Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji blaszek amyloidowych Aβ w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą metoksy-X04, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Umożliwia wstępne badanie przesiewowe skrawków tkanek zawierających płytkę przed barwieniem immunologicznym i przetwarzaniem do mikroskopii elektronowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szczegółowy protokół jest tutaj dostępny do identyfikacji blaszek amyloidowych Aβ w sekcjach mózgu z mysich modeli choroby Alzheimera przed wstępnym wprowadzeniem barwienia immunologicznego (szczególnie dla zjonizowanej cząsteczki adaptera wiążącego wapń 1 (IBA1), białka wiążącego wapń wyrażonego przez mikroglej) i przetwarzania tkanek do mikroskopii elektronowej (EM). Methoxy-X04 to barwnik fluorescencyjny, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Wstrzyknięcie zwierzętom metoksy-X04 przed uśmierceniem i utrwaleniem mózgu pozwala na wstępne badanie przesiewowe i selekcję skrawków mózgu zawierających płytkę do dalszego przetwarzania przy użyciu czasochłonnych manipulacji. Jest to szczególnie pomocne podczas badania wczesnej patologii choroby Alzheimera w określonych obszarach lub warstwach mózgu, które mogą zawierać bardzo mało blaszek, obecnych tylko w niewielkiej części odcinków. Pośmiertne przetwarzanie skrawków tkanek za pomocą czerwieni Kongo, tioflawiny S i tioflawiny T (lub nawet metoksy-X04) może oznaczać arkusze plisowane β, ale wymaga intensywnego oczyszczania etanolem w celu usunięcia nadmiaru barwnika, a procedury te są niezgodne z konserwacją ultrastrukturalną. Nieefektywne byłoby również znakowanie Aβ (i innych markerów komórkowych, takich jak IBA1) na wszystkich odcinkach mózgu z regionów będących przedmiotem zainteresowania, tylko po to, aby uzyskać niewielką frakcję zawierającą blaszki Aβ we właściwym miejscu. Co ważne, blaszki Aβ są nadal widoczne po przetworzeniu tkanki pod kątem EM, co pozwala na precyzyjną identyfikację obszarów (zwykle z dokładnością do kilku milimetrów kwadratowych) do zbadania za pomocą mikroskopu elektronowego.
Wprowadzenie
Tworzenie się blaszek amyloidowych Aβ jest główną cechą neuropatologiczną choroby Alzheimera (AD). Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na ważną rolę układu odpornościowego w postępie choroby1,2. W szczególności nowe dane z badań przedklinicznych i klinicznych ustaliły, że dysfunkcja immunologiczna jest głównym czynnikiem napędzającym i przyczyniającym się do patologii choroby Alzheimera. Dzięki tym odkryciom centralne i obwodowe komórki odpornościowe stały się obiecującymi celami terapeutycznymi dla AD3. Poniższy protokół łączy mikroskopię świetlną i elektronową (EM) w celu uzyskania nowych informacji na temat związku między osadzaniem się blasz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Etyki Zwierząt, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami zarządzanymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Université Laval. Użyto samców myszy APP-PS1 w wieku od 4 do 21 miesięcy. Zwierzęta te były trzymane w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w temperaturze 22 - 25 °C ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
1. Przygotowanie roztworu Methoxy-X04
- Przygotować roztwór methoxy-X04 9 o stężeniu 5 mg/mlprzez rozpuszczenie metoksy-X04 w roztworze zawierającym 10% dimetylosulfotlenk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W tej sekcji przedstawiono wyniki, jakie można uzyskać w różnych krytycznych etapach protokołu. W szczególności wyniki ukazują przykłady przekrojów mózgu zawierających blaszki barwione methoxy-X04 w konkretnych obszarach i warstwach zainteresowania: w polu CA1 hipokampa, stratum radiatum oraz stratum lacunosum-moleculare. Blaszki oraz organizacja regionalna i warstwowa hipokampa są następnie wizualizowane przy użyciu kombinacji filtrów UV i światła białego (Rysunek 1). Wy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten wyjaśnia korelacyjne podejście do celowania w gęste blaszki rdzeniowe Aβ za pomocą EM. Wstrzyknięcie Methoxy-X04 in vivo umożliwia szybką selekcję wycinków mózgu, które zawierają blaszki Aβ w określonych regionach i warstwach zainteresowania, na przykład hipokampie CA1, warstwach promieniowych i lacunosum-moleculare. W niniejszym przykładzie wstępne badania przesiewowe metoksy-X04 połączono ze wstępnym zatopieniem barwienia immunologicznego dla IBA1 w celu zbadania, w jaki sposób różne fenotypy mikr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni dr Sachiko Sato i Julie-Christine Lévesque z Platformy Bioobrazowania Centre de recherche du CHU de Québec za ich pomoc techniczną. Granty z Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation oraz The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada dla M.E.T wsparły tę pracę.
H.E.H. jest stypendystą libańskiego Ministerstwa Edukacji i Szkolnictwa Wyższego, a K.B. z Faculté de médecine Université Laval.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrat w tabletce |
| Glikol propylenowy | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Uwaga: toksyczny |
| Chlorek sodu NaCl | Sigma | S9625 | |
| Jednowodny fosforan sodu jednowodny | Sigma | S9638 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma | S0876 | |
| Tris Chlorowodorek | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Akroleina | Sigma | 110221 | Uwaga: Toksyczna |
| paraformaldehyd Granulowana | mikroskopia elektronowa Nauki | 19210 | Uwaga: Toksyczna |
| bibuła filtracyjna | Fisher | 09-790-14F | |
| Pompa perystaltyczna z rurką | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Zestaw do pobierania krwi Winged Igły 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Ekstradrobne kleszcze | FST | 11152-10 | Kształt końcówki: zakrzywione |
| Nożyczki | FST | 14090-09 | Kształt końcówki: prosty |
| Hartman Hemostats | FST | 13003-10 | Kształt końcówki: zakrzywione |
| Nożyczki chirurgiczne | FST | 14004-16 | Kształt końcówki: proste |
| Nożyczki do mikro preparacji | Sklep chirurgiczny ROBOZ | 5818 | |
| Szklane fiolki scyntylacyjne | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Mikrotom z ostrzem wibracyjnym Leica VT1000 S | Leica Biosystems | ||
| Ostrza wibratomu | Mikroskopia elektronowa Sciences | 71990 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych | Fisher Scientific | 353047 | |
| Glikol etylenowy | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glicerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Nadtlenek wodoru, 30% | J.T.BAKER | kat.: 2186-01 | |
| Borowodorek sodu | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Surowica bydlęca (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anty IBA1, Królik | WAKO | 019-19741 | |
| Kozia anty-królicza IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (standardowy) | Vector Labs | PK-6100 | |
| Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Uwaga: toksyczny |
| tetratlenek osmu, 4% roztwór | Mikroskopia elektronowa Nauki | 19150 | Uwaga: toksyczny |
| Durcupan™ Jednoskładnikowa żywica ACM A | Sigma | 44611 | Uwaga: Toksyczny |
| Durcupan™ Jednoskładnikowy utwardzacz ACM B | Sigma | 44612 | Uwaga: Toksyczny |
| Durcupan i handel; Jednoskładnikowy plastyfikator ACM C | Sigma | 44613 | Uwaga: Toksyczny |
| Durcupan i handel; Jednoskładnikowy akcelerator ACM D | Sigma | 44614 | Uwaga: Toksyczny |
| etanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Tlenek propylenu | Sigma | 110205 | Uwaga: |
| Aluminiowe naczynia wagowe | Mikroskopia elektronowa Nauki | 70048-01 | |
| ACLAR® – Folie fluoropolimerowe | Mikroskopia elektronowa Nauki | 50425 | |
| Piec/inkubator | VWR |
Bibliografia
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
