Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54058

⸱

7 kwietnia 2016

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest opisanie zmian molekularnych w rogówkach u osób chorych na cukrzycę u ludzi i pokazanie, jak mogą one zostać złagodzone przez adenowirusową terapię genową w rogówkach hodowanych przez narządy. Cukrzycowa choroba rogówki jest powikłaniem cukrzycy polegającym na częstych nieprawidłowościach nerwów rogówkowych i gojeniu się ran nabłonkowych. Udokumentowaliśmy również znacząco zmienioną ekspresję kilku przypuszczalnych markerów nabłonkowych komórek macierzystych w ludzkich rogówkach z cukrzycą. Aby złagodzić te zmiany, z powodzeniem wdrożono adenowirusową terapię genową z wykorzystaniem regulacji w górę ekspresji protoonkogenu c-met i/lub regulacji w dół metaloproteinazy macierzy proteinaz 10 (MMP-10) i katepsyny F. Terapia ta przyspieszyła gojenie się ran w rogówkach cukrzycowych, nawet gdy transdukowany był tylko przedział rąbkowych komórek macierzystych. Najlepsze efekty uzyskano przy leczeniu skojarzonym. Dla ewentualnego przeszczepu pacjentom znormalizowanych komórek macierzystych przedstawiono również przykład optymalizacji transdukcji genów w hodowlach wzbogaconych komórkami macierzystymi przy użyciu wzmacniaczy polikationowych. Takie podejście może być przydatne nie tylko dla wybranych genów, ale także dla innych mediatorów gojenia się ran nabłonka rogówki i funkcji komórek macierzystych.

Wprowadzenie

Cukrzycowa choroba rogówki powoduje głównie zmiany zwyrodnieniowe nabłonka (keratopatia) i nerwów (neuropatia). Często objawia się nieprawidłowościami w gojeniu się ran nabłonkowych i redukcji nerwu rogówkowego1-4. Szacuje się, że 60-70% chorych na cukrzycę ma różne problemy z rogówką1,3. Nasze badania zidentyfikowały kilka białek markerowych ze zmienioną ekspresją w ludzkich rogówkach z cukrzycą, w tym regulację w dół protoonkogenu c-met (receptor czynnika wzrostu hepatocytów) i regulację w górę metaloproteinazy macierzy-10 (MMP-10) i katepsyny F5, 6. Udokumentowaliśmy również znacznie zmniejszoną ekspresję kilku przypuszczalnych markerów nabłonkowych komórek macierzystych w ludzkich rogówkach z cukrzycą.

W poprzednich badaniach opracowaliśmy terapię genową opartą na adenowirusie, aby normalizować poziomy markerów zmienionych na cukrzycę za pomocą ludzkiego systemu hodowli narządów rogówki cukrzycowej, który wykazuje powolne gojenie się ran, zmiany markerów cukrzycowych i zmniejszenie ekspresji markerów komórek macierzystych podobnie jak w rogówkach ex vivo 7,8. To utrzymywanie się zmian wydaje się być spowodowane istnieniem epigenetycznej pamięci metabolicznej9. Ten system hodowli był następnie wykorzystywany w terapii genowej. Cele tej terapii zostały wybrane spośród markerów o zmniejszonej ekspresji w rogówkach cukrzycowych (protoonkogen c-met) lub zwiększonej ekspresji (MMP-10 i katepsyna F).

Terapia adenowirusowa (AV) była stosowana tylko w całym przedziale rogówki z hodowlą narządów lub tylko w obwodowym przedziale rąbkowym rogówki. W tym przedziale znajdują się nabłonkowe komórki macierzyste, które odnawiają nabłonek rogówki i aktywnie uczestniczą w gojeniu się ran4,10-15. Tutaj przedstawiono protokoły dotyczące prawidłowej i cukrzycowej hodowli ludzkiego narządu rogówki, gojenia się ran nabłonkowych, izolacji i charakterystyki kultur komórek rąbka wzbogaconych komórkami macierzystymi oraz transdukcji komórek adenowirusa i rogówki. Nasze wyniki wskazują na wykonalność tej terapii w normalizacji ekspresji markerów i gojeniu się ran w rogówkach cukrzycowych do ewentualnego przeszczepu w przyszłości. Sugerują również, że terapia skojarzona jest najskuteczniejszym sposobem przywrócenia prawidłowego wzorca markerów i gojenia się nabłonka w rogówce cukrzycowej16-18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, Pensylwania) dostarczyła zgodę na przeprowadzenie sekcji zwłok zdrowych i chorych na cukrzycę ludzkich oczu i rogówek. Protokół pobierania tkanek ludzkich NDRI jest zatwierdzany przez komitet zarządzający i podlega nadzorowi National Institutes of Health. Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) EX-1055. Współpracujący chirurdzy rogówki, dr E. Maguen i dr Y. Rabinowitz, dostarczyli odrzucone obrzeża oponówki do izolacji kultur nabłonka rogówki wzbogaconych komórkami macierzystymi. Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem IRB Pro00019393.

1. Posiew ludzkiego narządu rogówki

Uwaga: Normalne i cukrzycowe rogówki lub całe oczy są odbierane w schłodzonym pożywce do przechowywania rogówki (np. Optisol GS) w ciągu 48 godzin po śmierci od krajowego dostawcy NDRI.

  1. Wyjąć rogówki z pojemnika do przechowywania za pomocą kleszczy i umyć je dwukrotnie w mieszaninie antybiotykowo-przeciwgrzybiczej (ABAM). W przypadku całych oczu wytnij rogówki z kufli za pomocą zakrzywionych nożyczek. Pozostaw co najmniej 5-milimetrową krawędź spojówki, a także umyj rogówki w ABAM.
  2. Przygotuj mieszaninę, która ma być umieszczona we wklęsłości rogówki. Składa się z bezsurowicy minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) zawierającej ABAM, 1 mg/ml kolagenu ze skóry cielęcej (wykonanego z roztworu podstawowego 10 mg/ml w 0,1 N kwasie octowym), 1% agaru i suplementu insuliny-transferyny-seleninu7.
  3. Podgrzej tę mieszaninę w kuchence mikrofalowej do wrzenia w celu sterylizacji i rozpuszczenia agaru. Może minąć do 1 minuty, zanim wszystko się rozpuści. Pozostaw nakrętkę probówki częściowo otwartą, ponieważ mieszanina łatwo się przelewa, gdy się zagotuje. Z tego powodu może być potrzebnych kilka cykli gotowania, każdy przez 10-15 sekund. Schłodzić mieszaninę do temperatury 37-39 °C.
  4. Umieść nabłonek rogówki stroną do dołu w sterylnych naczyniach o średnicy 60 mm. Wypełnić wklęsłość rogówki około 0,5 ml mieszaniny opisanej w ppkt 1.2. Mieszanina krzepnie na rogówce w ciągu 2 minut.
  5. Umieścić rogówkę stroną agarową do dołu w sterylnych naczyniach o średnicy 60 mm i dodać pełną pożywkę zawierającą MEM z ABAM i suplementem 7 (37 °C) insuliny-transferyny-seleninu, aby utrzymać jej poziom w przybliżeniu na rąbku dla hodowli na granicy faz powietrze-ciecz. Średnia objętość wynosi 7-8 ml na naczynie.
  6. Umieść naczynia z rogówkami w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 nawilżonym miską na wodę (w ten sposób poziom wilgotności jest utrzymywany na poziomie 95 °C lub wyższym) w temperaturze 35 °C (normalna temperatura rogówki). Dodawaj 100 μl pożywki (dwie krople) dziennie na nabłonek, aby zwilżyć rogówki.
  7. Monitoruj morfologię rogówki i żywotność komórek nabłonka pod mikroskopem w świetle przechodzącym za pomocą standardowego mikroskopu z obiektywem 4X. Rób to raz dziennie.
  8. Zmieniaj podłoże co trzy dni. Rogówkę można hodować przez co najmniej trzy tygodnie. W eksperymentach z terapią genową hodować rogówki przez 3-5 dni, następnie transdukować za pomocą genów będących przedmiotem zainteresowania (4.1-4.4), pozostawić na kolejne 3-5 dni w zależności od transgenu i zgodnie z protokołem gojenia się ran (2.1-2.4).

2. Gojenie się ran nabłonkowych

Uwaga: W rogówkach z cukrzycą oczyszczenie nabłonka przez mechaniczne skrobanie nie jest możliwe, ponieważ delikatna błona podstawna nabłonka ulega odklejeniu w tym procesie, co nie zdarza się w normalnych rogówkach. Tak więc, aby utrzymać normalną i cukrzycową rogówkę w podobnych warunkach gojenia się ran, stosuje się chemiczne usuwanie nabłonka za pomocą n-heptanolu19. Ta procedura usuwa nabłonek, ale pozostawia nienaruszoną błonę podstawną zarówno w normalnej, jak i cukrzycowej rogówce.

  1. Aby przeprowadzić oczyszczenie nabłonka środkowego20, umieść 5-milimetrowy krążek z bibuły filtracyjnej nasączony n-heptanolem na centralnej przedniej powierzchni rogówki na 75 sekund.
  2. Wyjmij filtr i umyj rogówki w pełnym podłożu. Wypełnić wklęsłość 0,5 ml mieszaniny agaru i kolagenu i wyhodować kulturę, jak w 1.4. Po oczyszczeniu komórki nabłonkowe zwykle obumierają i złuszczają się, pozostawiając mikroskopijnie nienaruszoną błonę podstawną7.
  3. Użyj dysków 8,5 mm do stworzenia większych ran nabłonkowych w eksperymentach z samą rąbkową terapią genową. Zapewni to udział rąbkowych komórek macierzystych w procesie gojenia.
  4. Monitoruj gojenie rogówki pod mikroskopem. Wykonuj zdjęcia z szybkością 4X i 10X każdego dnia, aż ubytek nabłonka zostanie całkowicie zagojony. Proces gojenia może trwać od 2 do 15 dni w zależności od stanu (normalny lub cukrzyca) i wielkości rany.
    Uwaga: Podczas procesu gojenia w górnej płaszczyźnie ogniskowej obserwuje się czarne komórki przypominające pająki. Komórki te są apoptozycznymi keratocytami zrębu, które obumarły po usunięciu nabłonka4. Gojenie uznaje się za zakończone, gdy te martwe komórki są przerośnięte przez gojący się nabłonek i nie są już widoczne (ryc. 2, wstawka).
  5. Po zakończeniu gojenia przeciąć rogówki na pół, zanurzyć je w związku O.C.T. i poddać procesowi immunofluorescencji pośredniej na skręcinach kriostatu lub w przypadku Western blot16,21.

3. Izolacja komórek rąbka i utrzymanie kultur wzbogaconych w komórki macierzyste

Uwaga: Przygotuj pierwotne hodowle wzbogacone w komórki macierzyste nabłonka rąbka (LESC) z brzegów twardówki. Obrzeża pochodzące od zdrowych dawców i wyrzucane po przeszczepie rogówki są odbierane od współpracujących chirurgów w standardowym nośniku do przechowywania rogówki (np. Optisol). W przeciwnym razie kultury wzbogacone w LESC można uzyskać z brzegów wyciętych z normalnych i chorych na cukrzycę całych rogówek lub kul otrzymanych z NDRI w pożywce do przechowywania rogówki.

  1. Jeśli używane są całe rogówki lub kule, najpierw odizoluj obszary rąbka. Aby to zrobić, umieść rogówkę na sterylnym plastikowym naczyniu nabłonkową stroną do góry i usuń środkowy obszar za pomocą 9-milimetrowej trepanacji (okrągłego noża rogówki). Odrzuć tę środkową część. Następnie należy wyciąć strefę rąbkową za pomocą trepanacji o średnicy 13 mm i odrzucić zewnętrzną część spojówkową. Aby wyizolować komórki, użyj obręczy rąbka przypominającej bajgiel. Przed izolacją komórek należy usunąć komórki śródbłonka i przylegające resztki tęczówki z wewnętrznej strony rogówki przeciwnej do nabłonka powierzchniowego za pomocą sterylnego wacika.
  2. Wyizolować arkusze komórek rąbka za pomocą leczenia zupazą. Inkubować każdy brzeg opony rogowej z 2,4 U/ml dypazy II w 1,5 ml pożywki bez keratynocytów (KSFM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny22.
  3. Delikatnie zdjąć arkusz komórek nabłonka rąbka z krawędzi pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczyków i zdysocjować komórki w 1 ml 0,25% roztworu trypsyny - 0,02% EDTA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj komórki w 10 ml pożywki (np. Epilife) i zagnieźdź je w proporcji 300 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej: pożywce z N2, B27 i ludzkimi suplementami wzrostu keratynocytów oraz 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
  6. Wysiewaj komórki w ilości 3,000-5,000 komórek/ml w kolbach lub 60-milimetrowych szalkach pokrytych mieszaniną ludzkich białek błony podstawnej, w tym fibronektyny, kolagenu typu IV i lamininy (FCL), w stężeniu 0,5-1 μg/cm2, w pożywce KSFM.
  7. Hodować komórki w nawilżonym inkubatorze CO2 (o wilgotności 95% lub wyższej) w temperaturze 37 °C, aż utworzą w pełni zlewające się monowarstwy. Może to potrwać 1-2 tygodnie.
    Uwaga: Regularnie potwierdzaj tożsamość komórki poprzez dodatnie barwienie immunocytochemiczne dla przypuszczalnych markerów LESC, w tym PAX6, keratyny (K) 14, K15, K17 i ΔNp63α. Szczegóły barwienia, w tym przeciwciała pierwszorzędowe, opublikowano8,16-18,22.
  8. Aby przejść przez zbiegające się komórki, należy potraktować je 1 ml 0,05% roztworu trypsyny (rozcieńczenie 0,25% roztworu w stosunku 1:5) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml roztworu inhibitora trypsyny sojowej (10 mg/ml) rozcieńczonego w stosunku 1:4 w pożywce i odwirować komórki jak w 3,5.
  9. Przemyć osad komórkowy w 3 ml rozcieńczonego roztworu inhibitora trypsyny sojowej. Umieścić komórki na szalkach pokrytych FCL (patrz ppkt 3.7) lub szkiełkach podstawowych o stężeniu 2 x 104 komórek/ml.

4. Adenowirusowa transdukcja rogówki z hodowli narządowej

Uwaga: Rekombinowane adenowirusy (AV) obejmują wektor AV (bez wstawionego genu), AV-cmet (z otwartą ramką odczytu genu c-met), AV-shM10 (z shRNA do MMP-10) i AV-shCF (z shRNA do katepsyny F). Są to geny delegujące przedsionkowo-komorową typu 5 z delecją E1/E3 pod kontrolą głównego bezpośredniego wczesnego promotora wirusa cytomegalii. Wirusy AV-cmet są generowane przy użyciu wektora AV pAd/CMV/V5-DEST16. Wirusy AV-shRNA są generowane na zamówienie przez subklonowanie sekwencji shRNA wraz z promotorem hH1 i sekwencją znacznika GFP z wektora iLenti-EGFP do niekompetentnego replikacji (-E1 / -E3) ludzkiego genomu AV typu 5 przy użyciu systemu ekspresji Adeno-417.

  1. Transdukować jedną rogówkę z każdej pary z wektorem AV i inną rogówką z AV modulującym ekspresję genów. Użyj AV-cmet przy 0,8 do 1,25 x 10 8 jednostkach tworzących płytkę (pfu) na rogówkę w pożywce hodowlanej przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, trzymając rogówki pod powierzchnią pożywki w studzience 24-dołkowej naczynia. Użyj wirusów AV-shRNA w 1-2 x 108 pfu na rogówkę.
  2. Użyj wirusów do transdukcji w pełnym pożywce uzupełnionej 75 μg/ml cytrynianu sildenafilu. Odczynnik ten aktywuje transport kaweoliny, ułatwiając wychwyt wirusa przez komórki nabłonkowe21. Ze względu na krótki okres półtrwania syldenafilu w roztworach wodnych, ponownie dodaj tę samą ilość do podłoża 4-5 godzin później. Standardowy zabieg trwa 48 godzin.
  3. Przenieś rogówki do nowych naczyń za pomocą sterylnej szpatułki o okrągłym końcu i posiew w pożywce bez AV, utrzymując pożywkę na poziomie rąbka. Po dodatkowych 4-8 dniach na granicy faz ciecz-powietrze należy przetworzyć rogówki poddane działaniu AV w celu przeprowadzenia różnych analiz lub przeprowadzenia testu na gojenie się ran nabłonkowych (patrz wyżej). Rutynowo zwilż rogówki podczas hodowli, dodając 100 μl pożywki (dwie krople) na rogówkę.
  4. Tylko w przypadku transdukcji komórek rąbka należy inkubować wirusy z rogówką na granicy faz powietrze-ciecz ze średnim poziomem na rąbku, aby uniknąć transdukcji nabłonka centralnego.

5. Transdukcja adenowirusowa hodowanych komórek rąbka

  1. Utrzymywać kultury wzbogacone w LESC w pożywce z 10 ng/ml EGF (patrz 3.5) na plastikowych naczyniach pokrytych mieszaniną FCL w stężeniu 0,5 μg/cm2.
  2. Transdukuj hodowane komórki, które osiągnęły 70-80% zbieżności z AV zawierającym gen białka zielonej fluorescencji (AV-GFP) lub zakodowane AV-GFP shRNA-GFP w zakresie wielokrotności infekcji (MOI: 1-300 pfu / komórkę), w pożywce z 2 ng / ml EGF. Przeprowadzać transdukcję przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w minimalnej objętości (0,2 ml), a następnie przez 20 godzin w pożywce o objętości 0,5 ml. Aktywator transportu kaweoliny syldenafil nie jest potrzebny do transdukcji hodowli komórkowej.
  3. Użyj jednego z następujących odczynników, które ułatwiają wiązanie przedsionkowo-komorowego z powierzchnią komórki, aby zwiększyć wydajność transdukcji przedsionkowo-komorowego: albo polikationy (1 μg/ml poli-L-lizyny lub 5 μg/ml polibrenu), albo odczynnik transdukcji 6 μl/ml (np. ViraDuctin) lub wzmacniacz transdukcji 20 μl/ml (np. ibiBoost).
  4. Po wymianie pożywki na pożywkę bez AV, inkubować hodowane komórki przez 4 dni w wilgotnym inkubatorze CO2 i ocenić poziom ekspresji GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
  5. Użyj testu gojenia się ran drapanych, aby ocenić migrację komórek w kulturach transdukowanych przez AV. Hoduj komórki w szkiełkach z komorą wielodołkową. Ułóż rany w jednej warstwie, drapiąc komórki prostym ruchem liniowym za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Po zranieniu zmień podłoże na świeże, aby usunąć oderwane komórki.
  6. Fotografuj rany każdego dnia aparatem cyfrowym podłączonym do odwróconego mikroskopu przy 4-krotnym powiększeniu. Zapisz czas, w którym gojenie jest zakończone (krawędzie rany stykają się wzdłuż całej rany).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniej wykazaliśmy, że w hodowlach narządowych rogówki różnice w ekspresji markerów cukrzycy (np. białek błony podstawnej oraz integryny α3β1) oraz gojenia ran między rogówkami normalnymi a cukrzycowymi są zachowane. Ten system hodowlowy poddano terapii genowej mającej na celu znormalizowanie poziomów markerów zmienionych przez cukrzycę, c-met, MMP-10 oraz kathepsyny F.

Gdy cały nabłonek rogówki został transdukowany ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rogówka wydaje się być idealną tkanką do terapii genowej ze względu na jej położenie na powierzchni, gdzie dostarczanie genów, a także ocena skuteczności i skutków ubocznych są łatwe. Jednak kliniczne przełożenie tego potężnego podejścia jest nadal powolne ze względu na skąpe informacje na temat genetycznych przyczyn chorób rogówki i celów terapii genowej24. Powikłania cukrzycowe, w tym zmiany rogówki, mogą mieć w dużej mierze charakter epigenetyczny, co przekłada się na pamięć metaboliczną9. Z tego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak interesów finansowych.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe od NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), grantu CTSI UL 1RR033176 (AVL) oraz grantów od Instytutu Medycyny Regeneracyjnej, Cedars-Cedars Medical Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
minimalna niezbędna pożywkaThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS Bausch & Lomb50006-OPT
ABAM mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybiczaThermo Fisher Scientific15240062
kolagen ze skóry łydki Sigma-Aldrich C9791
agar, klasa hodowli tkankowejSigma-Aldrich A1296
n-heptanolSigma-Aldrich 72954-5ML-F
O.C.T. związek VWR International25608-930
Dispase II Roche Applied Science4942078001
pożywka bez keratynocytów (KSFM) Thermo Fisher Scientific17005042
EpiLife podłoże z wapniemThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2 średni suplement, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 średni suplement, 50xThermo Fisher Scientific17504-044
ludzki suplement wzrostu keratynocytów, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
trypsyna 0,25% - EDTA 0,02% z czerwienią fenolowąThermo Fisher Scientific25200056
trypsyna 0,25% z czerwienią fenolowąThermo Fisher Scientific15050065
inhibitor trypsyny sojowej Sigma-Aldrich T6414
płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific26140079
suplement insuliny-transferyny-seleninu (ITS)Sigma-Aldrich I3146-5ML
przeciwciało przeciwko keratynie 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253
przeciwciało przeciwko keratynie 15Santa Cruz Biotechnologysc-47697
przeciwciało przeciwko keratynie 17Santa Cruz BiotechnologySC-58726
przeciwciało przeciwko Δ Np63&alfa;Santa Cruz Biotechnologysc-8609
przeciwciało przeciwko PAX6BioLegendPRB-278P-100
przeciwciało przeciwko nidogenowi-1R& D SystemsMAB2570
przeciwciała przeciwko integrynie i alfa; 3β 1EMD MilliporeMAB1992
ludzkiej fibronektynyBD Biosciences354008
ludzkiej lamininySigma-Aldrich L4445
kolagen ludzki typu IVSigma-Aldrich Adenowirus C6745-1ML
z ekspresją shRNA MMP-10 CapitalBioSciencesna zamówienie
adenowirus z ekspresją katepsyny F shRNACapital BioScienceswykonany na zamówienie
adenowirus z ekspresją zaszyfrowanego shRNA i GFPCapital BioScienceswykonany na zamówienie
adenowirus z ekspresją c-metOriGene (plazmid SC323278
adenowirus z ekspresją GFPKeraFASTFVQ002
cytrynian sildenafilu, 25 mgPfizerz apteki
naskórkowy czynnik wzrostu Thermo Fisher ScientificPHG0311
poli-L-lizynaSigma-Aldrich P4707
polibrenSigma-Aldrich 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Niemcy50301
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Szpatułka z okrągłym końcem Corning Szalki Petriego Dow Corning3005
60 mmThermo Fisher Scientific174888
Szkiełka wielodołkowe Nunc Lab-Tek II Sigma-AldrichC6807
200 μ l końcówki do pipetBioexpressP-1233-200inni dostawcy dostępne
mikroskop odwrócony NikonDiaphotinni dostępni dostawcy/modele
nawilżany inkubator CO2 Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)inni dostępni dostawcy/modele
fluorescencyjnyOlympus, JaponiaBX-40inni dostępni dostawcy/modele
preparacyjny mikroskop stereoskopowyLeica, NiemcyS4 Edostępni dostawcy/modele
wykonany mikroskop inni

Bibliografia

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425(2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

protoonkogen c-metobniżenie poziomu MMP-10inhibicja katepsyny Fwzmacniacze polikationowe
Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.