Method Article

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

DOI:

10.3791/54059

⸱

August 8th, 2016

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology, Daejeon, South Korea

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawny rozwój techniki wysokoprzepustowego testu jednokomórkowego umożliwia badanie przesiewowe nowych enzymów w oparciu o funkcjonalne działania z dużej biblioteki metagenomicznej1. Wcześniej zaproponowaliśmy system badań przesiewowych enzymów genetycznych (GESS), który wykorzystuje regulator dimetylofenolu aktywowany przez fenol lub p-nitrofenol. Ponieważ ogromna liczba naturalnych reakcji enzymatycznych wytwarza te związki fenolowe z substratów pochodzących z fenolu, ten pojedynczy genetyczny system przesiewowy może być teoretycznie zastosowany do badań przesiewowych ponad 200 różnych enzymów w bazie danych BRENDA. Pomimo ogólnego zastosowania GESS, zastosowanie procesu przesiewowego wymaga określonej procedury w celu osiągnięcia maksymalnych sygnałów cytometrii przepływowej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy opracowany proces badań przesiewowych, który obejmuje wstępne przetwarzanie metagenomu za pomocą GESS oraz działanie sortera cytometrii przepływowej. Trzy różne substraty fenolowe (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu) z GESS wykorzystano do badań przesiewowych i identyfikacji trzech różnych enzymów (odpowiednio lipazy, celulazy i fosfatazy alkalicznej). Wybrane aktywności enzymów metagenomicznych potwierdzono jedynie za pomocą cytometrii przepływowej, ale sekwencjonowanie DNA i różnorodne analizy in vitro mogą być wykorzystane do dalszej identyfikacji genów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opracowana technika wysokoprzepustowego testu jednokomórkowego pozwala na badanie przesiewowe nowych enzymów z dużej biblioteki genetycznej na podstawie ich aktywności funkcjonalnej1. Na poziomie pojedynczej komórki białka regulujące transkrypcję są wykorzystywane do wyzwalania ekspresji genu reporterowego poprzez wykrywanie małych cząsteczek, które są wytwarzane w wyniku aktywności docelowego enzymu. Jedno z wczesnych podejść polegało na wyizolowaniu operonu rozkładającego fenole z Ralstonia eutropha E2 przy użyciu metody przesiewowej ekspresji genetycznej indukowanej substratem (SIGEX), w której substrat indukuje ekspresję białka reporterowego2. NhaR Pseudomonas putida wykorzystano do wyselekcjonowania dehydrogenazy benzaldehydowej3, a LysG z Corynebacterium glutamicum wykorzystano do wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowego szczepu wytwarzającego L-lizynę z różnych zmutowanych bibliotek4.

Poprzednio, system badań przesiewowych enzymów genetycznych (GESS) był proponowany jako ogólnie stosowana platforma przesiewowa5. System ten wykorzystuje regulator dimetylofenolu rozpoznający fenole, DmpR, P. putida. DmpR(E135K) i mutant DmpR mogą być również stosowane w GESS (pNP-GESS) do wykrywania p-nitrofenolu (pNP). W obecności docelowych enzymów wytwarzających związki fenolowe, GESS w komórkach E. coli emituje sygnał fluorescencyjny, umożliwiając szybką izolację pojedynczych komórek za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek (FACS). Ale ekspresja enzymu metagenomicznego wydaje się być słabsza niż w przypadku konwencjonalnych enzymów rekombinowanych; W związku z tym GESS zaprojektowano do wykrywania związków fenolowych z maksymalną czułością poprzez badanie kombinacji rybosomalnego miejsca wiązania (RBS) i sekwencji terminatora wraz z optymalnymi warunkami pracy5.

Jedną z podstawowych zalet GESS jest to, że ta pojedyncza metoda teoretycznie pozwala na badanie przesiewowe ponad 200 różnych typów enzymów w bazie danych BRENDA (Tabela 1, http:// www.brenda-enzymes.info, 2013.7) poprzez proste zastosowanie różnych substratów. Wykazano, że celulazę, lipazę i hydrolazę parationu metylowego (MPH) można wykryć za pomocą pNP-GESS z odpowiednimi substratami odpowiednio p-nitrofenylomaślanu, p-nitrofenylo-cellotriozydu i parationu metylowego5. Niedawno udowodniono, że fosfataza alkaliczna (AP), która jest jednym z nowych enzymów zidentyfikowanych za pomocą pNP-GESS, jest pierwszym termolabilnym AP znalezionym w metagenomach morskich przystosowanych do zimna6.

Tutaj przedstawiono szczegóły procesu przesiewowego, w którym pNP-GESS wykrywa aktywność trzech różnych typów enzymów - lipazy, celulazy i fosfatazy alkalicznej - i szybko identyfikuje nowe enzymy kandydujące z biblioteki metagenomicznej5,6. Procesy obejmują wstępne przetwarzanie metagenomu za pomocą pNP-GESS oraz obsługę sortera cytometrii przepływowej. Podczas gdy uzyskane trafienia będą musiały zostać zsekwencjonowane w celu dalszej identyfikacji, protokół ten obejmuje procedurę aż do etapów potwierdzania aktywności enzymu za pomocą cytometrii przepływowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie biblioteki metagenomicznej za pomocą pNP-GESS

  1. Skonstruuj bibliotekę metagenomiczną w E. coli z wektorem fosmidowym przy użyciu zestawu produkcyjnego biblioteki fosmid zgodnie z protokołem producenta 5.
  2. Podwielokrotność 100 μl biblioteki do przechowywania w temperaturze -70 °C, która jest źródłem komórek biblioteki metagenomicznej.
    Uwaga: Gęstość optyczna próbki mierzonej na długości fali 600 nm (OD600) tego zasobu bibliotecznego wynosi około 100.
  3. Rozmrozić 100 μl podstawowej biblioteki metagenomicznej na lodzie i zaszczepić w kolbie o pojemności 500 ml zawierającej 50 ml Luria-Bertani (LB) i 12,5 μg/ml chloramfenikolu, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  4. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić szybko osad w 50 ml lodowatej wody destylowanej (DW) i ponownie odwirować przy 1.000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zawiesić osad w 50 μl lodowatego DW z 10% (v/v) glicerolem. Do elektroporacji należy użyć 50 μl tej podwielokrotności ogniwa.
  7. Umieścić mieszaninę elektrokompetentnych komórek 50 μl i pGESS(E135K)5 DNA (100ng) w lodowatej kuwecie do elektroporacji i elektroporować (1,8 kV/cm, 25 μF) mieszaninę.
  8. Szybko dodaj 1 ml super optymalnego bulionu z pożywką do represji katabolitycznej (SOC) i delikatnie zawieś komórki.
  9. Przenieść komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  10. Rozprowadzić 500 μl odzyskanych komórek na kwadratowej płytce LB 20 x 20 cm zawierającej 12,5 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 12 godzin.
  11. Zeskrob kolonie za pomocą skrobaka do komórek i zbierz komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą lodowatego podłoża do przechowywania komórek.
  12. Wirować przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml lodowatego podłoża do przechowywania komórek, aby osiągnąć OD600 100.
  13. Podwielokrotność 20 μl komórek do przechowywania w temperaturze -70 °C.

2. Usuwanie fałszywych alarmów z biblioteki metagenomicznej

  1. Rozmrozić podstawowe komórki biblioteki metagenomicznej (z kroku 1.13) zawierające metagenomiczne DNA fosmid i pGESS(E135K) na lodzie.
  2. Zaszczepić 10 μl komórek w 2 ml LB zawierającym 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu w 14-mililitrowej probówce okrągłodennej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 4 godziny.
  3. W międzyczasie włącz komputer FACS i otwórz domyślne oprogramowanie FACS. Użyj następujących ustawień: średnica końcówki dyszy, 70 μm; Czułość FSC-A (Forward Scatter Area), wzmocnienie logarytmiczne 300 V; Czułość bocznego obszaru rozproszenia (SSC-A), wzmocnienie logarytmiczne 350 V; Czułość obszaru izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC-A), amplifikacja logarytmiczna 450 V; parametr progowy, wartość FSC-A 5,
    Uwaga: Typowe ustawienia są podane dla urządzenia FACS wymienionego w Tabeli materiałów. Dostosuj ustawienia dla innych urządzeń FACS.
  4. Rozcieńczyć komórki biblioteki metagenomicznej z kroku 2.2, dodając 5 μl próbki do 5-mililitrowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 1 ml PBS.
  5. Umieść rozcieńczoną próbkę biblioteki w porcie ładowania instrumentu FACS i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji oprogramowania FACS.
  6. Dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 1 500 zdarzeń na sekundę, klikając i kontrolując przyciski Natężenie przepływu na pulpicie nawigacyjnym.
  7. Utwórz wykres punktowy SSC-A skalowany logarytmicznie i SSC-A skalowany logarytmicznie w arkuszu globalnym, klikając przycisk Wykres punktowy na pasku narzędzi. Dostosuj bramkę punktową R1, aby objąć zdarzenia singlet (populację bakterii) za pomocą przycisku Bramka wielokątna na pasku narzędzi.
  8. Narysuj histogram z liczbą komórek w porównaniu ze skalą logarytmiczną FITC-A w arkuszu, klikając przycisk Histogram. Następnie dostosuj napięcie FITC z zakładki Ustawienia cytometru w oknie Inspector Control tak, aby szczyt rozkładu w kształcie dzwonu był mniejszy niż 102 FITC-A.
  9. Utwórz wykres FSC-A skalowany logarytmicznie w stosunku do wykresu logarytmicznego FITC-A, klikając przycisk Wykres punktowy w arkuszu globalnym. Ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Bramka wielokątna na pasku narzędzi tak, aby bramka znajdowała się między komórkami od +5% do -5% od środka rozkładu (łącznie 10% komórek wokół szczytu krzywej w kształcie dzwonu).
  10. Umieścić probówkę zbiorczą zawierającą 1,2 ml LB zawierającą 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu na wylocie przyrządu FACS i posortować 106 komórek spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.
  11. Zdejmij probówkę zbiorczą, nakrętkę i delikatnie odwiruj.

3. Badania przesiewowe enzymów metagenomicznych

  1. Inkubować posortowane komórki (od etapu 2.11) w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,5.
  2. Dodać 1 μl roztworu indukującego kopiowanie, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidu. Inkubować komórki przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
  3. Aby przygotować komórki do sortowania, dodać 0,5 ml hodowanych komórek i odpowiedni substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd lub fosforan fenylu) do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej o końcowym stężeniu 100 μM.
    1. W przypadku próbki kontrolnej dodać 0,5 ml hodowanych komórek z kroku 3.2 do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej. Dodaj tę samą objętość PBS, co objętość substratu w kroku 3.3.
  4. Inkubować obie próbki w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min przez 3 godziny.
  5. W międzyczasie przygotuj maszynę FACS z tymi samymi konfiguracjami, co w kroku 2.3.
  6. Dodać 5 μl komórek (do sortowania) i komórek kontrolnych do dwóch probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml zawierających odpowiednio 1 ml PBS.
  7. Umieść rurkę zawierającą komórki kontrolne w porcie ładowania FACS i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji oprogramowania FACS. Dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę, kontrolując przyciski natężenia przepływu na pulpicie nawigacyjnym.
  8. Utwórz wykres punktowy SSC-A skalowany logarytmicznie i logarytmicznie skalowany SSC-A, klikając przycisk Dot Plot w globalnym arkuszu oprogramowania i dostosuj bramkę punktową R1, aby objąć zdarzenia singlet (populację bakterii) za pomocą przycisku Polygon Gate na pasku narzędzi.
  9. Utwórz wykres punktowy FITC-A w skali logarytmicznej i logarytmicznej FITC-A, klikając przycisk Wykres punktowy w arkuszu roboczym i ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Bramka wielokątna na pasku narzędzi, tak aby mniej niż 0,1% komórek ujemnych zostało wykrytych w bramce R2.
  10. Zastąp probówkę do pobierania próbek kontrolnych probówką do sortowania próbek i dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę, kontrolując przyciski natężenia przepływu na desce rozdzielczej.
  11. Umieścić probówkę zbiorczą zawierającą 0,5 ml LB na wylocie przyrządu FACS i posortować 104 komórek spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.
    Uwaga: Kryterium sortowania może wynosić od 0,1% do 5% FITC-A w bramce R2. W tym protokole górny 1% komórek zebrano jako dodatnie.
  12. Zdejmij probówkę zbiorczą, nakrętkę i delikatnie odwiruj.
  13. Pobrane próbki o wielkości 0,5 ml rozprowadzić na dwóch płytkach agarowych (szalki Petriego o średnicy 90 mm) zawierających LB, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml chloramfenikolu i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
  14. W razie potrzeby wykonaj dodatkowe rundy sortowania w celu wzbogacenia FITC-A, powtarzając kroki 3.1-3.14.

4. Wybór trafień i potwierdzenie aktywności enzymu

  1. Analiza cytometrii przepływowej
    1. Z inkubowanej płytki w kroku 3.14 wybierz kolonię niewykazującą fluorescencji za pomocą selektora kolonii pod obserwacją długości fali 488 nm oświetlacza LED.
    2. Zaszczepić wybraną kolonię w 14-mililitrowej probówce okrągłodennej zawierającej 2 ml LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż jej OD600 osiągnie 0,5.
    3. Dodać 2 μl roztworu indukcji kopiowania, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidu. Inkubować komórki przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    4. Przygotować probówkę okrągłodenną o pojemności 14 ml i dodać 1 ml hodowanych komórek (etap 4.1.3). Dodać odpowiedni substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd lub fosforan fenylu) o końcowym stężeniu 100 μM.
      1. Dla kontroli, dodać 1 ml hodowanych komórek z kroku 4.1.3 do 14 ml probówki okrągłodennej i dodać taką samą objętość PBS, jak objętość substratu w kroku 4.1.4.
    5. Inkubować obie próbki w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min przez 3 godziny.
    6. W międzyczasie przygotuj maszynę FACS z tymi samymi konfiguracjami, co w kroku 2.3.
    7. Dodać 5 μl komórek kontrolnych i komórek poddanych działaniu substratu do 5 ml probówek okrągłodennych zawierających odpowiednio 1 ml PBS.
    8. Umieść rurkę zawierającą komórki kontrolne w porcie ładowania urządzenia FACS i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji oprogramowania FACS. Dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę za pomocą przycisków Natężenie przepływu na pulpicie nawigacyjnym.
    9. Kliknij przycisk Akwizycja, aby zmierzyć FITC-A.
    10. Zastąp probówkę z próbką kontrolną probówką z próbką poddaną działaniu substratu. Dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę za pomocą przycisków Natężenie przepływu na pulpicie nawigacyjnym.
    11. Kliknij przycisk Akwizycja, aby zmierzyć FITC-A.
    12. Porównaj fluorescencję dwóch grup komórek, wykreślając histogram liczby komórek w porównaniu z logarytmicznie skalowanym FITC-A.
  2. Inne testy potwierdzające aktywność enzymu
    1. W celu dalszej identyfikacji wybranych kandydatów na enzymy, należy wyekstrahować fosmidowe DNA przy użyciu standardowych procedur ekstrakcji z dostępnych na rynku zestawów ekstrakcyjnych i przeanalizować sekwencję nukleotydów lub przetestować aktywność enzymu in vitro 6,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy substraty fenolowe zostały zbadane w celu zidentyfikowania nowych enzymów metagenomicznych z biblioteki metagenomów płaskich osadów oceaniczno-pływowych w Taean, Korea Południowa, postępując zgodnie z proponowanym protokołem. W celu budowy biblioteki do fosmidów wstawiono średnio 30 - 40 kb sekwencji metagenomu, które są oparte na replikonie czynnika F E. coli i przedstawione jako pojedyncza kopia w komórce. Należy zauważyć, że fosmidy są szeroko stosowane do konstruowania z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwiększenie wydajności produkcji biokatalizatorów jest kluczem do sukcesu przemysłu opartego na biochemii9 , a metagenom jest uważany za jedno z najlepszych naturalnych źródeł enzymów. W tym sensie niezbędne jest badanie przesiewowe nowych enzymów z metagenomu, w którym większość zasobów genetycznych nie została zbadana10. Opracowano kilka metod badań przesiewowych, które bezpośrednio wykrywają produkty enzymatyczne za pomocą aktywatorów transkrypcji11, 12 , ale techniki te wymagają specy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 oraz KRIBB Research Initiative Program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw produkcyjny biblioteki CopyControlEpicentre CCFOS110Fosmid 
Rozwiązanie indukcyjne CopyControlEpicentrumCCIS125Fosmid Rozwiązanie do indukcji kopiowania
EPI300EpicentrumEC300110Elektrokompetentna
komórka pCC1FOSEpicentrumCCFOS110wektor Fosmid
Gene Pulser MxcellBio-RadKuweta i system elektroporacji
FACSAria IIIBecton DickinsonCytometria przepływowa (maszyna FACS)
NikonAZ100M 
UltraSlim Oświetlacz Maestrogen
50-ml tuba stożkowaBD Falcon
14-ml tuba okrągłodenna BD Falcon
5-ml probówka okrągłodennaBD Falcon
p-nitrofenyl fosforanSigma-AldrichN7653Podłoże
p-nitrofenyl β-D-celobiozydSigma-AldrichN5759Podłoże
p-butylan nitrofenyluSigma-AldrichN9876& nbsp;substrat
Luria-Bertani (LB)BD Difco244620Trypton 10 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L, Chlorek sodu 10 g/L
Super Optimal Rosół (SOB)BD Difco244310Trypton 20 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L, Chlorek sodu 0,5 g/L, Siarczan magnezu 2,4 g/L, Chlorek potasu 186 mg/L
Super Optymalny bulion z represją katabolitu (SOC)SOB, 0,4 % glukozy
2x Ekstrakt drożdżowy Trypton (2xYT)BD Difco244020Trawienie kazeiny przez trzustkę 16 g/L, Ekstrakt drożdżowy 10 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L
Pożywka2x bulion YT, 15% Glicerol, 2% Glukoza
pGESS(E135K)Wektor DNA zawierający geny dmpR, egfp wraz z odpowiednimi promotorami, RBS i terminator.
Zobacz odnośnik 5 w manuskrypcie, aby uzyskać informacje Więcej szczegółów.
ChloramfenikolSigmaC0378
AmpicylinaSigmaA9518
BD FACSDivaBecton DickinsonCytometria przepływowa Wersja oprogramowania 7.0
PBSGibco70011-0440,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4
Mikroskop LED do przechowywania komórek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
  2. Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
  3. Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
  4. Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40(2012).
  5. Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
  6. Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
  7. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  8. Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
  9. Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
  10. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
  11. Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
  12. Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
  13. Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
  14. Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetic Enzyme Screening SystemHigh throughput ScreeningFlow Cytometry SorterMetagenomic LibraryPhenolic SubstratesEnzyme Activity ScreeningFACS SortingGFP Reporter ExpressionSubstrate InductionEnzyme Identification

Related Articles