cały czas trwania badania. Uwaga: Aby upewnić się, że komórki są zdolne do życia, użyj granulowanych komórek i wykonaj operację w ciągu 2-3 godzin.
    10. Aby przygotować komórki do wstrzyknięcia, odwiruj 0,5 x 106 transdukowanych komórek CD34 + na mysz, aby je osadzać, odessać supernatant. Zawieś komórki w pożywce 100 μl RPMI na mysz i trzymaj na lodzie.
    11. Aby sprawdzić skuteczność transdukcji, podwielokrotność ~1 x 105 nietransdukowanych i transdukowanych komórek CD34 + z każdego stanu i hodowla w pożywce cytokinowej 200 μl (pożywka RPMI z 10% FBS, uzupełniona 100 ng / ml ludzkiej IL-3, IL-6, SCF) na płytce 96-dołkowej przez 5 - 7 dni w temperaturze 37 ºC.
      UWAGA: Komórki użyte na tym etapie nie są używane do operacji, ale w celu zapewnienia, że transdukcja zakończy się sukcesem, a wektor nie jest toksyczny dla przeżycia i odnowy komórek macierzystych. Wydajność transdukcji można sprawdzić, szukając ekspresji genów wektora (np. GFP&CD4) i analizować za pomocą cytometrii przepływowej.
  3. Przeszczepy tkanek w celu budowy genetycznie modyfikowanych myszy
    1. Tego samego dnia przed zabiegiem należy przeprowadzić napromienianie całego ciała myszy z obniżoną odpornością NOD.Cg-Prkdc Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) za pomocą promiennika cezu-137 i dawki 2,7 Gy (270Rad).
      UWAGA: Myszy NSG mają poważnie obniżoną odporność. Dlatego ich utrzymanie i utrzymanie muszą być zgodne z najwyższymi standardami zdrowotnymi i obsługiwane przez wysoko wykwalifikowany personel.
    2. Wsypać kawałki grasicy i podłoże z kolby do naczynia o średnicy 60 mm. Wlej PBS do innego naczynia o średnicy 60 mm, które posłuży do oczyszczenia trocharu i utrzymania mokrej nerki.
    3. Schłodzić końcówki pipet wyporowych, umieszczając je w otwartych sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml na lodzie. Przechowywać na lodzie z wysuszonymi granulkami komórek i galaretowatą mieszanką białek, taką jak Matrigel.
      UWAGA: Ważne jest, aby galaretowata mieszanina białek i wszelkie rurki lub końcówki, które będą jej dotykać, były zawsze zimne, dopóki igła implantu nie zostanie załadowana.
    4. Znieczulenie myszy: Waż myszy pojedynczo i zapisuj wagę; uderzaj myszy w uszy, aby je ponumerować. Wstrzyknąć im dootrzewnowo 15 μl ketaminy (2,6 mg/ml w soli fizjologicznej)/ksylazyny (100 mg/ml w soli fizjologicznej) na gram masy ciała). Umieść myszy z powrotem w klatce i poczekaj, aż zostaną w pełni znieczulone.
      UWAGA: Sprawdź poziom znieczulenia myszy, ściskając łapę. Jeśli mysz odruchowo się wzdryga, podaj 25-50% pierwotnej ilości ketaminy/ksylazyny, aby jeszcze bardziej znieczulić mysz. Poczekaj, aż nie wzdrygnie się odruchowo, aby wykonać operację.
    5. Za pomocą maszynki do strzyżenia Oster (golarki) ogol lewą stronę każdej myszy od biodra do ramienia między środkiem pleców a brzuchem. Wstrzyknąć podskórnie 0,3 ml rozcieńczonego karprofenu (6 mg/kg) w łopatkę lub trójkąt pachwinowy zwierzęcia (dół nogi). Za pomocą bawełnianego wacika nałóż małą kroplę sztucznych łez na każde oko i połóż mysz na boku z powrotem w klatce.
      UWAGA: Ogranicz przygotowanie do operacji do jednej klatki (około 4-5 myszy) na raz.
    6. Przepłucz kaniulę igły implantu raka (trokaru) o rozmiarze 16 za pomocą PBS. Za pomocą pary zakrzywionych kleszczy umieść kawałek grasicy z szalki 60 mm w otworze kaniuli z trokarem tuż wewnątrz otworu, a następnie pociągnij trokar, aby zassać tkankę do kaniuli.
    7. Za pomocą pipety wyporowej i schłodzonej końcówki umieścić 5 μl zimnej galaretowatej mieszaniny białek do probówki z wysuszonymi osadkami komórek (mieszanina CD34+ i CD34- dla wszczepionych komórek) i delikatnie wymieszać, aby wytworzyć zawiesinę komórek. Nie pipetować w górę i w dół. Odpipetować galaretowatą mieszaninę białek / zawiesinę komórek do otworu kaniuli i powoli pociągnąć za trokar, aby załadować igłę.
      UWAGA: Zaleca się, aby osoba pomocnicza ładowała pipetę podczas manipulowania igłą implantu.
    8. Przetrzyj ogolony obszar myszy jodonem powidonu, a następnie trzykrotnie przetrzyj obszar wacikiem nasączonym alkoholem. Określ najciemniejsze miejsce pod skórą. Wskazuje to na lokalizację śledziony. Nerka znajduje się około 5 mm grzbietowo do śledziony. Podnieś skórę za pomocą zakrzywionych kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami chirurgicznymi o długości 15 mm w skórze równolegle do śledziony. Następnie wykonaj podobne cięcie w warstwie otrzewnej poniżej. U mężczyzn nerka powinna być dobrze widoczna i może być wyciśnięta po prostu przez naciśnięcie na brzuch. Możesz podeprzeć nerkę hemostatem lub parą zakrzywionych kleszczy. U kobiet jajniki mają tendencję do blokowania nerki przed łatwym usunięciem. Za pomocą hemostatu podnieś jajnik i ostrożnie odsłoń nerkę.
    9. Użyj kleszczyków zakończonych igłą, aby wyrwać mały otwór na tylnym końcu torebki nerkowej.
      UWAGA: Nie używaj tych kleszczyków z końcówkami igłowymi do pracy z materiałami stanowiącymi zagrożenie biologiczne.
    10. Wsuń igłę implantu do tego otworu i wzdłuż nerki, aż otwór kaniuli zostanie całkowicie zakryty przez torebkę nerkową.
    11. Delikatnie wyciśnij tkankę pod torebkę nerkową i wyciągnij igłę z powrotem. Kawałki grasicy mogą być lepkie, więc użyj zakrzywionych kleszczy, aby upewnić się, że kawałek grasicy nie wyjdzie z igłą.
    12. Podnieś otrzewną za pomocą kleszczy i delikatnie użyj hemostatu, aby wepchnąć nerkę z powrotem na miejsce. Zawiąż jeden podwójnie zawiązany ścieg w otrzewnej za pomocą wchłanialnych szwów 4-0 vicryl. Użyj dwóch klipsów do nawijania Autoclips, aby zamknąć skórę.
    13. Wymieszaj transdukowane komórki CD34 +, które zostały odłożone do wstrzyknięcia i pobierz 100 μl (0,5x106 komórek) do strzykawki insulinowej. Wstrzyknij te komórki myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły zaoczodołowej lub inne drogi wstrzyknięcia dożylnego. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż małą kroplę sztucznych łez na każde oko i połóż mysz na boku z powrotem w klatce.
    14. Gdy wszystkie myszy zostaną wszczepione, upewnij się, że zwierzęta odzyskują przytomność i normalnie się poruszają, zanim je opuszczą.
    15. Opieka pooperacyjna: Dzień po zabiegu wstrzyknąć podskórnie 0,3 ml rozcieńczonego karprofenu (6 mg/kg) i 1,2 ml sterylnego soli fizjologicznej do każdej myszy. 2 i 3 dni po operacji wstrzyknąć podskórnie 1,5 ml sterylnego soli fizjologicznej do każdej myszy. Monitoruj myszy i nacięcia przez 10-14 dni po zabiegu. Usuń Autoclipy i zważ myszy po 10-14 dniach. UWAGA: Myszy są ospałe po napromieniowaniu, a wstrzyknięcie soli fizjologicznej zapobiega odwodnieniu zwierząt.
    16. Po 8-10 tygodniach sprawdź wszczepienie, wykrwawiając myszy i wykonując analizę FACS krwi obwodowej, barwiąc markery, takie jak CD45, CD3, CD4, CD8 i wszelkie geny, które wektor powinien wyrażać.

2. Charakterystyka różnicowania i rozwoju komórek modyfikowanych genowo

  1. Charakterystyka komórek zmodyfikowanych genami z krwi obwodowej
    1. 8 - 10 tygodni po przeszczepie należy pobrać 50 - 100 μl krwi myszy z krwawienia zaoczodołowego. Umieścić w probówkach do mikrowirówek zawierających 10 μl EDTA. Odwirować komórki przy 350 x g przez 3 min. Zebrać osocze. Zamrozić w temperaturze -80 w celu analizy ELISA lub testu wiremii w osoczu, jeśli mysz jest zakażona wirusem HIV.
    2. Dodać 2 ml roztworu NH4Cl (83%) do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (25 °C). Po inkubacji dodaj 10 ml RPMI 10% FBS do probówki do napełnienia. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 min. Ostrożnie odessać supernatant. Komórki są gotowe do barwienia immunologicznego i analizy cytometrii przepływowej oraz innych testów.
      UWAGA: Markery dla różnych linii komórek hematopoetycznych, aktywacji i markery fenotypowe dla komórek naiwnych lub komórek pamięci można mierzyć co 2 tygodnie przed i po zakażeniu HIV za pomocą cytometrii przepływowej. Bramy są tworzone przez barwienie komórek za pomocą kontrolek izotypowych. Zaleca się barwienie zdrowych ludzkich PBMC i stosowanie tego jako kontroli pozytywnej. Alternatywnie, mysz może zostać poddana eutanazji i można uzyskać do 1 ml krwi obwodowej z nakłucia serca, co zapewni wystarczającą ilość komórek do wielu paneli analizy przepływu.
  2. Charakterystyka komórek zmodyfikowanych genami ze śledziony, grasicy i szpiku kostnego
    1. Zbierz śledzionę, grasicę i szpik kostny od humanizowanych myszy BLT
      1. Eutanazja myszy przez przedawkowanie izofluranu. Potwierdź eutanazję z wtórnym zwichnięciem szyjki macicy. Spryskaj powierzchnię tuszy 70% etanolem, aby sierść nie przyklejała się do tkanek. Przypnij kończyny na tacce do wycinki wosku.
      2. Użyj nożyczek chirurgicznych, rozetnij skórę, a następnie przetnij warstwę otrzewnej, aby odsłonić jamę ciała.
      3. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy. Usuń implant grasicy z nerki za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieścić implant grasicy i śledzionę w oznakowanych probówkach zawierających 5 ml PBS.
      4. Od połowy brzucha odetnij i usuń skórę z dystalnej części myszy pokrywającej kończyny dolne.
      5. Odetnij mięśnie kończyn dolnych za pomocą nożyczek i ostrożnie zwichnij panewkę ze stawu biodrowego. Usunąć kość udową i piszczelową i umieścić je w probówce zawierającej 5 ml PBS.
    2. Izolacja splenocytów
      1. Umieść sitko o średnicy 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zwilż sitko 3 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS i Pen/strep (RPMI complete media).
      2. Umieść śledzionę na sitku do komórek. Za pomocą gumowego tłoka strzykawki o pojemności 10 ml rozgnieć śledzionę, aby rozdzielić ją przez sitko do probówki o pojemności 50 ml.
      3. Przepłucz sitko komórkowe 5 ml kompletnego podłoża RPMI 4 do 5 razy.
      4. Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 10 min.
      5. Odessać supernatant i zawiesić osad w 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj 20 ml kompletnej pożywki RPMI i wiruj z prędkością 300 x g przez 7 minut.
      6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki RPMI i ponownie przefiltrować przez sitko o średnicy 100 μm. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
        UWAGA: Komórki mogą być używane do testów ex vivo, analizy przepływu i mogą być żywotnie zamrożone do późniejszego wykorzystania. Przed zliczeniem komórek błękit trypanowy może być użyty do określenia liczby żywotnych komórek.
    3. Izolacja ludzkich tymocytów od implantu
      1. Umieścić grasicę w 5 ml PBS w dołku na płytce 6-dołkowej. Za pomocą czystych, kleszczy i nożyczek pokrój grasicę na małe kawałki.
      2. Umieść wysterylizowany kwadrat siatki ze stali nierdzewnej w studzience. Za pomocą gumowego tłoka strzykawki o pojemności 10 ml rozgnieć kawałki grasicy na siatce ze stali nierdzewnej, aby rozbić grasicę.
      3. Dobrze zawieś komórki i przecedź przez sitko o średnicy 100 μm. Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 10 min. Zawieś ogniwa w 10 ml kompletnych pożywkach RPMI. Jeśli widoczne są grudki, ponownie przepuść zawieszone komórki przez sitko do komórek.
      4. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
        UWAGA: Ogniwa mogą być używane do analizy przepływu i żywotnie zamrażane do późniejszego wykorzystania.
    4. Izolacja komórek ze szpiku kostnego
      1. Oczyść i wysterylizuj moździerz i tłuczek 70% etanolem. Umieść kość udową i piszczelową w moździerzu. Dodać 5 ml zimnego PBS. Użyj tłuczka, aby zmiażdżyć kości, aż PBS zmieni kolor na jasnoróżowy i mętny.
      2. Odpipetować płyn z moździerza i przefiltrować przez sitko o pojemności 50 μM umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyć moździerz 5 ml PBS i powtórzyć pięć razy, aż PBS stanie się klarowny.
      3. Obracać komórki w dół przy 300 x g przez 7 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml kompletnej pożywki RPMI.
      4. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
        UWAGA: Komórki mogą być używane do testów ex vivo, analizy przepływu i mogą być żywotnie zamrożone do późniejszego wykorzystania.

3. Charakterystyka funkcjonalna komórek zmodyfikowanych genetycznie

  1. Zakażenie wirusem HIV i monitorowanie replikacji wirusa w czasie
    1. Po potwierdzeniu rekonstytucji ludzkiego układu odpornościowego należy wstrzyknąć żądaną ilość wirusa HIV poprzez wstrzyknięcie do żyły zaoczodołowej za pomocą strzykawki insulinowej. Po zakażeniu wirusem HIV należy co 2 tygodnie pobierać 100 μl krwi obwodowej poprzez krwawienie zaoczodołowe.
    2. Zbierz osocze, wykonując czynności opisane w części 2.1.1 - 2.1.2. Do oznaczania wiremii HIV należy wyekstrahować wirusowe RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją producenta i zmierzyć miano wirusa za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym z odpowiednimi zestawami starterów i sond dla zastosowanego wirusa HIV 4,8,18,19.
    3. Aby zmierzyć RNA związane z komórkami HIV i zidentyfikować komórki, które są aktywnie zakażone wirusem HIV, najpierw wykonaj lizę RBC, wykonując kroki 2.1.2
    4. Zawiesić zawiesinę komórkową w 1 ml PBS, równomiernie podzielić na dwie probówki. Wirować w masie 300 x g przez 5 minut. Aspirat supernatantu.
    5. Aby zmierzyć RNA związane z komórką, wyekstrahuj RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta i wykonaj RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu odpowiednich zestawów starterów i sond.
      UWAGA: Ważne jest, aby starter/sonda nie rozpoznawała lentiwirusa używanego do modyfikacji komórek macierzystych
    6. Aby zmierzyć komórki zakażone wirusem HIV za pomocą przepływu, ponownie zawieś komórki w drugiej probówce w buforze FACS o pojemności 50 μl i wykonaj barwienie powierzchniowe pożądanym przeciwciałem, takim jak anty-CD45, anty-CD4 i anty-CD3. Po barwieniu powierzchni utrwal i przepuszczalność komórek oraz wybarwić wewnątrzkomórkowo w celu ekspresji gag za pomocą przeciwciała anty-Gag (klon KC57). Wykonaj cytometrię przepływową.
  2. Test cytokin ex vivo komórek zmodyfikowanych genowo ze splenocytów
    1. Zebrać splenocyty od myszy zgodnie z opisem w punkcie 2.2.2.
    2. Przygotuj komórki docelowe. Aby przetestować funkcjonalność limfocytów T zmodyfikowanych chimerycznym receptorem antygenowym CD4, użyj komórek T1 zakażonych wirusem HIV jako komórek docelowych. Zakażon komórki T1 wirusem HIV na 3 dni przed testem cytokin, potwierdź zakażenie wirusem HIV, barwiąc komórki wewnątrzkomórkowo przeciwciałem anty-HIV gag (klon KC57). Użyj niezainfekowanych komórek T1 jako kontrolnych komórek docelowych.
    3. Współinkubuj splenocyty z komórkami docelowymi lub kontrolnymi w stosunku 1:1 przez noc. Aby uzyskać najlepszy wynik, należy przeprowadzić miareczkowanie (1:1, 1:3, 1:9) efektora (splenocyty) w stosunku do komórek docelowych (zakażone T1). Na przykład, ponownie zawiesić 0,9 miliona splenocytów w 0,25 ml kompletnej pożywki RPMI, dodać 0,9, 0,3 lub 0,1 miliona zakażonych T1 lub niezakażonych T1 ponownie zawieszonych w 0,25 ml kompletnej pożywki RPMI.
    4. Następnego ranka dodaj inhibitor transportu białek na 6 godzin, aby zahamować transport białka i przeprowadzić barwienie markerów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowej ekspresji cytokin, jak opisano wcześniej w 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje zarys budowy humanizowanych myszy BLT ze zmodyfikowanymi komórkami macierzystymi. 10 tygodni po operacji wszczepienia implantu, myszy zostały złożone w ofierze, aby ocenić różnicowanie i rozwój komórek zmodyfikowanych genowo. Jak pokazano na rycinie 2, wiele tkanek limfatycznych (krew, śledziona, grasica i szpik kostny) pobrano od myszy, która została zmodyfikowana za pomocą CD4ζCAR. CD4ζCAR używany w tym protokole zawiera chimeryczny r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W związku z tym, że zmodyfikowana odporność oparta na CAR i HSC nabiera rozpędu w kierunku badań klinicznych, ważne jest, aby mieć odpowiedni model zwierzęcy, aby dokładnie zbadać różnicowanie i funkcję tych zmodyfikowanych komórek. W tym protokole opisaliśmy metody konstruowania i testowania humanizowanych myszy z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami macierzystymi zmodyfikowanymi przeciwko HIV. Ważne jest, aby przed przeszczepem przeprowadzić skuteczną transdukcję komórek macierzystych. Jednak ze względu na zdolność li...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Pani Jessice Selander za asystę artystyczną przy tworzeniu naszych figurek. Praca ta została sfinansowana z grantów NIAID/NIH, grant nr. RO1AI078806, Centrum Badań nad AIDS Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA), grant nr. P30AI28697, Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej, grant nr. TR4-06845, Amerykańska Federacja Badań nad AIDS (amfAR), grant nr. #108929-54-RGRL oraz wielokampusowy program i inicjatywy badawcze UC, Kalifornijskie Centrum Odkrywania Leków Przeciwwirusowych (CCADD)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw mikrokulek CD34Miltenyi130-046-702Do sortowania ludzkich komórek progenitorowych CD34+
BambankerWako302-14681Do zamrażania komórek
QIAamp Zestaw wirusowego RNA Qiagen52904Do pomiaru wiremii w surowicy
MACSQuant Flow CytometerMiltenyiDo analizy przepływu
BD LSRFortessa™BD biosciencesDo analizy przepływu
HialuronidazaSigmaH6254-500MG Do trawienia tkanek
Deoksyrybonukleaza I           WorthingtonLS002006 do trawienia tkanek
Technologia CollagenaseLife17104-019 do trawienia tkanek
System wykrywania CFX Real time PCRBioradDo pomiaru wiremii i ekspresji genów
Myszy, szczep NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJThe Jackson Laboratory5557Do konstruowania humanizowanych myszy
Penicylina Streptomycyna (Pen Strep)Thermo Fisher Scientific10378016Do hodowli komórek
Piperacylina/tazobaktamPfizerZosynPrzeciwgrzybicza
Amfoterycyna B (Fungizone przeciwgrzybicze)Thermo Fisher Scientific15290-018Przeciwgrzybicze
Klipsy do nawijania Autoclip, 9 mm - 1,000 sztukBecton Dickinson427631 Do zabiegu chirurgicznego
Sterylne fartuchy chirurgiczne Aurora wzmocnione poliamidem, 30 sztuk w opakowaniu           MedlineDYNJP2707 Do zabiegu chirurgicznego
Szwy, 4-0, vicryl                   Owens i Minor23000J304H   Do zabiegu chirurgicznego
Wkładki nasączone alkoholem                   Owens i Minor3583006818Do operacji
Rękawice chirurgiczne, 6 1/2Owens i Minor4075711102Do operacji
Yssel' s Bez surowicy T-cell MediumGemini Bio-products400-102Do transdukcji komórek CD34 + Albumina
surowicy ludzkiej Sigma-AldrichA9511do transdukcji komórek CD34 +

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  4. Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208(2009).
  5. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  6. Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).
  7. Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
  8. Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  9. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
  10. Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
  11. Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
  12. West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
  13. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  14. Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  15. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  16. Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).
  17. De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
  18. Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  19. Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  20. Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
  21. Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
  22. Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
  23. Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663(2014).
  24. McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
  25. Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stem Cell Gene TherapyCD4 Chimeric Antigen ReceptorHematopoietic Stem CellsFlow Cytometry AnalysisBLT Mouse ConstructionRetro Orbital InjectionHIV Infection ModelNSG BLT Mice

Powiązane artykuły