Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Summary

Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji blaszek amyloidowych Aβ w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą metoksy-X04, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Umożliwia wstępne badanie przesiewowe skrawków tkanek zawierających płytkę przed barwieniem immunologicznym i przetwarzaniem do mikroskopii elektronowej.

Abstract

Szczegółowy protokół jest tutaj dostępny do identyfikacji blaszek amyloidowych Aβ w sekcjach mózgu z mysich modeli choroby Alzheimera przed wstępnym wprowadzeniem barwienia immunologicznego (szczególnie dla zjonizowanej cząsteczki adaptera wiążącego wapń 1 (IBA1), białka wiążącego wapń wyrażonego przez mikroglej) i przetwarzania tkanek do mikroskopii elektronowej (EM). Methoxy-X04 to barwnik fluorescencyjny, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Wstrzyknięcie zwierzętom metoksy-X04 przed uśmierceniem i utrwaleniem mózgu pozwala na wstępne badanie przesiewowe i selekcję skrawków mózgu zawierających płytkę do dalszego przetwarzania przy użyciu czasochłonnych manipulacji. Jest to szczególnie pomocne podczas badania wczesnej patologii choroby Alzheimera w określonych obszarach lub warstwach mózgu, które mogą zawierać bardzo mało blaszek, obecnych tylko w niewielkiej części odcinków. Pośmiertne przetwarzanie skrawków tkanek za pomocą czerwieni Kongo, tioflawiny S i tioflawiny T (lub nawet metoksy-X04) może oznaczać arkusze plisowane β, ale wymaga intensywnego oczyszczania etanolem w celu usunięcia nadmiaru barwnika, a procedury te są niezgodne z konserwacją ultrastrukturalną. Nieefektywne byłoby również znakowanie Aβ (i innych markerów komórkowych, takich jak IBA1) na wszystkich odcinkach mózgu z regionów będących przedmiotem zainteresowania, tylko po to, aby uzyskać niewielką frakcję zawierającą blaszki Aβ we właściwym miejscu. Co ważne, blaszki Aβ są nadal widoczne po przetworzeniu tkanki pod kątem EM, co pozwala na precyzyjną identyfikację obszarów (zwykle z dokładnością do kilku milimetrów kwadratowych) do zbadania za pomocą mikroskopu elektronowego.

Introduction

Tworzenie się blaszek amyloidowych Aβ jest główną cechą neuropatologiczną choroby Alzheimera (AD). Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na ważną rolę układu odpornościowego w postępie choroby^1,2. W szczególności nowe dane z badań przedklinicznych i klinicznych ustaliły, że dysfunkcja immunologiczna jest głównym czynnikiem napędzającym i przyczyniającym się do patologii choroby Alzheimera. Dzięki tym odkryciom centralne i obwodowe komórki odpornościowe stały się obiecującymi celami terapeutycznymi dla AD³. Poniższy protokół łączy mikroskopię świetlną i elektronową (EM) w celu uzyskania nowych informacji na temat związku między osadzaniem się blaszki Aβ a zmianami fenotypowymi mikrogleju w chorobie Alzheimera. Protokół ten umożliwia znakowanie blaszek Aβ w mysich modelach AD przy użyciu iniekcji in vivo barwnika fluorescencyjnego methoxy-X04. Methoxy-X04 to pochodna czerwieni kongijskiej, która może łatwo przekroczyć barierę krew-mózg, aby dostać się do miąższu mózgu i wiązać β-plisowane arkusze o wysokim powinowactwie. Ponieważ barwnik jest fluorescencyjny, może być stosowany do wykrywania in vivo osadzania się płytki Aβ za pomocą mikroskopii dwufotonowej⁴. Po związaniu z Aβ metoksy-X04 nie dysocjuje ani nie redystrybuuje się z dala od blaszek miażdżycowych i zachowuje swoją fluorescencję w czasie. Na ogół podaje się go obwodowo, aby umożliwić nieinwazyjne obrazowanie dynamiki mózgu⁵. Fluorescencja utrzymuje się również po utrwaleniu aldehydu, co pozwala na korelacyjne analizy pośmiertne, w tym badanie śmierci neuronów w pobliżu blaszek Aβ⁶.

Ten protokół wykorzystuje właściwości metoksy-X04 do selekcji sekcji mózgu myszy APP_SWE/PS1A_246E (APP-PS1; koekspresja podwójnej mutacji w genie APP Lys670Asn/Met671Leu, oraz ludzki wariant preseniliny PS1-A264E)⁷, które wykazują blaszki Aβ w określonych regionach zainteresowania (hipokamp CA1, warstwy promieniste i lacunosum-moleculare) przed wstępnym wprowadzeniem barwienia immunologicznego przeciwko markerowi mikrogleju zjonizowanemu wiązaniu wapnia cząsteczka adaptera 1 (IBA1) do wizualizacji ciał i procesów komórek mikrogleju za pomocą EM. Myszom podaje się dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu metoksy-X04 na 24 godziny przed ustabilizowaniem mózgu poprzez perfuzję przezsercową. Koronalne skrawki mózgu uzyskuje się za pomocą wibratomu. Skrawki zawierające hipokamp CA1 są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem obecności blaszek Aβ w warstwach promieniowych i lacunosum-moleculare. Barwienie immunologiczne w kierunku IBA1, tetratlenek osmu po utrwaleniu i zatopienie w żywicy z tworzywa sztucznego są następnie wykonywane na wybranych odcinkach mózgu. Po zakończeniu tego protokołu skrawki mogą zostać zarchiwizowane bez dalszej degradacji ultrastrukturalnej, gotowe do ultracienkiego przekroju i badania ultrastrukturalnego. Co ważne, blaszki są nadal fluorescencyjne po barwieniu immunologicznym różnymi przeciwciałami, na przykład IBA1, jak w niniejszym protokole. Stają się ciemniejsze niż otaczający je neuropil po utrwaleniu tetratlenku osmu, niezależnie od barwienia metoksy-X04, co pomaga dokładnie zidentyfikować obszary zainteresowania, zwykle do kilku milimetrów kwadratowych, które mają być zbadane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

To podejście korelacyjne oferuje skuteczny sposób identyfikacji konkretnych sekcji mózgu do zbadania na poziomie ultrastrukturalnym. Jest to szczególnie pomocne podczas badania wczesnej patologii choroby Alzheimera, w określonych regionach lub warstwach mózgu, które mogą zawierać tylko kilka blaszek Aβ, obecnych tylko w niewielkiej części odcinków tkanki. Szczególnie w tych czasach nieefektywne byłoby stosowanie barwienia immunologicznego dla Aβ (i podwójnego znakowania dla innych markerów komórkowych, takich jak IBA1) na kilku odcinkach mózgu tylko po to, aby uzyskać niewielką frakcję zawierającą blaszki Aβ we właściwym miejscu. Ponadto wstrzyknięcie żywym myszom metoksy-X04 przed uśmierceniem i przetwarzaniem tkanek nie zagraża zachowaniu ultrastrukturalnemu. Alternatywne metody, takie jak barwienie pośmiertne czerwienią Kongo, tioflawiną S, tioflawiną T lub metoksy-X04 na utrwalonych skrawkach tkanek, wymagają barwienia różnicowania w ^etanolu,8-11, co powoduje stres osmotyczny i zaburza ultrastrukturę. Czerwień kongijska jest również znanym czynnikiem rakotwórczym^{dla ludzi 12}.

Protocol

Uwaga: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Etyki Zwierząt, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami zarządzanymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Université Laval. Użyto samców myszy APP-PS1 w wieku od 4 do 21 miesięcy. Zwierzęta te były trzymane w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w temperaturze 22 - 25 °C ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Przygotowanie roztworu Methoxy-X04

1. Przygotować roztwór methoxy-X04 9 o stężeniu 5 mg/ml^przez rozpuszczenie metoksy-X04 w roztworze zawierającym 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), 45% glikolu propylenowego i 45% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu (0,9% NaCl w 100 mM buforze fosforanowym, pH 7,4).
   1. Za pomocą mikrowagi odważyć 5 mg związku metoksy-X04. Pod wyciągiem rozpuścić metoksy-X04 w DMSO i mieszać aż do uzyskania klarownego zielonkawego roztworu. Kolejno dodawaj glikol propylenowy i sól fizjologiczną z buforu fosforanowego, mieszając przy każdym dodaniu.
   2. Wymieszać roztwór w temperaturze 4 °C na rotatorze O/N. Otrzymać żółtawozieloną emulsję. Roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch miesięcy bez degradacji.

2. Wstrzyknięcie roztworu Methoxy-X04

1. 24 godziny przed perfuzją zważyć myszy i podać każdej myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie metoksy-X04 w dawce 10 mg/kg masy ciała za pomocą igły 27 1/2 G.

3. Perfuzja przezsercowa myszy, którym wstrzyknięto

1. Na dzień przed perfuzją należy przygotować odpowiednie objętości roztworów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 3,5% akroleiny i 4% roztworu paraformaldehydu (PFA)¹³ i przechowywać je w temperaturze 4 °C O/N.
   Uwaga: Roztwory te będą używane zarówno do perfuzji, jak i wstępnego zatapiania immunohistochemii. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z akroleiną, ponieważ jest ona i toksyczna zarówno dla badaczy, jak i środowiska. Ponadto, ponieważ akroleina działa żrąco na tworzywa sztuczne, do przygotowania roztworów akroleiny należy zawsze używać odpowiednich naczyń szklanych.
2. W dniu perfuzji przefiltrować PFA i akroleinę za pomocą gruboziarnistej bibuły filtracyjnej o retencji cząstek 25 μm.
3. Podczas perfuzji należy użyć pompy perystaltycznej, aby dostarczyć kolejno 15 ml PBS, 75 ml akroleiny i 150 ml PFA do krążenia myszy, z szybkością przepływu 25 ml/min.
   Zachowaj ostrożność. Perfuzję należy wykonywać wyłącznie w dygestorium, aby uniknąć szkodliwych oparów PFA i akroleiny.
   1. Aby ustawić pompę, włóż jeden koniec do roztworu PBS, napełnij rurkę (o pojemności około 15 ml) PBS i przymocuj igłę do pobierania krwi o wadze 25 G ze skrzydełkami na drugim końcu. Przez cały czas upewnij się, że rurka jest wolna od uwięzionych pęcherzyków powietrza.
   2. Umieść rurkę bezpośrednio w butelce z akroleiną po ustawieniu pompy perfuzyjnej z rurką wypełnioną PBS.
4. Znieczulać jedną mysz na raz dawką 90 mg/kg masy ciała pentobarbitalu sodu wstrzykiwaną dootrzewnowo za pomocą igły 27 1/2 G. Oceń reakcje na szczypanie ogona/palców u nóg. Kontynuuj tylko wtedy, gdy mysz nie reaguje na takie awersyjne, bolesne bodźce.
5. Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach (leżąc na plecach twarzą do góry), przyklejając przednie i tylne łapy do powierzchni roboczej i ostrożnie odsłaniając serce, nie powodując uszkodzenia innych narządów. Pamiętaj, aby pracować szybko po przebiciu membrany.
   1. Wykonaj nacięcie przez skórę nożyczkami chirurgicznymi wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej, zaczynając od ogona do klatki piersiowej i przejdź rostralnie do obojczyka.
   2. Wykonaj dwa dodatkowe boczne nacięcia wzdłuż podstawy brzusznej klatki piersiowej. Delikatnie przesuń i przypnij dwa płaty skóry, upewniając się, że odsłaniają całą klatkę piersiową.
   3. Przytrzymaj wyrostek mieczykowaty kleszczami, aby odsłonić jamę piersiową i ustabilizować spiczaste nożyczki. Przeciąć przeponę i klatkę piersiową, uważając, aby nie przebić płuc, i kontynuować nacięcie rostralne do obojczyków. Pamiętaj, aby pracować szybko po przebiciu membrany.
6. Delikatnie rozerwij worek osierdziowy kleszczami. Przytrzymaj serce stabilnie kleszczami, przetnij prawy przedsionek i rozpocznij infuzję PBS. Natychmiast wprowadzić igłę do pobierania krwi do lewej komory.
7. Przeprowadzić fuzję myszy z PBS (w rurce), a następnie akroleiną przez 3 minuty (co odpowiada 75 ml), a następnie przełączyć na PFA na 6 minut (co odpowiada 150 ml). Pamiętaj, aby wstrzymać przepływ pompy przed zmianą roztworu, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków do rurki.
8. Odciąć głowę myszy i wyekstrahować unieruchomiony mózg i umieścić go bezpośrednio w szklanej fiolce zawierającej 4% PFA na co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.
   1. Aby wydobyć mózg, użyj nożyczek i pęsety, aby przeciąć skórę, aby odsłonić czaszkę. Ostrożnie rozbij czaszkę między oczami i odłup jej małe kawałki, aby odsłonić leżący pod spodem mózg.
   2. Ostrożnie usuń odsłonięty mózg i przymocuj go 4% PFA przez dodatkowe 2 godziny przed przystąpieniem do sekcji wibratomowej.

4. Sekcja mózgu za pomocą wibratomu

1. Umyj unieruchomiony mózg 3 razy schłodzonym PBS. Za pomocą ostrej żyletki usuń opuszkę węchową (chyba że ten obszar jest badany) i przetnij mózg poprzecznie na 2-3 kawałki o mniej więcej równej wysokości, z których wszystkie można podzielić jednocześnie w celu przyspieszenia zabiegu.
2. Przyklej kawałki tkanki mózgowej pionowo do płytki próbki przymocowanej do tacy. Upewnij się, że gładka powierzchnia cięcia mocno przylega do płytki próbki i nie zostanie przemieszczona podczas procedury cięcia. Dodaj tyle roztworu PBS do tacy, aż cała powierzchnia mózgu zostanie całkowicie zanurzona. Ważne jest, aby fragmenty mózgu i kolejne sekcje były całkowicie zanurzone w PBS przez cały ten etap.
3. Umieść tacę w wibratomie, dostosuj prędkość cięcia do 0,5 mm/s, częstotliwość cięcia na 90 Hz, a grubość podawania do 50 μm, aby uzyskać odcinki o grubości 50 μm. Następnie przenieś skrawki do 20 ml szklanych fiolek zawierających roztwór krioprotektantu (40% PBS, 30% glikolu etylenowego i 30% glicerolu) za pomocą cienkiego pędzla. Przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Alternatywnie, zachowaj sekcje w PBS do natychmiastowego badania przesiewowego, zgodnie z opisem w poniższych krokach.

5. Sekcja przesiewowa na obecność blaszek barwionych metoksy-X04

1. Za pomocą stereotaktycznego atlasu^{mózgu myszy 14} wybierz sekcje mózgu zawierające obszar zainteresowania, na przykład hipokamp CA1, jak użyto w niniejszym przykładzie. Umieść każdą sekcję w studzience w 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej wystarczającą ilość roztworu krioprotektantu, aby zapobiec wysychaniu skrawków.
2. Sprawdzaj kolejno każdą sekcję, aby uniknąć wysuszenia sekcji, stosując następującą procedurę:
   1. Dodaj kroplę PBS do szkiełka mikroskopowego za pomocą jednorazowej pipety i umieść wycinek na kropli.
   2. Zbadaj przekrój pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zidentyfikować obszary zawierające tabliczki Aβ znakowane metoksy-X04.
      Uwaga: methoxy-X04 można łatwo uwidocznić za pomocą fluorescencyjnego filtra ultrafioletowego (UV) (wzbudzenie 340 - 380 nm).
3. Rób obrazy obszarów zainteresowania (ROI) w jasnym polu, a także w trybie fluorescencji bez przesuwania stolika mikroskopu, ponieważ każdy obraz musi pokazywać ten sam obszar w obu polach, aby skorelować obecność blaszek bezpośrednio z obszarem strukturalnym przekroju tkanki.
4. Zapisz i nazwij zrobione zdjęcia zgodnie z numerem zwierzęcia. Zapisz również numer studzienki na tabliczce i pole wykonanych zdjęć. Na przykład np.: 9978A1B; Numer zwierzęcia: 9978; Numer studni: A1; Pole: Jasne. Po zakończeniu obrazowania umieść sekcję z powrotem w wyznaczonym dołku.
   Uwaga: Na końcu, dla każdej badanej sekcji, uzyskuje się dwa obrazy, jedno w jasnym polu, a drugie w polu UV.
5. Otwórz dwa obrazy o tym samym ROI (jeden w jasnym polu, a drugi w polu UV) na obrazie J i za pomocą wtyczki MosaicJ wyrównaj krawędzie dwóch obrazów i zapisz wyrównany i połączony obraz zgodnie z numerem studni, z którego pochodzi.
6. Zapisz zdjęcie w osobnym folderze z numerem konkretnego zwierzęcia. Połącz obrazy, aby zidentyfikować i zlokalizować blaszki w sekcji tkanki i uzyskać pełny widok całej sekcji w dwóch różnych polach (jasnym i UV).
7. Po zakończeniu procesu przesiewowego badane skrawki należy przechowywać w temperaturze -20 °C na 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej krioprotektant do czasu przeprowadzenia barwienia immunologicznego lub dalszego przetwarzania.

6. Wstępne osadzanie immunobarwienia dla IBA1

Uwaga: Przeprowadź barwienie immunologiczne dla IBA1 na wybranych swobodnie pływających sekcjach, umieszczając płytkę na wolno poruszającym się wahaczu przy RT.

1. Dokładnie umyj skrawki 3 razy około 1 ml PBS, każde mycie trwa 10 minut.
2. Ugasić endogenne peroksydazy 0,3% nadtlenkiem wodoru w roztworze PBS przez 10 min. Ten krok zapobiega niespecyficznej aktywności peroksydazy, co jest ważne, aby uniknąć barwienia tła.
3. Umyj chusteczkę w PBS 3 razy po 10 minut każde.
4. Inkubować skrawki w 0,1% borowodorku sodu w roztworze PBS przez 30 minut. Ten krok jest ważny w celu zredukowania wszelkich pozostałych aldehydów z etapu utrwalania i jest szczególnie ważny, jeśli akroleina jest używana do utrwalania tkanek.
5. Umyj chusteczkę w PBS 3 razy przez 10 minut za każdym razem i upewnij się, że usunąłeś wszystkie bąbelki.
6. Zablokuj sekcje na 1 godzinę. Różne przeciwciała mogą wymagać różnych czasów blokowania i roztworów. Dla IBA1 należy przygotować bufor blokujący zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej, 3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,01% Triton X-100 w 50 mM soli fizjologicznej buforowanej Trisem (TBS; pH 7,4).
   Uwaga: Etap blokowania ma na celu zapobieżenie nieswoistemu wiązaniu przeciwciała pierwszorzędowego. Niskie stężenie Triton X-100 pozwala na lekką przepuszczalność membran w celu lepszego barwienia i jest wystarczająco niskie, aby zachować większość cech ultrastrukturalnych tkanki pod EM.
7. Usunąć bufor blokujący z tkanki i inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (króliczy anty-IBA1, rozcieńczony [1:1,000] w buforze blokującym) w temperaturze 4 °C O/N.
8. Prać w TBS 3 razy przez 10 minut za każdym razem.
9. Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-królikowe sprzężone z biotyną) [1:200] w 0,05 M TBS przez 90 min.
10. Prać w TBS 5 razy przez 5 minut za każdym razem.
11. Inkubować w roztworze kompleksu Awidyna-Biotyna (Avidin [1:100], Biotyna [1:100]) w roztworze TBS przez 1 godzinę.
12. Prać w TBS 5 razy przez 5 minut za każdym razem.
13. Ujawnić barwienie IBA1 0,05% diaminobenzydyną (DAB) i 0,015% nadtlenkiem wodoru w TBS przez 8 min.
    Uwaga: Czas opracowania DAB może się różnić w zależności od protokołu i powinien być określony poprzez szybkie zbadanie poplamionych skrawków pod mikroskopem świetlnym.
    Uwaga: W przypadku IBA1 powinno być w stanie wyraźnie zobrazować ciała komórkowe i procesy mikrogleju barwionego IBA1 przy 20-krotnym wzroście (patrz rysunek 2 dla reprezentatywnego przykładu). Zachowaj ostrożność podczas korzystania z DAB, ponieważ jest to znany czynnik rakotwórczy.
14. Unikaj nadmiernego rozwoju, uważnie monitorując sekcje (jak opisano powyżej) na tym etapie. Zatrzymać reakcję, myjąc sekcje w schłodzonym PB 5 razy przez 5 minut za każdym razem.

7. Przetwarzanie dla mikroskopii elektronowej

1. Przygotować 1% roztwór tetratlenku osmu w PBS w szklanej fiolce. Tetroksynek osmu jest światłoczuły; Przykryj szklaną fiolkę folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem.
   Zachowaj ostrożność przy używaniu tetratlenku osmu, ponieważ jest to bardzo niebezpieczna substancja chemiczna. Wykonaj te i następne kroki wewnątrz dygestorium.
2. Usuń PBS z sekcji i rozprowadź je płasko za pomocą cienkiego pędzla. Wykonuj ten krok pojedynczo, aby sekcje nie wysychały. Pamiętaj, aby spłaszczyć sekcje bezpośrednio przed dodaniem tetratlenku osmu, ponieważ wszelkie fałdy w sekcjach staną się trwałe, a próba spłaszczenia tkanki po utrwaleniu osmu spowoduje tylko złamanie sekcji.
3. Zanurz sekcje w tetratlenku osmu na 30 minut w temperaturze pokojowej, dodając po jednej kropli tetratlenku osmu za pomocą pipety transferowej, aby zapobiec składaniu się sekcji. Przykryj studnię folią aluminiową, aby chronić sekcje przed światłem.
   Uwaga: Ten krok naprawia lipidy w sekcjach. Tkanka będzie wyglądać na bardzo ciemną po utrwaleniu osmu.
4. Gdy skrawki są w tetratlenku osmu, przygotuj żywicę z tworzywa sztucznego w jednorazowej zlewce, mieszając 20 g składnika A, 20 g składnika B, 0,6 g składnika C i 0,4 g składnika D. Połącz składniki razem w powyższej kolejności i dobrze je wymieszaj za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aż do uzyskania jednolitego koloru.
5. Przenieś przygotowaną mieszaninę do aluminiowych naczyń wagowych. Otrzymają one skrawki tkanek po ich odwodnieniu.
6. Odwodnić sekcje w rosnących stężeniach etanolu przez 2 minuty w następującej kolejności: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
7. Aby usunąć resztki etanolu, zanurz sekcje w tlenku propylenu 3 razy na 2 minuty za każdym razem. Wyjąć odwodnione skrawki z 24-dołkowej płytki hodowlanej do szklanych fiolek o pojemności 20 ml. Zawsze używaj szklanych fiolek podczas pracy z tlenkiem propylenu, ponieważ rozpuszcza on plastik i zachowaj ostrożność, ponieważ jest to niebezpieczne.
8. Za pomocą wygiętej szklanej końcówki pipety lub cienkiego pędzla przenieś skrawki z roztworu tlenku propylenu do żywicy i pozostaw O/N do infiltracji w temperaturze pokojowej. Uważaj, aby nie rozcieńczyć żywicy tlenkiem propylenu.
9. Osadzać przekrój z żywicą na arkuszach folii z poli-chloro-tri-fluoro-etylenu (PCTFE):
   1. Umieścić aluminiowe naczynia wagowe zawierające próbki w piecu o temperaturze 50 - 60 °C na 10 - 15 minut przed zatopieniem sekcji na arkuszach folii PCTFE.
   2. Podczas osadzania sekcji pracuj z jedną aluminiową szalką wagową na raz. Za pomocą cienkiego pędzla namaluj cienką warstwę żywicy na jednym arkuszu folii PCTFE.
   3. Przenoś po jednym fragmencie tkanki z aluminiowego naczynia wagowego na arkusz folii PCTFE. Usuń nadmiar żywicy z okolic tkanki, uważając, aby jej nie naruszyć.
   4. Po przeniesieniu wszystkich sekcji z jednego naczynia wagowego na arkusz folii PCTFE, umieść drugi arkusz PCTFE na pierwszym, tworząc warstwę tkanki i żywicy pomiędzy 2 arkuszami.
10. Polimeryzować żywicę w inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 55 - 60 °C.
11. Materiał jest teraz gotowy do ultracienkiego przekroju i badania ultrastrukturalnego, specjalistycznych technik, które są często wykonywane przez główne zakłady EM. Próbki należy bezpiecznie przechowywać między arkuszami folii PCTFE w temperaturze pokojowej bez degradacji ultrastrukturalnej.
    Uwaga: Kolejne etapy badania ultracienkim przekrojem i transmisyjną mikroskopią elektronową są wyjaśnione w osobnym protokole¹³.

Results

Ta sekcja ilustruje wyniki, które można uzyskać na różnych krytycznych etapach protokołu. W szczególności wyniki pokazują przykłady wycinków mózgu zawierających blaszki barwione metoksy-X04 w określonym regionie i warstwach będących przedmiotem zainteresowania: hipokampie CA1, warstwach promieniowych i lacunosum-molekularnych. Blaszki miażdżycowe i regionalna/blaszkowata organizacja hipokampa są sukcesywnie wizualizowane za pomocą kombinacji filtrów UV i jasnego pola (ryc. 1

Discussion

Protokół ten wyjaśnia korelacyjne podejście do celowania w gęste blaszki rdzeniowe Aβ za pomocą EM. Wstrzyknięcie Methoxy-X04 in vivo umożliwia szybką selekcję wycinków mózgu, które zawierają blaszki Aβ w określonych regionach i warstwach zainteresowania, na przykład hipokampie CA1, warstwach promieniowych i lacunosum-moleculare. W niniejszym przykładzie wstępne badania przesiewowe metoksy-X04 połączono ze wstępnym zatopieniem barwienia immunologicznego dla IBA1 w celu zbadania, w jaki sposób różne fenotypy mikr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methoxy-X04	Tocris Bioscience	4920	10 mg substrat w tabletce
Glikol propylenowy	Sigma Aldrich	W294004
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-1	Uwaga: toksyczny
Chlorek sodu NaCl	Sigma	S9625
Jednowodny fosforan sodu jednowodny	Sigma	S9638
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma	S0876
Tris Chlorowodorek	Fisher BioReagents	BP153500
Akroleina	Sigma	110221	Uwaga: Toksyczna
paraformaldehyd Granulowana	mikroskopia elektronowa Nauki	19210	Uwaga: Toksyczna
bibuła filtracyjna	Fisher	09-790-14F
Pompa perystaltyczna z rurką	ColeParmer	cp.78023-00
Excel Zestaw do pobierania krwi Winged Igły 25  G	Becton Dickinson	367341
Ekstradrobne kleszcze	FST	11152-10	Kształt końcówki: zakrzywione
Nożyczki	FST	14090-09	Kształt końcówki: prosty
Hartman Hemostats	FST	13003-10	Kształt końcówki: zakrzywione
Nożyczki chirurgiczne	FST	14004-16	Kształt końcówki: proste
Nożyczki do mikro preparacji	Sklep chirurgiczny ROBOZ	5818
Szklane fiolki scyntylacyjne	Fisher Scientific	74515-20
Mikrotom z ostrzem wibracyjnym Leica VT1000 S	Leica Biosystems
Ostrza wibratomu	Mikroskopia elektronowa Sciences	71990
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-550-15
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	353047
Glikol etylenowy	Fisher BioReagents	BP230-4
Glicerol	Fisher BioReagents	BP229-4
Nadtlenek wodoru, 30%	J.T.BAKER	kat.: 2186-01
Borowodorek sodu	Sigma	480886
Tris HCl	Fisher	BP153-500ML
Surowica bydlęca (FBS)	Sigma Aldrich	F1051
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V	Thomas Scientific	C001H24
Triton X-100	Sigma	T8787
Anty IBA1, Królik	WAKO	019-19741
Kozia anty-królicza IgG	Jackson Immunoresearch	111066046
VECTASTAIN Elite ABC Kit (standardowy)	Vector Labs	PK-6100
Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)	Sigma	D5905-50TAB	Uwaga: toksyczny
tetratlenek osmu, 4% roztwór	Mikroskopia elektronowa Nauki	19150	Uwaga: toksyczny
Durcupan™ Jednoskładnikowa żywica ACM A	Sigma	44611	Uwaga: Toksyczny
Durcupan™ Jednoskładnikowy utwardzacz ACM B	Sigma	44612	Uwaga: Toksyczny
Durcupan i handel; Jednoskładnikowy plastyfikator ACM C	Sigma	44613	Uwaga: Toksyczny
Durcupan i handel; Jednoskładnikowy akcelerator ACM D	Sigma	44614	Uwaga: Toksyczny
etanol	LesAlcoolsdeComerce	151-01-15N
Tlenek propylenu	Sigma	110205	Uwaga:
Aluminiowe naczynia wagowe	Mikroskopia elektronowa Nauki	70048-01
ACLAR® – Folie fluoropolimerowe	Mikroskopia elektronowa Nauki	50425
Piec/inkubator	VWR