Method Article

Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

DOI:

10.3791/54050

⸱

June 26th, 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły genetycznego znakowania skóry myszy, chirurgicznego odnerwienia, biopsji skóry i wizualizacji oznakowanego nabłonka za pomocą barwienia β-galaktozydazą metodą całego montażu. Metody te można wykorzystać do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach normalnej i patologicznej skóry.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skórne nerwy somatosensoryczne wykrywają różne bodźce, które działają na skórę. Oprócz ich ustalonych ról sensorycznych, ostatnie badania sugerują, że nerwy mogą również modulować choroby skóry, w tym atopowe zapalenie skóry, łuszczycę i raka. W tym miejscu opisujemy protokoły testowania zapotrzebowania nerwów na utrzymanie skórnego narządu mechanosensorycznego, kopuły dotykowej (TD). W szczególności omawiamy metody genetycznego znakowania, zbierania i wizualizacji TD poprzez barwienie całej góry oraz wykonywania jednostronnego chirurgicznego odnerwienia skóry grzbietu myszy. Razem podejścia te mogą być wykorzystane do bezpośredniego porównania morfologii TD i ekspresji genów w odnerwionej i pozorowanej skórze tego samego zwierzęcia. Metody te można również łatwo dostosować do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach patologii skóry. Wreszcie, możliwość wielokrotnego pobierania próbek skóry daje możliwość monitorowania postępu choroby na różnych etapach i w różnym czasie po jej zainicjowaniu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat, coraz bardziej doceniany jest wpływ nerwów na choroby, które zwykle nie są uważane za klasyczne neuropatie1-4. Ostatnie dowody eksperymentalne sugerują, że nerwy czuciowe mogą modulować różne patologie, od łuszczycy po raka5-9. Wykazano to przy użyciu technik takich jak chirurgiczne odnerwienie i farmakologiczne hamowanie funkcji neuronalnych u gryzoni. W przypadku łuszczycy badania te dostarczyły mechanistycznych ram do zrozumienia, dlaczego ludzkie blaszki łuszczycowe cofają się po utracie funkcji neuronalnych7,10-12.

Nerwy skórne mogą również wpływać na ekspresję genów13....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały wykonane zgodnie z przepisami ustanowionymi przez Zakład Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Michigan.

1. Indukuj rekombinację genetyczną u myszy

Uwaga: Szczep myszy Gli1tm3(cre/ERT2)Alj/J (Gli1-CreERT2)13 umożliwia ukierunkowanie rekombinacji genetycznej indukowanej tamoksyfenem na nabłonek TD. Skrzyżowanie tego szczepu z myszami reporterowymi B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J (LacZ)22 w celu wygenerowania Gli1; Zwierzęta LacZ do wizualizacji komórek TD poprzez barwi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generując myszy wykazujące ekspresję indukowanego tamoksyfenem Gli1-CreERT2 i allelu reporterowego LacZ, możliwe jest uwidocznienie nabłonka TD i śledzenie losów tych komórek w czasie. Cała procedura denerwacji zazwyczaj może zostać zakończona w ciągu 1 godziny na mysz i powinna powodować minimalny stres u zwierzęcia.

Nasze poprzednie badania wykazały, że nerwy są kluczowe dla utrzymania zarówno prawidłowych TD.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerwy pełnią kluczowe funkcje nie tylko w czuciu, ale także w rozwoju, utrzymaniu i regeneracji narządów ssaków13,24-27. Ponieważ nerwy zostały ostatnio zaangażowane w różne choroby skóry, opisane tutaj techniki można wykorzystać do badania zapotrzebowania na unerwienie w różnych modelach chorób zwierzęcych. Rzeczywiście, technika jednostronnego odnerwienia pozwala na bezpośrednie porównanie skóry z nienaruszonymi lub uszkodzonymi nerwami tej samej myszy. Zapewnia to idealną kontrolę wewnętrzną w celu skompens.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Autumn Peterson za pomoc w fotografowaniu myszy, Danielowi Thoresenowi za pomoc w pracy z myszami, oraz doktorom Nicole Ward i Abdelmadjidowi Belkadiemu za pomoc w chirurgicznym odnerwieniu. Badania te były finansowane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (granty R00AR059796 i R01AR065409); Wydział Dermatologii Uniwersytetu Michigan; Program Stypendialny Nauk Biologicznych; Centrum Organogenezy; Kompleksowe Centrum Onkologiczne Uniwersytetu Michigan; oraz Fundusz Walki z Rakiem im. Johna S. i Suzanne C. Munn. Projekt S.C.P. otrzymał dofinansowanie z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wkładki nasączone alkoholemPDIB339
AnaSed (Xylazine)LloydNADA 139-236
Przeciwciało, anty-keratyna 8Badania rozwojowe Hybrydoma BankPrzeciwciało szczurze TROMA-I, stosować w stężeniu 1:500
Przeciwciało, przeciwciało królika anty-Keratyna 17Cell Signaling#4543, stosować w stężeniu 1:1,000
Przeciwciało, przeciwciało królika anty-NeurofilamentCell SignalingC28E10, stosować w stężeniu 1:500
Podkładki przygotowawcze BetadineMedlineMDS093917
Carprofen (Rimadyl)Zoetis
Akumulatorowa maszynka do strzyżeniaWahltrymer model 8900
Olej kukurydzianySigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306stosować w stężeniu 1:1,000
DeoksycholatSigma-AldrichD6750
Krem do depilacjiNair NairN/A
DimetyloforamidSigma-Aldrich319937
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Aldehyd glutarowySigma-AldrichG5882
ImmEdgePen Vector LaboratoriesH-4000
Ketamina HClHospiraNDC 0409-2051-05
Chlorek magnezuSigmaM8266
Mikro szkło osłonoweVWR48404-454
MikroprowadniceVWR48311-703
10% neutralna buforowana formalinaNici nylonowe VWRBDH0502-4LP
6-0DemeTECHNL166012F4P
Glikol oktylofenylopolietylenowySigma-AldrichI8896
O.C.T. CompoundSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
ŻelazocyjanekpotasuSigma-AldrichP9387
Żelazocyjanek potasuSigma-Aldrich702587
Fosforan sodu jednozasadowySigma-AldrichP9791
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS5136
SacharozaSigma-Aldrich84097
TamoksyfenSigma-AldrichT5648-1G
Ultra cienkie kleszczykiDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001Rozpuścić w dimetyloforamidzie, aby uzyskać 50x zapas przed użyciem

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cutaneous Surgical DenervationMouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

Related Articles