Artykuł metodologiczny

Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

DOI:

10.3791/54050

⸱

26 czerwca 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły genetycznego znakowania skóry myszy, chirurgicznego odnerwienia, biopsji skóry i wizualizacji oznakowanego nabłonka za pomocą barwienia β-galaktozydazą metodą całego montażu. Metody te można wykorzystać do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach normalnej i patologicznej skóry.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skórne nerwy somatosensoryczne wykrywają różne bodźce, które działają na skórę. Oprócz ich ustalonych ról sensorycznych, ostatnie badania sugerują, że nerwy mogą również modulować choroby skóry, w tym atopowe zapalenie skóry, łuszczycę i raka. W tym miejscu opisujemy protokoły testowania zapotrzebowania nerwów na utrzymanie skórnego narządu mechanosensorycznego, kopuły dotykowej (TD). W szczególności omawiamy metody genetycznego znakowania, zbierania i wizualizacji TD poprzez barwienie całej góry oraz wykonywania jednostronnego chirurgicznego odnerwienia skóry grzbietu myszy. Razem podejścia te mogą być wykorzystane do bezpośredniego porównania morfologii TD i ekspresji genów w odnerwionej i pozorowanej skórze tego samego zwierzęcia. Metody te można również łatwo dostosować do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach patologii skóry. Wreszcie, możliwość wielokrotnego pobierania próbek skóry daje możliwość monitorowania postępu choroby na różnych etapach i w różnym czasie po jej zainicjowaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat, coraz bardziej doceniany jest wpływ nerwów na choroby, które zwykle nie są uważane za klasyczne neuropatie1-4. Ostatnie dowody eksperymentalne sugerują, że nerwy czuciowe mogą modulować różne patologie, od łuszczycy po raka5-9. Wykazano to przy użyciu technik takich jak chirurgiczne odnerwienie i farmakologiczne hamowanie funkcji neuronalnych u gryzoni. W przypadku łuszczycy badania te dostarczyły mechanistycznych ram do zrozumienia, dlaczego ludzkie blaszki łuszczycowe cofają się po utracie funkcji neuronalnych7,10-12.

Nerwy skórne mogą również wpływać na ekspresję genów13,14 i są kluczowe dla mechanosensingu w normalnej skórze15. W szczególności nabłonek kopuły dotykowej (TD) składa się z plamy komórek naskórka walcowatego w zestawieniu z neuroendokrynnymi komórkami Merkla unerwionymi przez wolno adaptujące się włókna nerwowe typu 1 (SA1)16-18. TD pośredniczą w odczuwaniu lekkiego dotyku i wykazano, że wykazują aktywność szlaku Hedgehog5,19. Utrzymanie TD zależy od unerwienia20,21, ponieważ nerwy wydzielają ligandy Hedgehog, aby utrzymać normalne TD i związane z nimi komórki Merkla19. Ponadto unerwienie sprzyja tworzeniu się guzów zależnych od Hedgehog z nabłonka TD5. Razem badania te wzmacniają pogląd, że skomplikowane interakcje molekularne zachodzące między nerwami a otaczającymi je komórkami w ich niszy mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej fizjologii TD, a także choroby.

Aby zbadać naturę tych interakcji, opisujemy tutaj serię technik in vivo do manipulowania ekspresją genów w TD, jak również do pobierania biopsji skóry w celu wizualizacji TD po śledzeniu linii. Na koniec opisujemy procedury wykonywania jednostronnego chirurgicznego odnerwienia, w którym nerwy są usuwane z jednej strony skóry grzbietowej myszy, pozostawiając nienaruszoną stronę przeciwległą jako pozorowaną kontrolę wewnętrzną. Kilka tygodni po zabiegu porównuje się skórę odnerwioną i pozorowaną w celu oceny zmian, które zachodzą po ablacji nerwów. Chociaż techniki te są opisane w kontekście normalnych TD, procedura denerwacji została wykorzystana do zbadania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach łuszczycy6, gojenia się ran13 i nowotworzenia5. Wreszcie, ponieważ skóra jest podatna na wielokrotne biopsje, daje to możliwość monitorowania długoterminowych losów znakowanych komórek lub oceny postępu choroby w wielu punktach czasowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały wykonane zgodnie z przepisami ustanowionymi przez Zakład Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Michigan.

1. Indukuj rekombinację genetyczną u myszy

Uwaga: Szczep myszy Gli1tm3(cre/ERT2)Alj/J (Gli1-CreERT2)13 umożliwia ukierunkowanie rekombinacji genetycznej indukowanej tamoksyfenem na nabłonek TD. Skrzyżowanie tego szczepu z myszami reporterowymi B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J (LacZ)22 w celu wygenerowania Gli1; Zwierzęta LacZ do wizualizacji komórek TD poprzez barwienie w całości poniżej.

  1. Przygotować roztwór tamoksyfenu o stężeniu 12,5 mg/ml w oleju kukurydzianym.
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml dodać do 20 mg krystalicznego tamoksyfenu, a następnie 1 ml oleju kukurydzianego. Mocno przykleić probówkę do mieszalnika wirowego i wirować w sposób ciągły na najwyższym ustawieniu przy temperaturze pokojowej, aż tamoksyfen całkowicie się rozpuści (2-4 godziny), co zostało potwierdzone przez badanie probówki pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem braku cząstek tamoksyfenu.
    2. Przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml i rozcieńczyć tamoksyfen do końcowego stężenia 12,5 mg/ml z dodatkowym olejem kukurydzianym. Mieszać, wirując lepki roztwór przez dodatkowe 30 sekund. Roztwór należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C w ciemności.
  2. Wstrzyknąć roztwór tamoksyfenu dootrzewnowo do Gli1; Myszy LacZ, w objętości 200 μl na 20 g masy ciała myszy, dla skutecznej dawki tamoksyfenu 2,5 mg na 20 g masy myszy.

2. Biopsje skóry z kolekcji

Uwaga: W zależności od eksperymentu, biopsje skóry należy pobrać od kilku dni do tygodni po indukcji tamoksyfenu. W przypadku wszystkich operacji należy przestrzegać standardowych protokołów chirurgii gryzoni, w tym używania sterylnych rękawiczek, noszenia maski chirurgicznej lub siatki na włosy oraz przykrywania zwierzęcia sterylną serwetą chirurgiczną podczas zabiegu.

  1. Przygotuj 10x podstawowy roztwór znieczulający, mieszając 90 mg/ml ketaminy i 6,5 mg/ml ksylazyny w wodzie. Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy w stosunku 1:10 do sterylnego PBS tuż przed użyciem i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez okres do 8 miesięcy.
    1. Alternatywnie, znieczulenie myszy poprzez inhalację izofluranu, zaczynając od stężenia gazu 4% z tlenem, aby w pełni znieczulić zwierzę, a następnie obniżając je do 1-2% na czas trwania zabiegu.
  2. Roztwór znieczulający wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 200 μl na 20 g masy ciała myszy. Sprawdź, czy zwierzę osiągnęło właściwą płaszczyznę sedacji za pomocą testu szczypania palca u nogi i potwierdź, że częstość akcji serca i oddechów jest normalna (odpowiednio około 600 uderzeń i 160 oddechów na minutę).
  3. Użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia, aby usunąć włosy z miejsca biopsji na skórze grzbietu, uważając, aby nie naciąć ani nie uszkodzić leżącej pod spodem skóry.
  4. Przygotuj miejsce operacji, wycierając ogolony obszar w kierunku od przodu do tyłu za pomocą chusteczek Betadine i nasączonych alkoholem. Upewnij się, że wszystkie ścinki włosów zostały usunięte z witryny.
  5. Obrysuj miejsce biopsji za pomocą czarnego markera, umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej w aseptycznym obszarze chirurgicznym i przykryj sterylną serwetą chirurgiczną (w celach demonstracyjnych pominięto sterylną serwetę, aby zwiększyć widoczność).
    Uwaga: Aby uzyskać podłużne odcinki mieszków włosowych, dłuższa krawędź biopsji (krawędź do przekroju do histologii, ~1 cm) powinna przebiegać w kierunku przednio-tylnym (równolegle do kierunku mieszków włosowych), przystrzałkowo do grzbietowej linii środkowej (ryc. 1A).
  6. Użyj sterylnego skalpela #11, aby wykonać wycięcie na pełnej grubości wzdłuż zaznaczonego obszaru bez uszkadzania leżącej pod spodem powięzi mięśniowej.
    Uwaga: Wycięta tkanka skórna obejmuje naskórek, skórę właściwą, tłuszcz podskórny i panniculus carnosus. Krwawienie jest zazwyczaj minimalne.
  7. Spłaszcz wyciętą próbkę skóry na suchym ręczniku papierowym stroną do skóry właściwej skierowaną w dół, odetnij nadmiar ręcznika papierowego i przechowuj próbkę w zimnym PBS do 1 godziny, jeśli konieczne jest pobranie innych próbek. Gdy wszystko będzie gotowe, przejdź do kroków 3.1 lub 3.2, aby przetworzyć próbki do histologii, lub do kroku 4, aby zabarwić całą górę β-galaktozydazą (LacZ).
  8. Szew zamyka miejsce biopsji za pomocą nylonowych szwów 6-0, w prostym, przerywanym wzorze oddalonym od siebie o około 3 mm.
  9. Nie należy zwracać myszy, które przeszły operację, do tej samej klatki co inne zwierzęta, dopóki nie osiągną pełnej rekonwalescencji.
  10. Monitoruj zwierzęta bezpośrednio po operacji, aż odzyskają przytomność, a także codziennie, aż obszar operacyjny się zagoi, zwykle w ciągu 1 tygodnia. Stosuj leki przeciwbólowe zgodnie z wyznaczonymi instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i stosuj, jeśli myszy wykazują oznaki bólu lub niepokoju. Usuń szwy w ciągu 7-10 dni po zabiegu.
    Uwaga: W razie potrzeby przygotować roztwór przeciwbólowy, rozcieńczając karprofen (50 mg/ml roztwór podstawowy) w stosunku 1:100 w sterylnej wodzie. Roztwór wstrzyknąć podskórnie między łopatki w pobliżu karku, w dawce 200 μl na 20 g masy ciała (5 mg/kg masy ciała myszy).

3. Próbki procesowe do badań histologicznych

Uwaga: Aby naprawić i przetworzyć wyciętą tkankę, użyj jednej z poniższych metod, w zależności od zastosowania.

  1. Aby wygenerować próbki histologiczne zatopione w parafinie, utrwal skórę w 3,7% formalinie w PBS O/N w RT i przechowuj w 70% etanolu przez okres do 2 tygodni. Usuń ręcznik papierowy przed zanurzeniem w parafinie.
  2. W celu wytworzenia zamrożonych próbek histologicznych zanurz tkankę w zimnym 4% paraformaldehydzie w PBS i delikatnie wstrząsaj przez 1 godzinę. Usuń roztwór i przemyj próbkę 3 zmianami PBS, około 5 minut każda. Następnie zanurz próbkę w 30% sacharozie w PBS w celu krioochrony tkanki ("zatopienie sacharozy").
  3. Inkubować, delikatnie wstrząsając O/N w temperaturze 4 °C. Następnego dnia zdejmij ręcznik papierowy i odetnij nadmiar tkanki tłuszczowej ze strony skórnej skóry. Zanurz tkankę bezpośrednio w OCT i przechowuj zamrożony blok w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: Po podziale na sekcje, zarówno parafinę, jak i próbki mrożone można wybarwić metodą immunohistochemiczną w celu identyfikacji TD, komórek Merkla i nerwów przy użyciu przeciwciał przeciwko odpowiednio keratynie 17, keratynie 8 i neurofilamentowi, jak opisano wcześniej5,19.

4. Wizualizacja próbek za pomocą barwienia LacZ w całości

  1. Przygotuj roztwór do barwienia X-gal.
    1. Połącz 0,94 g sodu fosforanu jednozasadowego i 2,6 g dwuzasadowego fosforanu sodu w 250 ml sterylnej wody. Dostosuj pH do 7,3. Do tego dodać 0,5 ml 1 M chlorku magnezu, 0,528 g żelazocyjanku potasu i 0,412 g żelazocyjanku potasu. Dodać 250 μl glikolu oktylofenylopolietylenowego i 125 mg deoksycholanu. Roztwór bazowy można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy w ciemności.
    2. Przygotować 50-krotny roztwór wyjściowy X-gal, dodając dimetyloformamid do butelki wyjściowej X-gal, aby uzyskać roztwór o stężeniu 50 mg/ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności.
    3. Tuż przed użyciem rozcieńczyć podstawowy roztwór X-gal w stosunku 1:50 do roztworu bazowego X-gal, aby uzyskać roztwór barwiący. W przypadku mniejszych biopsji (<1cm2) należy podać 1-2 ml roztworu barwiącego na próbkę.
  2. Utrwal próbkę skóry pobraną w kroku 2.7 w roztworze zawierającym 2% paraformaldehydu/0,2% aldehydu glutarowego w zimnym PBS przez 30 minut, delikatnie wstrząsając na lodzie. W przypadku mniejszych biopsji (<1cm2) należy użyć 1-2 ml roztworu utrwalającego na próbkę.
    Uwaga: Alternatywnie, utrwal próbki w 2-4% tylko paraformaldehydzie lub tylko w 0,5% aldehydzie glutarowym. Optymalne warunki utrwalenia zależą od tkanki, stopnia ekspresji LacZ i zastosowania.
  3. Usunąć roztwór utrwalający i przepłukać próbki trzema zmianami PBS, każda po 5 minut, na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń ręcznik papierowy znajdujący się pod próbką i odetnij nadmiar tkanki tłuszczowej od strony skóry, chwytając tłuszcz kleszczami i przycinając nożyczkami preparacyjnymi.
  5. Zanurz próbkę w roztworze barwiącym X-gal i inkubuj w temperaturze 37 °C O/N. Ekspresja LacZ będzie widoczna jako niebieska plama pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1B).
    Uwaga: Jeśli intensywność sygnału jest słaba, wymień roztwór barwiący następnego dnia i powtórz inkubację O/N. Jeżeli barwienie tła jest zbyt intensywne, należy skrócić czas barwienia lub inkubować próbkę w temperaturze pokojowej zamiast 37 °C.
  6. Usunąć roztwór barwiący i umyć próbki w 3 zmianach PBS zawierających 3% DMSO przez około 5 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej so.
  7. Myj próbki w 2-3 przemianach 70% etanolu przez 5 minut każda. Próbki należy przechowywać w 70% etanolu.

5. Chirurgiczne odnerwienie

  1. Znieczulij zwierzę jak w kroku 2.2 i ogol całą skórę grzbietową.
  2. Przygotuj obszar operacyjny skóry pleców za pomocą chusteczek Betadine i nasączonych alkoholem, a następnie przykryj zwierzę sterylną serwetą chirurgiczną (w celach demonstracyjnych pominięto sterylną zasłonę, aby zwiększyć widoczność). Utrzymuj zwierzę w cieple za pomocą poduszki grzewczej podczas operacji w aseptycznym obszarze operacyjnym.
  3. Wykonaj nacięcie za pomocą sterylnego skalpela #11 wzdłuż grzbietowej linii środkowej od podstawy szyi do około 0,5 cm powyżej ogona.
  4. Używając kleszczy, delikatnie odbij skórę po lewej stronie od boku, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę od poduszek tłuszczowych łopatki w pobliżu szyi do tuż nad kończyną tylną.
    Uwaga: Nerwy grzbietowo-skórne wyglądają jak białe pasma, które przemieszczają się doogonowo przez półprzezroczystą powięź ściany tułowia, zanim wykonają ostre zagięcia i wejdą w luźną tkankę łączną pod skórą (ryc. 2).
  5. Za pomocą ultracienkich kleszczy pod mikroskopem świetlnym do preparowania należy usunąć nerwy wyłącznie z lewej strony zwierzęcia znajdującego się w miejscach anatomicznych T3-12, wyrywając z miejsca, w którym segmenty zginają się przy ścianie tułowia do miejsc ich wejścia w skórę (ryc. 2).
    1. Ustaw kleszcze pionowo i usuń nerwy, chwytając około 0,5 cm poniżej ich miejsc zgięcia i ciągnąc w górę, powodując rozciągnięcie nerwu i oddzielenie się od otaczającej tkanki (ryc. 2C-E). Uważaj, aby nie pęknąć sąsiednich naczyń krwionośnych.
    2. Kontynuuj, aż wszystkie nerwy rozciągające się od ściany tułowia do skóry zostaną usunięte. Nie zakłócaj nerwów w gęstej powięzi ściany tułowia. Utrzymuj tkankę wilgotną przez cały zabieg, okresowo aplikując krople sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej.
    3. Alternatywnie usuń nerwy, chwytając ich proksymalne końce w pobliżu ściany tułowia kleszczami i tnąc cienkimi nożyczkami. Następnie odetnij dystalne końce w pobliżu skóry (ryc. 2F-H). Na koniec usuń pośrednie segmenty nerwowe (ryc. 2I).
  6. Usuń wszelkie nerwy z płata skóry odsłoniętego w kroku 5.4. Włókna te obejmują dystalne gałęzie grzbietowych nerwów skórnych i pojawiają się jako białe rozgałęzione pasma zlokalizowane sporadycznie w tkance łącznej po stronie skórnej płata skóry (ryc. 2J-K).
    1. Aby usunąć te drobne gałęzie, ustaw cienkie kleszcze mniej więcej równolegle do powierzchni skóry, chwyć nerwy i szarp w górę, aby uniknąć przerwania naczyń krwionośnych i przebicia skóry. Kontynuuj, aż wszystkie widoczne nerwy zostaną usunięte.
  7. Używając rozwarstwienia, odbij skórę po prawej stronie nacięcia grzbietowej linii środkowej, ale nie usuwaj nerwów. Będzie to służyło jako kontralateralna kontrola sterowana pozorem.
  8. Zszyj wzdłuż grzbietowej linii środkowej w prosty przerywany wzór, aby zamknąć nacięcie. Monitorować zwierzę podczas rekonwalescencji i po operacji, jak wykazano wcześniej (kroki 2.8-10). Zdejmij szwy w ciągu 7-10 dni po zabiegu.
  9. Aby funkcjonalnie ocenić stabilne odnerwienie do kilku tygodni po zabiegu, należy usunąć włosy ze skóry grzbietowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.
  10. Delikatnie nakłuj odnerwiony obszar skóry za pomocą igły podskórnej i zwróć uwagę, czy zwierzę reaguje, zwykle drżąc lub odwracając głowę. Jeśli obszar skóry został stabilnie odnerwiony, zwierzę będzie wykazywać niewielką reakcję lub nie będzie jej wcale.
  11. Za pomocą czarnego markera obrysuj obszar braku odpowiedzi, a także obszar o podobnej wielkości i lokalizacji po przeciwległej stronie pozorowanej.
  12. Pobrać biopsje z tych miejsc, jak w krokach 2.1-2.9 do analizy.
    Uwaga: Alternatywnie, cała skóra grzbietu grzbietu, w tym obszary odnerwione i pozorowane, może zostać usunięta jako pojedynczy arkusz w celu barwienia całego mocowania, podobnie jak opisano w kroku 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generując myszy wykazujące ekspresję indukowanego tamoksyfenem Gli1-CreERT2 i allelu reporterowego LacZ, możliwe jest uwidocznienie nabłonka TD i śledzenie losów tych komórek w czasie. Cała procedura denerwacji zazwyczaj może zostać zakończona w ciągu 1 godziny na mysz i powinna powodować minimalny stres u zwierzęcia.

Nasze poprzednie badania wykazały, że nerwy są kluczowe dla utrzymania zarówno prawidłowych TD...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerwy pełnią kluczowe funkcje nie tylko w czuciu, ale także w rozwoju, utrzymaniu i regeneracji narządów ssaków13,24-27. Ponieważ nerwy zostały ostatnio zaangażowane w różne choroby skóry, opisane tutaj techniki można wykorzystać do badania zapotrzebowania na unerwienie w różnych modelach chorób zwierzęcych. Rzeczywiście, technika jednostronnego odnerwienia pozwala na bezpośrednie porównanie skóry z nienaruszonymi lub uszkodzonymi nerwami tej samej myszy. Zapewnia to idealną kontrolę wewnętrzną w celu skompens...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Autumn Peterson za pomoc w fotografowaniu myszy, Danielowi Thoresenowi za pomoc w pracy z myszami, oraz doktorom Nicole Ward i Abdelmadjidowi Belkadiemu za pomoc w chirurgicznym odnerwieniu. Badania te były finansowane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (granty R00AR059796 i R01AR065409); Wydział Dermatologii Uniwersytetu Michigan; Program Stypendialny Nauk Biologicznych; Centrum Organogenezy; Kompleksowe Centrum Onkologiczne Uniwersytetu Michigan; oraz Fundusz Walki z Rakiem im. Johna S. i Suzanne C. Munn. Projekt S.C.P. otrzymał dofinansowanie z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (grant T32 GM007315). Praca ta była również wspierana przez NIH Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wkładki nasączone alkoholemPDIB339
AnaSed (Xylazine)LloydNADA 139-236
Przeciwciało, anty-keratyna 8Badania rozwojowe Hybrydoma BankPrzeciwciało szczurze TROMA-I, stosować w stężeniu 1:500
Przeciwciało, przeciwciało królika anty-Keratyna 17Cell Signaling#4543, stosować w stężeniu 1:1,000
Przeciwciało, przeciwciało królika anty-NeurofilamentCell SignalingC28E10, stosować w stężeniu 1:500
Podkładki przygotowawcze BetadineMedlineMDS093917
Carprofen (Rimadyl)Zoetis
Akumulatorowa maszynka do strzyżeniaWahltrymer model 8900
Olej kukurydzianySigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306stosować w stężeniu 1:1,000
DeoksycholatSigma-AldrichD6750
Krem do depilacjiNair NairN/A
DimetyloforamidSigma-Aldrich319937
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Aldehyd glutarowySigma-AldrichG5882
ImmEdgePen Vector LaboratoriesH-4000
Ketamina HClHospiraNDC 0409-2051-05
Chlorek magnezuSigmaM8266
Mikro szkło osłonoweVWR48404-454
MikroprowadniceVWR48311-703
10% neutralna buforowana formalinaNici nylonowe VWRBDH0502-4LP
6-0DemeTECHNL166012F4P
Glikol oktylofenylopolietylenowySigma-AldrichI8896
O.C.T. CompoundSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
ŻelazocyjanekpotasuSigma-AldrichP9387
Żelazocyjanek potasuSigma-Aldrich702587
Fosforan sodu jednozasadowySigma-AldrichP9791
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS5136
SacharozaSigma-Aldrich84097
TamoksyfenSigma-AldrichT5648-1G
Ultra cienkie kleszczykiDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001Rozpuścić w dimetyloforamidzie, aby uzyskać 50x zapas przed użyciem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology. Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).
  4. Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. Neural control of energy balance: translating circuits to therapies. Cell. 161, 133-145 (2015).
  5. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).
  6. Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner. J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).
  7. Ward, N. L., et al. Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model. J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).
  8. Roggenkamp, D., et al. Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model. J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).
  9. Riol-Blanco, L., et al. Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation. Nature. 510, 157-161 (2014).
  10. Zanchi, M., et al. Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).
  11. Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis. Cutis. 46, 314-316 (1990).
  12. Dewing, S. B. Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section. Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).
  13. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).
  14. Liao, X. H., Nguyen, H. Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells. Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).
  15. Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. The cell biology of touch. J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).
  16. Maricich, S. M., et al. Merkel cells are essential for light-touch responses. Science. 324, 1580-1582 (2009).
  17. Reinisch, C. M., Tschachler, E. The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers. Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).
  18. Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling. Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).
  19. Xiao, Y., et al. Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).
  20. English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben). Anat Rec. 207, 79-88 (1983).
  21. Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors. J Physiol. 236, 57-82 (1974).
  22. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
  23. Wright, M. C., et al. Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice. J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).
  24. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).
  25. Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).
  26. Ueno, H., et al. Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).
  27. Westphalen, C. B., et al. Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells. J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).
  28. Uhmann, A., et al. The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment. Blood. 110, 1814-1823 (2007).
  29. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse. Mol Pain. 7, 100(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cutaneous Surgical DenervationMouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

Powiązane artykuły