Artykuł metodologiczny

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

DOI:

10.3791/54061

⸱

6 maja 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP) tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Model in vitro BCSFB wykorzystuje ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). W artykule opisano hodowlę i infekcję podstawno-boczną komórek HIBCPP przy użyciu systemu wkładek filtrujących do hodowli komórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP), znajdujące się w układzie komorowym mózgu, tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). BCSFB działa w oddzielaniu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od krwi i ograniczaniu wymiany molekularnej w minimalnym stopniu. Model in vitro BCSFB opiera się na komórkach pochodzących z ludzkiego brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). Komórki HIBCPP wykazują typowe funkcje barierowe, w tym tworzenie ścisłych połączeń (TJ), rozwój transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER), a także niewielką przepuszczalność dla makrocząsteczek. Istnieje kilka patogenów, które mogą dostać się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przez BCSFB, a następnie spowodować ciężką chorobę, taką jak zapalenie opon mózgowych. Jednym z tych patogenów jest Neisseria meningitidis (N. meningitidis), bakteria specyficzna dla człowieka. Zastosowanie komórek HIBCPP w systemie wkładek filtracyjnych z odwróconą hodowlą komórkową umożliwia badanie interakcji patogenów z komórkami BCSFB od strony komórki podstawno-bocznej, co jest istotne in vivo. W tym artykule opisujemy wysiew i hodowlę komórek HIBCPP na wkładkach do hodowli komórkowych. Ponadto wykazano zakażenie komórek N. meningitidis wraz z analizą zaatakowanych i przylegających bakterii za pomocą podwójnej immunofluorescencji. Ponieważ komórki CP są również zaangażowane w inne choroby, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane, a także podczas przerzutów komórek nowotworowych do mózgu, system modelowy może być również stosowany w innych dziedzinach badań. Daje to potencjał do rozszyfrowania mechanizmów molekularnych i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB) jest jednym z trzech miejsc barierowych między krwią a mózgiem1. Jego morfologicznym korelatem są komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP)2,3, spirali śródbłonkowo-nabłonkowej, która jest silnie unaczyniona i zlokalizowana w komorach mózgu. CP służy do produkcji płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), a także do oddzielenia tego ostatniego od krwi. Aby osiągnąć funkcję barierową, komórki nabłonkowe CP wykazują niską aktywność pinocytotyczną, wyrażają specyficzne transportery i są gęsto połączone ciągłą siecią połączeń ścisłych (TJ)2,3.

Ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP), pochodzące ze złośliwego brodawczaka splotu naczyniówkowegoJaponki 4, zostały użyte do skonstruowania funkcjonalnego modelu BCSFB in vitro. Komórki HIBCPP wykazują kilka cech funkcjonalnego BCSFB, takich jak tworzenie nici TJ, rozwój wysokiego potencjału błony przeznabłonkowej, który można określić jako transnabłonkowy opór elektryczny (TEER) oraz niewielka przepuszczalność makrocząsteczek. Ponadto komórki HIBCPP wykazują ekspresję charakterystycznych transporterów, które mogą służyć do regulacji mikrośrodowiska jonowego i wykazują polaryzację wierzchołkową/podstawno-boczną5,6,7.

Wykazano, że BCSFB funkcjonuje jako miejsce wejścia patogenów (bakterii, wirusów i grzybów) do ośrodkowego układu nerwowego (OUN)8. Inwazja patogenów, w tym Neisseria meningitidis (N. meningitidis), bakterii Gram-ujemnej, może powodować poważne choroby, takie jak zapalenie opon mózgowych. Dowody na to, że pokonuje ochronną barierę nabłonkową CP, są poparte obserwacjami histopatologicznymi u pacjentów z chorobą meningokokową wykazujących zwiększoną ilość meningokoków w naczyniach i komórkach nabłonka CP9,10. Aby dostać się do komórek gospodarza, bakterie często przejmują mechanizmy endocytotyczne, w których pośredniczą lub wyzwalają określone receptory powierzchniowe znajdujące się na komórkach gospodarza. Ponieważ interakcje patogenów z tymi receptorami mogą być specyficzne dla danego gatunku11, z modeli zwierzęcych można korzystać tylko w ograniczonym zakresie. Linia komórkowa HIBCPP daje możliwość zbadania procesu inwazji, a także mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ludzkiego systemu modelowego. Zastosowanie wkładek do hodowli komórkowych umożliwia nam analizę interakcji patogenów z komórkami gospodarza z dwóch różnych stron komórek. Wiele bakterii, w tym N. meningitidis, jest silnie narażonych na wpływ grawitacji podczas testów infekcji. W celu optymalnej interakcji patogenów z komórkami HIBCPP podczas testów, bakterie są początkowo dodawane do górnej komory systemu wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych. Aby umożliwić infekcję odpowiednio od strony komórki wierzchołkowej lub podstawno-bocznej, ustalono dwie wersje systemu in vitro: W standardowym systemie komórki HIBCPP są wysiewane do górnej komory wkładu filtrującego, naśladując sytuację, w której mikroorganizmy znajdują się po stronie płynu mózgowo-rdzeniowego i wchodzą w kontakt ze stroną wierzchołkową komórek (Figura 1A, W przeciwieństwie do tego, użycie komórek HIBCPP w systemie wkładek filtrujących do odwróconych kultur komórkowych odzwierciedla warunki, w których bakterie dostały się do krwiobiegu. Mikroorganizmy rozprzestrzeniają się we krwi i napotykają komórki nabłonka CP od strony podstawno-bocznej (ryc. 1B, D). Warto zauważyć, że w tym układzie modelowym wykazano, że bakterie atakują komórki HIBCPP w sposób polarny, szczególnie od strony komórki podstawno-bocznej5,7.

Po zakażeniu CP, zaatakowane patogeny mogą być rozpoznane przez wrodzony układ odpornościowy poprzez ligację do receptorów rozpoznawania wzorców (PRR). Dobrze opisani członkowie receptorów Toll-like (TLR) należą do rodziny receptorów Toll-like (TLR). TLR mogą wiązać się z charakterystycznymi strukturami zakaźnych mikroorganizmów, które są nazywane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP). Ligacja receptorów prowadzi do aktywacji kaskad sygnalizacyjnych komórek gospodarza, które wyzwalają ekspresję cytokin i chemokin12, które z kolei stymulują transmigrację komórek odpornościowych przez BCSFB13,14. Wykazano, że komórki HIBCPP wyrażają kilka TLR na poziomie mRNA i że zakażenie N. meningitidis powoduje wydzielanie kilku cytokin i chemokin, w tym CXCL1-3, IL6, IL8 i TNFα15,16.

Tutaj opisujemy hodowlę i infekcję ludzkiej linii komórkowej HIBCPP w systemie wstawiania odwróconej hodowli komórkowej, który naśladuje BCSFB. Ten modelowy system umożliwia badanie interakcji patogenów z istotną in vivo stroną komórkową podstawno-boczną, a także późniejszą odpowiedź komórkową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie wkładów filtrujących do hodowli komórkowych do wysiewu komórek HIBCPP w systemie modelu odwróconego

  1. Wstępnie rozgrzany DMEM/F12 (szynka) uzupełniony 5 μg/ml insuliny, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  2. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść do góry nogami wkładki filtrujące do hodowli komórkowych o powierzchni 0.33 cm² o wielkości porów 3 μm w dół na 12-dołkowej płytce (ryc. 1E).
  3. Wlej pożywkę do dolnej komory wkładu filtrującego do hodowli komórkowych (około 3 ml) i 100 μl na górze wkładu filtrującego. Zalej płytę oraz dolną komorę medium. Zassać nadmiar medium w taki sposób, aby dolna komora wkładu filtracyjnego pozostała wypełniona (Rysunek 1E).
    Uwaga: Na tym etapie zaleca się użycie pipety serologicznej.
  4. Przykryć 12-dołkową płytkę pokrywką i przenieść przygotowane wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do dodania komórek.

2. Hodowla i pasaż komórek HIBCPP

  1. Przygotować DMEM/F12 (szynka) uzupełnioną 5 μg/ml, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% FCS.
  2. Wstępnie ogrzane podłoże i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Odessać pożywkę z kolby. Dodać 10 ml PBS do kolby i zamieszać. Powtórz ten krok raz.
  3. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby i zamieszać. Umieścić w inkubatorze, 37 °C, 5% CO2 .
  4. Po około 20 minutach wyjąć kolbę z inkubatora. Upewnij się, że komórki są odłączone od dna kolby i mają okrągły kształt podczas badania mikroskopem.
    Uwaga: Komórki nie odłączają się całkowicie od siebie i często znajdują się w aglomeratach. Zaleca się stosowanie ogniw do pasażu 38.
  5. Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 17 ml pożywki. Zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 50 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    Uwaga: Stężenie zawieszonych komórek HIBCPP powinno wynosić 1 x 106 komórek/ml. W celu utrzymania komórek HIBCPP sugeruje się przeniesienie ilości 1-6 x 106 komórek w 10 ml pożywki do kolby T75. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.

3. Zakładanie wkładów filtracyjnych do hodowli odwróconych komórek za pomocą komórek HIBCPP

  1. Na wierzch każdego odwróconego wkładu filtracyjnego (tj. dolną stronę filtra) dodać 80 μl zawiesiny komórek (tj. 8 x 104 komórek) (Rysunek 1E).
    Uwaga: Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w zawiesinie, odwracając rurkę przed siewem.
  2. Przykryć wkłady filtracyjne do hodowli komórek nasiennych pokrywką płytki 12-dołkowej i przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Pierwszego dnia wlać 1 ml pożywki do dołków 24-dołkowej płytki. Za pomocą kleszczy wyjmij wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych z płytki 12-dołkowej, wyrzuć pożywkę do środka, obróć wkłady filtracyjne i umieść je w standardowej orientacji na przygotowanej płytce 24-dołkowej (rysunek 1E).
  4. Umieszczaj komórki w świeżej pożywce co drugi dzień. Przygotuj 24-dołkowe ze świeżą pożywką i przenieś do niej wkłady filtracyjne. Napełnij wkładki 0,5 ml świeżej pożywki. Sprawdzaj TEER codziennie, jak opisano w punkcie 4.
  5. Gdy wartości TEER komórek nasiennych HIBCPP na wkładkach do hodowli komórkowych przekraczają 70 Ω x cm² (około 4 dni po wysiewie), należy kontynuować hodowlę komórkową w pożywce zawierającej 1% FCS i 5 μg/ml insuliny. Przygotować płytki 24-dołkowe z 1 ml pożywki na każdą studzienkę. Przenieść wkłady filtracyjne do przygotowanych studzienek i wymienić pożywkę w górnej komorze.
    Uwaga: To wycofanie surowicy po konfluencji prowadzi do powstania wyższego potencjału błonowego.
  6. Odessać pożywkę z komory filtra, przenieść do przygotowanej studzienki i napełnić 500 μl pożywki. Powtórz ten krok raz. Umieścić komórki na noc w inkubatorze, 37 °C, 5% CO2 .

4. Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER)

  1. Zanurz końcówki elektrod woltoomomierza tkanki nabłonkowej na 15 minut w 80% etanolu. Przenieś woltoomomierz pod maskę i pozwól elektrodzie wyschnąć na chwilę. Umieść elektrodę w odpowiedniej pożywce hodowlanej używanej do komórek na kolejne 15 minut, aby zrównoważyć.
  2. Pomiary należy wykonywać, ustawiając dłuższe ramię elektrody tak, aby za każdym razem dotykało dna dolnej komory, krótsze ramię należy umieścić w komorze wkładu filtra.
    Uwaga: Wartości rezystancji wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych bez komórek w pożywce należy stosować jako wartości ślepe ((wartość zmierzona (Ω) – wartość ślepej próby (Ω)) x powierzchnia filtra (tj. 0,33 cm²)).
  3. Po zmierzeniu umieść elektrodę z powrotem w 80% etanolu na 15 minut. Przechowywać w suchej probówce.

5. Oznaczanie przepuszczalności parakomórkowej

  1. Rozpuścić 1 g FITC-Inuliny w 200 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 5 μg/ml insuliny 1% FCS. Nałożyć 50 μg/ml roztworu do górnej komory filtra przed zakażeniem komórek.
  2. Po infekcji należy pobrać próbki pożywki z dolnej studzienki, aby określić, ile inuliny przeszło z komory filtra przez warstwę komórkową.
  3. Przygotować roztwór wzorcowy FITC-Inulina i wykonać rozcieńczenia 1:2 10 razy (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% i 0%). Określić fluorescencję, mierząc wszystkie próbki w czytniku mikropłytek.

6. Przygotowanie bakterii do infekcji komórek HIBCPP na wkładach filtracyjnych do hodowli komórkowych

  1. Na dzień przed eksperymentem zeskrob zamrożone szczepy N. meningitidis z wywaru glicerolowego i rozprowadź na agarze czekoladowym z Vitoxem. Uprawiać przez noc w inkubatorze, w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 .
  2. Wyekstrahuj 20-30 kolonii z nocnej hodowli i przenieś do probówki zawierającej 8 ml pożywki z peptonem proteozy uzupełnionej 0,042% NaHCO3, 0,01 M MgCl2 i 1% Polyvitex.
  3. Potrząsać bakteriami przez 1,25 godziny przy 220 obr./min, 37 °C. Bakterie osadzać przez odwirowanie z prędkością 2,684 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny za pomocą 8 ml pożywki niezawierającej surowicy. Vortex, aby zapewnić równomierne zawieszenie.
  4. Aby określić gęstość hodowli, należy zmierzyć rozcieńczenie 1:10 przy gęstości optycznej (OD) 600 nm. Dostosuj zawiesinę bakteryjną do OD600 0.1.
    Uwaga: Ta zawiesina zawiera ok. 1 x 108 jtk/ml.
  5. Aby potwierdzić stężenie komórek bakteryjnych, rozcieńczać zawiesinę stopniowo (1:10) do rozcieńczenia 10-5 i ułożyć na płytkach z agarem czekoladowym.
    Uwaga: Podobne seryjne rozcieńczenia należy wykonać, aby obliczyć krzywe wzrostu bakterii.

7. Zakażenie komórek HIBCPP na wkładach filtrujących do hodowli komórkowych i oznaczanie inwazji bakteryjnej przez podwójną immunofluorescencję

  1. Po kontynuowaniu hodowli komórkowej w pożywce zawierającej 1% FCS i 5 μg/ml insuliny, należy codziennie mierzyć komórki za pomocą woltoomomierza tkanki nabłonkowej. Jeśli komórki osiągnęły TEER około 500 Ω x cm², przeprowadź infekcję.
  2. Zainfekuj komórki przygotowaną zawiesiną bakteryjną przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10. Przechowywać zakażone komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 przez wskazany okres czasu.
    Uwaga: MOI można obliczyć, biorąc pod uwagę liczbę komórek na wkład filtra do hodowli komórkowej w momencie zbiegu (1,21 x 106 komórek/cm2).
  3. Zatrzymać infekcję, przemywając ją trzykrotnie 500 μl pożywki bez surowicy (SFM) zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) nałożonej do komory filtra, 1 ml do dolnej komory.
  4. Blok z 500 μl SFM zawierającym 1% buforu BSA w komorze filtra i 1 ml w dolnej komorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec przyleganiu przeciwciał do niespecyficznych miejsc wiązania.
  5. Inkubować ze 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty N. meningtidis α-OMP (1:200) w komorze filtra i 500 μl w dolnej komorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: W razie potrzeby należy miareczkować stężenie przeciwciał.
  6. Przepłukać komórki, zasysając pożywkę z komory filtra, przenieść wkład filtra do przygotowanego dołka z 1 ml SFM zawierającego 1% BSA i napełnić opróżnioną komorę filtra 500 μl SFM zawierającej 1% BSA. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  7. Utrwal komórki z 500 μl 4% formaldehydu w komorze filtra, 1 ml w dolnej komorze na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyć komórki, odsysając pożywkę z komory filtra, przenieść wkład filtracyjny do przygotowanego dołka z 1 ml PBS i napełnić opróżnioną komorę filtra 500 μl PBS. Powtórz ten krok raz.
    Uwaga: Próbki można przechowywać przez noc w PBS w temperaturze 4 °C.
  9. Z wkładek wyciąć filtry do hodowli komórkowych i przemyć 250 μl PBS zawierającego 1% BSA. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 250 μl znakowanego fluorescencyjnie (długość fali wzbudzenia 594 nm) wtórnym przeciwciałem przeciwko królikowi z kurczaka (1:500) w celu barwienia bakterii zewnątrzkomórkowych.
    Uwaga: W razie potrzeby należy miareczkować stężenie przeciwciał.
  10. Przepuszczalność komórek za pomocą 250 μl PBS zawierającego 1% BSA i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć komórki trzykrotnie 250 μl PBS zawierającego 1% BSA.
  11. Inkubować z 250 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty N. meningitidis α-OMP (1:200) przez 30 minut w celu wybarwienia bakterii zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Umyć komórki trzykrotnie 250 μl PBS zawierającego 1% BSA.
  12. Zastosuj 250 μl znakowanego fluorescencyjnie (długość fali wzbudzenia 488 nm) przeciwciała wtórnego (1:500), znakowanego fluorescencyjnie (długość fali wzbudzenia 660 nm) falloidyny (1:250) i dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (1:50 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu barwienia bakterii zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych, cytoszkieletu aktynowego i jąder.
    Uwaga: W razie potrzeby należy miareczkować stężenie przeciwciał.
  13. Umyć komórki trzykrotnie 250 μl PBS zawierającego 1% BSA. Umieścić komórki w pożywce montażowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu badania pod mikroskopem.
  14. Określ liczbę zaatakowanych bakterii na wstępnie zdefiniowane pole. W tym celu należy policzyć 20 pól na membranę filtracyjną. Oblicz procent zaatakowanych bakterii.
    Uwaga: Pomnóż średnią liczbę bakterii w 20 mikroskopijnych polach przez współczynnik powierzchni. Wynik wyraża całkowitą ilość bakterii obecnych we wkładzie filtrującym do hodowli komórkowych o powierzchni 0,33 cm². Podziel tę wartość przez ilość bakterii wyhodowanych w pożywce w czasie trwania infekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy hodowlę i infekcję komórek HIBCPP w systemie wstawiania odwróconej hodowli komórkowej. Model ten pozwala nam badać mechanizmy inwazji i leżące u ich podstaw molekularne szlaki sygnałowe od strony komórki podstawno-bocznej, odtwarzając fizjologiczną sytuację bakterii rozprzestrzeniających się i wnikających do komórek nabłonka przez krwiobieg (ryc. 1).

Komórki HIBCPP wykazują pewne funkcje barierow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe CP tworzą BCSFB, który oddziela płyn mózgowo-rdzeniowy od krwi2,3. Niedawno ustaliliśmy, że linia komórkowa HIBCPP jest funkcjonalnym ludzkim modelem BCSFB. Komórki wykazują ważne funkcje barierowe BCSFB in vitro, w tym rozwój wysokiego potencjału błonowego, niską przepuszczalność dla makrocząsteczek, a także obecność ciągłych nici TJs5. Białka TJ przyczyniają się do wierzchołkowej/podstawno-bocznej polaryzacji komórek. Polaryzacja ma duże znaczenie dla ukierunkowanej lok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować prof. Hartwigowi Wolburgowi za wykonanie mikroskopii elektronowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-056
4´,6 diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-dołkowe płytkiStarlabCC7682-7512
24-dołkowe StarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPPrzeciwciało to było darem od dr H. Clausa i dr U. Vogela (University of Wü rzburg, Niemcy)
Alexa Fluor 488 (kurczak anty królik)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (kurczak anty królik)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Calbiochem12659
Czekoladowe talerze agaroweBiomerieux43109
Cytochalazyna DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES bez fenoluGibco11039-047
DimetylosulfotlenekSigmaD2650
Surowica cielęca płodu (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinaSigmaF3272
InsulinaSigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penicylina/StreptomycynaMP Biomedicals1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
Pożywka bez surowicyGibco10902-096
Thincert wkładki do hodowli komórkowych do płytek 24-dołkowych, wielkość porów 3 i mikro; mGreiner662630
Kolba do hodowli tkankowych 75 cm² czerwona nasadka sterylnaGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Woltomierz Millicell-ERS2 z elektrodą MERSSTX01MiliporeMERSSTX00

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
  2. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
  3. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
  4. Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
  5. Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069(2012).
  6. Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
  7. Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  8. Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80(2015).
  9. Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
  10. Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
  11. Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
  12. Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
  15. Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  16. Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30(2013).
  17. McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
  18. Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
  19. Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
  20. Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
  21. Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
  22. Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
  23. Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
  24. Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
  25. Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
  26. Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
  27. Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
  28. Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
  29. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  30. Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
  31. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
  32. Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
  33. Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Choroid Plexus Epithelial CellsHuman Choroid Plexus Papilloma CellsTransepithelial Electrical Resistance MeasurementTight Junction Formation AnalysisBasolateral Bacterial Infection ModelNeisseria Meningitidis Invasion AssayFITC Inulin Permeability TestCell Culture Filter Insert SystemImmunofluorescent ZO 1 Occludin Claudin

Powiązane artykuły