Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54062

⸱

27 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular Therapeutics, Allegheny Health Network, 2Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University, 3Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten film demonstruje protokół wzbogacania komórek nabłonka grasicy (TEC) o gradient gęstości do izolacji FACS. Pokazuje również zastosowanie peptydów EAK16-II/EAKIIH6 do promowania tworzenia agregatów TEC. Mikrośrodowiska hydrożelu EAK16-II/EAKIIH6 zapewniają konfigurację 3D niezbędną do utrzymania przetrwania i funkcji TEC.

Streszczenie

Inwolucja grasicy, związana ze starzeniem się lub patologicznymi zniewagami, powoduje zmniejszenie produkcji dojrzałych limfocytów T. Przywrócenie funkcji niewydolności grasicy ma kluczowe znaczenie dla utrzymania skutecznej nabytej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T przeciwko atakującym patogenom. Jednak regeneracja i rewitalizacja grasicy okazała się wyzwaniem, głównie ze względu na trudności w odtworzeniu unikalnego mikrośrodowiska 3D zrębu grasicy, które ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i funkcji komórek nabłonka grasicy (TEC). Opracowaliśmy nowatorski system hydrożelowy wspomagający tworzenie agregatów TEC, oparty na właściwościach samoorganizacji amfifilowych oligopeptydów EAK16-II i ich histydynilowanego analogu EAKIIH6. TEC wzbogacono z wyizolowanych komórek grasicy z gradientem gęstości, posortowano za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i znakowano przeciwciałami przeciwko cząsteczkom adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM), które zakotwiczono, wraz z anty-His, w kompleksach adaptorowych białka A/G. Tworzenie agregatów komórkowych wspomagano poprzez inkubację TEC z oligopeptydami EAKIIH6 i EAK16-II, a następnie poprzez zwiększenie stężenia jonów w pożywce w celu zainicjowania żelowania. Agregaty TEC osadzone w hydrożelu EAK mogą skutecznie promować rozwój funkcjonalnych limfocytów T in vivo po przeszczepieniu do atymimicznych nagich myszy.

Wprowadzenie

Grasica jest głównym narządem limfoidalnym odpowiedzialnym za generowanie zróżnicowanej populacji reaktywnych na patogeny, samotolerancyjnych limfocytów T, które są niezbędne do funkcjonowania nabytego układu odpornościowego. Jest to dynamiczny narząd, w którym rozwijające się tymocyty, migrowane ze szpiku kostnego jako komórki progenitorowe limfocytów, migrują przez gąbczastą trójwymiarową (3D) matrycę zrębu grasicy, przechodzą specyfikację i różnicowanie linii, a ostatecznie emigrują jako dojrzałe limfocyty T. Powodzenie tego dobrze zaprogramowanego procesu zależy w dużej mierze od wzajemnego oddziaływania między migrującymi tymocytami a mieszkalnymi komórkami nabłonka grasicy (TEC), dominującą populacją zrębu grasicy, która jest niezbędna do ustanowienia i utrzymania integralności mikrośrodowiska grasicy.

Na podstawie ich anatomicznego położenia i unikalnej funkcji, TEC można podzielić na dwie podgrupy: TEC w korze (cTEC), które są odpowiedzialne za selekcję limfocytów T ograniczonych przez MHC (główny kompleks zgodności tkankowej) (selekcja pozytywna), oraz TEC w rdzeniu (mTEC), które są niezbędne do eliminacji autoreaktywnych limfocytów T (selekcja negatywna) 1,2. Wiele czynników (np. starzenie się, infekcje, napromienianie, leczenie farmakologiczne) może powodować nieodwracalne uszkodzenia nabłonka grasicy, co skutkuje upośledzeniem odporności nabytej. Pomimo licznych prób, przywrócenie funkcji grasicy było wyzwaniem ze względu na trudności w odtworzeniu mikrośrodowiska grasicy. Warto zauważyć, że trójwymiarowa konfiguracja grasicy (3D) ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i funkcji TEC, podczas gdy TEC hodowane w środowisku 2-D szybko zmniejszają ekspresję genów krytycznych dla tymopoezy 3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) i jego C-końcowy histydynylowany EAKIIH6 analogowy (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHHH) są amfifilowymi oligopeptydami o niskiej masie cząsteczkowej, które są rozpuszczalne w wodzie dejonizowanej, ale ulegają żelowaniu, tworząc β-fibryle, gdy są wystawione na działanie jonów o sile wyższej niż 20 mM NaCl (normalne stężenie soli w płynie ustrojowym człowieka wynosi 154 mM). Ta właściwość reagująca na środowisko sprawia, że są to wszechstronne bloki konstrukcyjne do tworzenia struktur 3D. Znacznik Hisa na EAKII-H6 zapewnia mechanizm dokowania, dzięki któremu kompleksy rekombinowanego białka A / G wiążącego anty-His IgGs / Fc (αH6: pA / G) mogą służyć jako adaptor do zakotwiczenia leków białkowych i innych biomolekuł (np. przeciwciał) na kompozycie hydrożelowym 5-8.

Wcześniej wykazaliśmy, że znakowane fluorescencyjnie cząsteczki IgG zakotwiczone na hydrożelu mogą być zatrzymywane w miejscu wstrzyknięcia przez okres do 13 dni 9. Ponadto, gdy adaptery αH6:pA / G zakotwiczone w IgG anty-CD4 zostały dodane do hydrożelu EAK16-II/EAKIIH6 (EAK), limfocyty T CD4 + zostały specjalnie wychwycone 10. Korzystając z podobnej techniki, wykazaliśmy niedawno, że agregacja 3-D TEC może być promowana w hydrożelu EAK z kompleksami adaptorowymi przenoszącymi specyficzne dla TEC przeciwciała anty-EpCAM (αH6:pA/G:αEpCAM). Po przeniesieniu pod kapsułki nerkowe nagich myszy, klastry TEC osadzone w hydrożelu EAK mogą skutecznie wspierać rozwój funkcjonalnych limfocytów T in vivo11,12.

Tutaj ilustrujemy naszą metodę szybkiego i skutecznego oczyszczania TEC za pomocą aktywowanego fluorescencją sortowania komórek (FACS) i generowania agregatów 3-D TEC za pomocą systemu hydrożelowego EAK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w eksperymentach były trzymane w obiekcie dla zwierząt w Instytucie Badawczym Allegheny-Singer zgodnie z protokołem sprawdzonym i zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Allegheny Health Network/Allegheny Singer Research Institute.

1. Trawienie grasicy za pomocą kolagenazy

  1. Zbierz grasicę.
    1. Poddaj eutanazji 3-5 tygodniowe myszy C57BL6/J w komorze na dwutlenek węgla (CO2) w celu pobrania grasicy. Szczegółowo umieść myszy w komorze pod indukcją CO2 na 3-5 minut i potwierdź śmierć, weryfikując zatrzymanie akcji serca lub oddechu.
    2. Połóż tuszę na plecach i zwilż ciało 70% etanolem. Wykonaj małe poziome nacięcie ostrymi, prostymi nożyczkami preparacyjnymi na brzuchu przez skórę. Pociągnij skórę na obu końcach (głowie i nogach) tak, aby była wywrócona na lewą stronę.
    3. Wykonaj poziome cięcie nożyczkami preparacyjnymi tuż pod najniższym żebrem i przetnij membranę na boki. Przytrzymaj wyrostek mieczykowaty kleszczami i przetnij środek żeber, idąc w górę po obu stronach. Podciągnij żebra/mostek tak, aby grasica była wyraźnie widoczna.
      Uwaga: Grasica leży bezpośrednio na sercu, składa się z 2 płatów i ma biały, półprzezroczysty kolor.
    4. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie zgarnij i wyciągnij płaty grasicy z tkanki łącznej i przenieś do roztworu myjącego (patrz Lista materiałów).
  2. Przygotować roztwór wytrawiający, mieszając 9 ml RPMI-1640 (pożywka Roswell Park Memorial Institute-1640), 0,025 mg/ml oczyszczonej kolagenazy, 10 mM kwasu HEPES [4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego] i 0,2 mg/ml DNazy I w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Roztwór wytrawiający przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu użycia.
    Uwaga: Ilość przygotowanego roztworu wytrawiającego jest wystarczająca dla maksymalnie pięciu dorosłych myszy grasic, które mogą być inkubowane razem w jednej probówce okrągłodennej o pojemności 5 ml z polistyrenu.
  3. Przenieś grasicę do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm zawierającego 5-6 ml RPMI-1640.
  4. Rozciąć grasicę za pomocą igły do strzykawki insulinowej 28 G na małe kawałki (około 1 mm3 kwadratowe), aby limfocyty mogły wypłynąć.
  5. Opłucz kawałki grasicy za pomocą RPMI-1640, który znajduje się na szalce Petriego, za pomocą szklanej pipety Pasteura. Przechyl naczynie i pozwól, aby fragmenty grasicy opadły na dno. Powoli odessać i wyrzucić supernatant RPMI-1640 za pomocą szklanej pipety. Powtórz ten etap płukania z 5-6 ml RPMI-1640 4-5 razy szklaną pipetą, aż roztwór będzie mniej nieprzezroczysty.
    Uwaga: Na tym etapie zalecane są pipety szklane, ponieważ fragmenty grasicy mają tendencję do przyklejania się do plastiku, co powoduje nadmierną utratę tkanek grasicy. Do dalszej części procedury używaj plastikowych pipet.
  6. Po ostatnim płukaniu wyrzucić supernatant zgodnie z opisem w kroku 1.5. Dodać 3 ml roztworu do wytrawiania i przenieść kawałki grasicy oraz roztwór do 5 ml probówki z polistyrenu o okrągłym dnie.
  7. Umieścić probówkę na rotatorze probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 minut z prędkością obrotową 12 obr./min.
  8. Po inkubacji pozwól fragmentom grasicy opaść grawitacyjnie na dnie probówki. Zebrać sklarowany osad za pomocą pipety Pasteura i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z 10 ml roztworu myjącego. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml roztworu do mycia. Trzymaj na lodzie.
  9. Powtórz kroki 1.6-1.8 dwukrotnie na fragmentach grasicy w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem. Zebrać supernatant w tej samej probówce o pojemności 50 ml.
    Uwaga: Wirowanie nie jest konieczne przy drugim i trzecim praniu.
  10. Po końcowym wytrawieniu pipetować w górę i w dół za pomocą plastikowej pipety serologicznej o pojemności 2 ml w celu rozdrobnienia wszelkich pozostałych fragmentów w probówce i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  11. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml o sile 300 x g przez 5 minut, odessać supernatant, ponownie zawiesić w 10 ml buforu płuczącego i przefiltrować przez sitko o wielkości komórek 100 μm. Trzymaj na lodzie.

2. Wzbogacenie TEC o nieciągły gradient gęstości

  1. Przygotować roztwór o gradiencie gęstości 21%, mieszając 2,4 ml pożywki o gradiencie gęstości (60% w/v jodiksanolu w wodzie) i 9,6 ml roztworu do mycia.
  2. Odwirować zdysocjowane komórki grasicy w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml z kroku 1.11 przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 2,5 ml buforu do przemywania .
  3. Dodaj 20 ml pożywki RPMI-1640 do zawiesiny komórek.
  4. Napełnić 12 ml roztworu o gradientzie gęstości 21% w 10 ml pipecie serologicznej za pomocą pipetora elektronicznego. Umieścić końcówkę pipety serologicznej na dnie probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej komórki i pozwolić, aby roztwór gradientu gęstości spłynął grawitacyjnie na dno probówki.
    1. Delikatnie usunąć roztwór gradientu gęstości z pipety, aby zakończyć tworzenie dwóch warstw o różnej gęstości.
  5. Wirować przy 600 x g przez 20 minut przy wilgotności względnej w wirniku z wiadrem wahliwym. Ustaw tempo zwalniania na najwolniejszym poziomie.
  6. Przenieś wierzchnią warstwę i interfejs do nowej probówki o pojemności 50 ml.
    Uwaga: Większość TEC jest zachowywana w interfejsie. Limfocyty wytrącą się na dno probówki po odwirowaniu. Jeśli komórki te mają być wykorzystane do innych celów, należy trzykrotnie przepłukać osad 20 ml roztworu myjącego. Zawiesić komórki w 10 ml buforu do przemywania wody.
  7. Dodać roztwór myjący do 40 ml do probówki w kroku 2.6 i odwirować przy 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Aby usunąć supernatant, należy odessać za pomocą pipety.
  8. Powtórz mycie i aspirację jeszcze 2 razy, jak opisano w kroku 2.7.
  9. Zawiesić w 2 ml roztworu płuczącego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

3. Izolowanie TEC za pomocą FACS

  1. Ustawić komórki z kroku 2.9 przy stężeniu 1x106 komórek/100 μl roztworem myjącym i przenieść komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml (polipropylen lub polistyren, zgodnie z zaleceniami instrukcji sortera przepływowego).
  2. Dodać 2 μl receptora anty-Fc IgG na 1x106 komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  3. Dodać przeciwciała anty-CD45 (rozcieńczenie 1:150, 10 μl na próbkę) i anty-EpCAM (rozcieńczenie 1:100, 10 μl na próbkę) i inkubować w temperaturze 4 °C przez ponad 20 minut.
  4. Przemyć komórki 2 ml roztworu płuczącego i odwirować przy 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant pipetą.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  6. Przefiltrować przez sitko o średnicy 100 μm.
  7. Zastosuj komórki do przyrządu sortującego. Wybierz populację limfocytów i TEC z wyłączeniem najmniejszych komórek na panelu światła rozproszonego bocznego (SSC) / światła rozproszonego do przodu (FSC) (martwe komórki), a następnie przejmij do wybranej populacji CD45-EpCAM+ w celu sortowania13.

4. Generowanie agregatów TEC/EAK

Uwaga: Wykonaj przygotowanie odczynnika i etapy związane z mieszaniem komórek pod kapturem laminarnym.

  1. Przygotować kompleksy adaptorów pA/G, mieszając 4 μl anty-His-tag IgG, 8 μl anty-EpCAM IgG i 2,6 μl pA/G w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  2. Dostosować posortowane TEC od kroku 3.7 do5x10 4 komórki/ml z roztworem myjącym i odpipetować 100 μl do jednego dołka z nisko parującej, 96-dołkowej okrągłodennej płytki do hodowli tkankowej. Dodaj 14,6 μl kompleksów adaptacyjnych pA/G do komórek. Umieść talerz na bujanej platformie na 20 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć raz 200 μl roztworu myjącego. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 6 minut. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  4. Przemyć raz 200 μl 10% roztworu sacharozy. Wirować przy 400 x g przez 6 min. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 30 μl 10% sterylnego roztworu sacharozy na dołek.
  6. Dodać 10 μl EAKIIH6 (7,5 mg/ml) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać 20 μl EAK16-II (10 mg/ml) do mieszaniny TEC.
  8. Dodać 100 μl kompletnej pożywki do systemu, aby rozpocząć żelowanie. Umieść płytkę na wytrząsarce platformowej na 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 2-4 godzinach dodać kolejne 100 μl kompletnego podłoża.
  10. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do użycia.
    1. Odessać 100 μl pożywki z powierzchni bez naruszania żelu za pomocą mikropipety i delikatnie dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki, przykładając końcówkę pipety do ścianki studzienki.

5. Charakterystyka agregatów TEC/EAK

  1. W celu zbadania funkcji agregatów TEC/EAK in vivo, należy pobrać hydrożel TEC/EAK po hodowli O/N i przeszczepić go pod torebkę nerkową atymimicznego nagiego myszy, stosując wcześniej opisaną procedurę 11,14.
  2. Monitoruj rozwój limfocytów T na obrzeżach, zbierając 50-100 μl próbek krwi do probówki do pobierania krwi zawierającej EDTA od nagich myszy 4-6 tygodni po przeszczepie i wybarwić koktajlem przeciwciał anty-CD4, -CD8, -CD45 i -CD312.
  3. Analizuj procentową zawartość limfocytów T w leukocytach krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) przy użyciu oprogramowania do analizy pojedynczych komórek12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać skuteczność wykorzystania protokołu separacji gradientu gęstości do wzbogacenia komórek zrębu CD45, komórki pobrane zarówno z interfejsu, jak i z wytrąconych granulek limfocytów zostały wybarwione przeciwciałami anty-CD45 i anty-EpCAM. Zarówno przeciwciała anty-Ulex Europaeus Agglutynina 1 (UEA1), jak i przeciwciała anty-MHC klasy II zostały również włączone do koktajlu barwiącego w celu dalszej identyfikacji podzbiorów cTEC i mTEC. Jak pokazano na rysunku 1, b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż TEC są dominującą populacją zrębu grasicy i odgrywają istotną rolę w budowie i funkcji grasicy, stanowią one tylko około 0,1-0,5% całkowitej komórkowości grasicy. Są to również komórki kruche, ponieważ czasami obserwuje się wysoki odsetek śmierci komórek po trawieniu kolagenazą, tj. leczeniu mającym na celu dysocjację TEC od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ich rzadkość (~200 000 na grasicę myszy) i kruchość sprawiły, że wyizolowanie TEC było trudnym zadaniem. Niedawne zastosowanie wysoko oczyszczonej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health R21 AI113000 (W.S.M) i R01 AI123392 (Y.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TEC Isolation
70% EthanolDecon Laboratories2701(1 galon)Etanol 200 Proof, woda dejonizowana
Nożyczki preparacyjne, prosteFine Science Tools, Inc.91460-11
Kleszcze Graefe, prosteFine Science Tools, Inc.11053-10
Kleszcze Graefe, zakrzywioneFine Science Tools, Inc.11052-10
Roztwór1x PBS, 0,1% BSA, 2  mM EDTA
1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Gibco10010-023
BSA (albumina surowicy bydlęcej)SigmaA1470-100G
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Invitrogen15575-038
Roztwór9 ml RPMI-1640, 0,025  mg/ml Liberase TM Klasa badawcza, 10  mM HEPES, 0,2  mg/ml DNaseI
RPMI-1640Gibco11879-020
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001określany jako "oczyszczona kolagenaza"
1  M HEPESLonza17-737E
Dnase IRoche10 104 159 001
50  ml Probówka wirówkowaCorning430290
60  mm naczynie do hodowli tkankowychFalcon353002
1/2  cc U-100 Strzykawka insulinowa 28  1/2  GBecton Dickinson329461
5  ml Polistyrenowa rurka okrągłodennaFalcon352058
5  ml szklana pipetaFisher Healthcare13-678-27ESłuży do płukania fragmentów grasicy. Fragmenty grasicy mają tendencję do przyklejania się do ściany plastikowymi pipetami.
Rotator rurowy MACSmixMiltenyi130-090-753
100  &mikro; m Sitko komórkoweFalcon352360
Gradient gęstości średni: OptiPrepAxis-Shield
Cell Sorting
  ml Polipropylenowa probówka okrągłodennaFalcon352063
Anti-Mouse CD16/CD32 (Fc Block)BD Biosciences553142Stosować w postaci nierozcieńczonej, 2  &mikro; l na próbkę
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5eBioscience45-0451-80Stosować w 1:150, 10  &mikro; l na próbkę
Anti-Mouse CD326 (EpCAM)-PEeBioscience12-5791-82Stosować w 1:100, 10  &mikro; l na próbkę
BD InfluxBD Biosciences
Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórekFlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-TagAnaSpec29673"anti-His-Tag IgG"
Oczyszczony anty-mysz CD326 (EpCAM)BioLegend118202"anty-EpCAM IgG"
Rekombinowane białko A/GPierce Biotechnology
1.5  ml Probówki Safe-Lock, Biopur, SterileFisher Healthcare05-402-24Bokreślane jako "1.5  ml probówka do mikrowirówek
96-dołkowa, płytka do hodowli tkankowych, okrągłodenna z pokrywką o niskiej parowaniuBD Falcon353917
Platforma bujana: Mikser nutatorów nr 1105BD Clay Adams
10% sacharozaSigmaS0389Przygotuj ze sterylną wodą destylowaną
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)American Peptide Company& nbsp;Synteza na zamówienie, 10  mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)American Peptide Company Syntetyzowane na zamówienie, 7.5  mg/ml
Kompletna pożywkaRPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamina, 1% NEAA, 5  mM HEPES, 50  &mikro; M 2-merkaptoetanol
RPMI-1640Gibco11879-020
FBS (Płodowa surowica bydlęca)Atlanta BiologicalsS11150Ciepło inaktywowane przed użyciem
Długopis/PaciorkowiecGibco15140-122
L-glutamina 200  mM (100x)Gibco25030-081
NEAA (aminokwas endogenny) 100xGibco11140-050
1  M HEPESBioWhittaker17-737E
2-merkaptoetanol (100x)MilliporeES-007-E
Wytrząsarka platformowa: Tancerka brzuchaStovall Life Sciences Inc.Modelu: USBDbo
myjący wytrawiający 5"

Bibliografia

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780(2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie FACShydro el EAKgradient g sto cimikroskopia konfokalnasortowanie przep ywowekompleks bia ka A Gprzeciwcia o anty EpCAMinicjacja elowania
Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.