Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje Golden Gate Assembly i plazmid pGR-blue do szybkiego ilościowego określenia siły terminatorów znalezionych w silico.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest umożliwienie szybkiej weryfikacji biologicznie zidentyfikowanych terminatorów. Co więcej, plazmid (pGR-Blue) został zaprojektowany specjalnie dla tego protokołu i pozwala na ilościowe określenie wydajności terminatora. Jako dowód słuszności koncepcji, w mykobakteriofagu Bernal13 zidentyfikowano bioinformatyczny sześć terminatorów. Po zidentyfikowaniu terminatory zostały następnie wykonane jako oligonukleotydy z odpowiednimi lepkimi końcami i wyżarzane razem. Korzystając z Golden Gate Assembly (GGA), terminatory zostały następnie sklonowane do pGR-Blue. W świetle widzialnym fałszywie dodatnie kolonie wydają się niebieskie, a dodatnio przekształcone kolonie są białe/żółte. Po indukcji promotora indukowanego arabinozą (pBad) arabinozą, siłę kolonii można określić, mierząc stosunek wytwarzanego białka zielonej fluorescencji (GFP) do wytwarzanego białka czerwonej fluorescencji (RFP). Dzięki pGR-Blue protokół można ukończyć w ciągu zaledwie trzech dni i jest idealny w środowisku edukacyjnym. Ponadto wyniki pokazują, że protokół ten jest przydatny jako środek do zrozumienia przewidywań in silico dotyczących wydajności terminatora związanej z regulacją transkrypcji.

Wprowadzenie

Duże projekty biologii syntetycznej wymagają użycia wysoce skutecznych terminatorów transkrypcji, aby pomóc regulować ekspresję genów. Identyfikacja nowych terminatorów wymaga bioinformatycznej analizy nowych genomów. Jednak wraz z rozwojem coraz większej ilości oprogramowania bioinformatycznego, z których każde ma unikalny algorytm wykorzystywany do przewidywania, pojawia się większa rozbieżność między przypuszczalnymi wynikami. Ponieważ proces ten jest nieco subiektywny i odbywa się in silico, przewidywania te wymagają biologicznego potwierdzenia. ¹ Ponadto liczba domniemanych terminatorów zidentyfikowanych za pomocą analizy in silico wymaga zastosowania strategii klonowania, które można ukończyć w stosunkowo krótkim czasie.

Plazmid PGR-Blue jest modyfikacją plazmidu PGR, która została przeprojektowana tak, aby używała Golden Gate Assembly (GGA) w celu uproszczenia procedury klonowania, umożliwiając jednoczesne przeprowadzenie wszystkich etapów reakcji w jednej probówce mikrowirówki. ^2,3 Selekcja kolorów została włączona do plazmidu, aby zwiększyć łatwość identyfikacji dodatnich kolonii. Udana ligacja powinna być biało-żółta w świetle widzialnym i fluoryzować na zielono w świetle niebieskim (450 nm) lub ultrafioletowym (UV), gdy jest uprawiana na płytkach zawierających arabinozę. Ponieważ nieoszlifowany pGR-blue zawiera niebieskie białko chromo (amilCP), kolonie zawierające niezmodyfikowany plazmid są niebieskie w świetle widzialnym. To uproszczenie wraz z uproszczonym protokołem pozwala naukowcom przejść od identyfikacji bioinformatycznej do potwierdzenia biologicznego w ciągu trzech do czterech dni. Konstrukcja tego systemu może być korzystna zarówno w laboratorium badawczym, jak i w środowisku edukacyjnym.

Plazmid pGR-Blue pozwala na ilościowe określenie siły terminatora. ⁴ Pojedynczy promotor indukowany arabinozą jest używany do produkcji białka zielonej fluorescencji (GFP) i białka czerwonej fluorescencji (RFP). Terminator jest klonowany do plazmidu po sekwencji GFP, ale przed sekwencją RFP, zatrzymując w ten sposób transkrypcję białka RFP. Wytrzymałość terminatora zależy od stosunku wyprodukowanej GFP do wyprodukowanego zapytania ofertowego.

Raport Vision and Change⁵ sugerował, że edukacja w zakresie nauk ścisłych, technologii, inżynierii i matematyki (STEM) wprowadza do klasy doświadczenia oparte na badaniach. ⁶ Wymaga to jednak opracowania protokołów, które mogą być wykonane przez uczniów o ograniczonych umiejętnościach w określonym czasie. Chociaż protokół można zrealizować w ciągu zaledwie trzech dni, został on również zaprojektowany tak, aby każdy główny krok można było wykonać w oddzielnym tygodniowym (2-3 godzinnym) okresie laboratoryjnym, aby stworzyć Course Research Experience (CRE). W przypadku zastosowania w ten sposób procedura trwa od trzech do sześciu tygodni i jest odpowiednia zarówno dla początkujących, jak i zaawansowanych kursów z genetyki, biologii komórki lub bioinformatyki.

Protokół

1. Projektowanie i zamawianie oligonukleotydów z odpowiednimi lepkimi końcami

1. Zidentyfikuj potencjalne terminatory niezależne od rho poprzez analizę genomiczną z wykorzystaniem programów dostępnych bezpłatnie w sieci.⁷
2. W przypadku pracy z dwuniciowym DNA określ orientację testowanego terminatora.⁷ Plazmid pGR-Blue weryfikuje jedynie terminatory ligowane w kierunku 5' do 3' na nici górnej (pasmo w przód).
   1. Przekształć terminator z nici dolnej (odwrotnej) w jego komplementarny odwrócony odpowiednik, aby zmienić orientację sekwencji na potrzeby testowania w pGR-Blue, korzystając z bezpłatnego oprogramowania online, np. ApE.
3. Po potwierdzeniu prawidłowej orientacji dodaj lepki koniec „ 5'-CGAC-3' ” do końca 5' nici górnej. Dodaj lepki koniec „ 5'-CCGC-3' ” do końca 5' nici dolnej. ⁸ Zapewni to, że ligowany insert zostanie wstawiony w odpowiedniej orientacji przy użyciu GGA.
4. Po ustaleniu sekwencji zamów komercyjnie jednoniciowe oligonukleotydy.

2. Wyżarzanie oligonukleotydów (dotyczy tylko liofilizowanego DNA)

1. Ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 100 µM.
2. Przygotować 10-krotny bufor do wyżarzania: 1 M NaCl i 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Bufor do wyżarzania można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Po przygotowaniu bufora i ponownym zawieszeniu oligonukleotydów rozpocząć wyżarzanie⁸.
3. Dla każdego terminatora poddanego badaniu dodać 16 µl wody ultra-czystej do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
4. Dodać 2 µl 10-krotnego buforu do wyżarzania do każdej probówki do mikrocentryfugi.
5. Dodać 1 µl oligonukleotydu nici górnej (10 µM) z wybranego terminatora.
6. Dodać 1 µl oligonukleotydu nici dolnej (10 µM) z wybranego terminatora.
7. Przygotować kąpiel w wrzącej wodzie, używając zlewki o pojemności 1 0 ml zawierającej około 40 ml wody z kranu, i ustawić ją na płycie grzewczej.
8. Umieścić probówki do mikrocentryfugi z kroku 2.6 w pływaku i gotować przez 4 min. Po 4 min wyłączyć płytę grzewczą, ale pozostawić probówki i pływak w kąpieli wodnej do powolnego schłodzenia przez noc (18 h) ⁸. Wyżarzone terminatory przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Montaż Golden Gate (mieszanka standardowa — kosztowo efektywna)

1. Przygotować rozcieńczenie wyżarzonych terminatorów o stężeniu 40 nM. Dodać 124 µl wody wolnej od nukleaz do 1 µl mieszaniny wyżarzonych terminatorów (10 µM).
   1. Odwirować próbki przez 30 s przy 10 0 x g i przechowywać na lodzie.
2. Do nowej probówki odpowiedniej dla używanego termocyklera dodać 6 µl wody wolnej od nukleaz.
3. Dodać 1 µl komercyjnego buforu do ligazy DNA [30 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 10 mM MgCl₂, 100 mM DTT oraz 10 mM ATP]. Wszystkie kolejne kroki wykonywać na lodzie.
4. Do probówki do mikrowirowania dodać 1 µl plazmidu docelowego pGR-Blue (35-50 ng/µl).
5. Do probówki do mikrowirowania dodać 1 µl wyżarzonych terminatorów o stężeniu 40 nM.
6. Do probówki do mikrowirowania dodać 0,5 µl komercyjnej wysokowiernej endonukleazy restrykcyjnej BsaI.
7. Do probówki do mikrowirowania dodać 0,5 µl komercyjnej ligazy DNA.
8. Odwirować mieszaninę reakcyjną przy 10 0 x g przez 120 s. Następnie umieścić probówkę bezpośrednio w termocyklerze.
9. Uruchomić program termocyklera: 20 cykli składających się z 1 min przy 37 °C, a następnie 1 min przy 16 °C, po których następuje 1 cykl 15 min przy 37 °C. Próbki należy zużyć niezwłocznie lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.⁸

4. Montaż Golden Gate (komercyjny Master Mix — oszczędność czasu)

1. Do 1 µl wyżarzonych terminatorów o stężeniu 10 µM przygotowanych w kroku 2 dodać 124 µl wody wolnej od nukleaz. Pozwala to rozcieńczyć stężenie DNA terminatorów do 40 nM. Krok ten należy przeprowadzić w nowej, opisanej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
2. Do nowej probówki odpowiedniej do termocyklera dodać 14 µl wody wolnej od nukleaz. Należy upewnić się, że nowa probówka jest odpowiednio opisana.
3. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 2 µl Commercial Master Mix Buffer.
4. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 1 µl plazmidu pGR-Blue (35-50 ng/µl).
5. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 2 µl wyżarzonych terminatorów o stężeniu 40 nM.
6. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 1 µl Commercial Master Mix.
7. Probówkę z roztworem 40 nM wirować przy 10,0 x g przez 120 sec. Następnie umieścić probówkę bezpośrednio w termocyklerze.
8. Uruchomić program termocyklera: 1 cykl trwający 60 min w 37 °C, a następnie 1 cykl trwający 15 min w 5 °C. Próbki należy wykorzystać niezwłocznie lub zamrozić i przechowywać w -20 °C.

5. Transformacja i selekcja kolonii

1. Przygotować płytki Petri z agarem Luria Base (LB) zawierające ampicylinę (Amp) w stężeniu 1 mM oraz arabinozę (arb) w stężeniu 10 mM. Przygotować co najmniej 10 ml roztworu zapasowego L-arabinozy o stężeniu 1 M, ponieważ roztwór ten będzie wykorzystywany w kolejnych etapach.
2. Do transformacji użyć dowolnych wysokowydajnych (10⁸ - 10⁹ transformantów/µg) chemicznie kompetentnych komórek E. coli (JM109).⁹ Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodać 3-5 µl reakcji ligacji do 50 µl kompetentnych komórek. W przypadku użycia chemicznie kompetentnych komórek należy postępować zgodnie z protokołem transformacji specyficznym dla używanych komórek.
3. Połowę (25 µl) przetransformowanych komórek rozprowadzić na uprzednio ogrzanych płytkach z agarem LB (Amp/arb) za pomocą sterylnego, L-kształtnego rozprowadzacza („hockey stick”) i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C. Ze względu na szybkie tempo rozkładu ampicyliny nie inkubować w 37 °C przez więcej niż 24 h.
4. Przeprowadzić selekcję kolonii na podstawie koloru poprzez inspekcję wizualną. Prawidłowa ligacja powinna dawać kolonie w kolorze białym/żółtym w świetle widzialnym i fluorescencyjne zielone pod światłem niebieskim (450 nm) lub UV. Nieudana ligacja spowoduje powstanie kolonii o kolorze niebieskim w świetle widzialnym po 18 - 20 h.

6. Weryfikacja i kwantyfikacja terminatora

1. Przygotować probówki z 5 ml sterylnego bulionu LB z dodatkiem 1 mM ampicyliny i 10 mM arabinozy. Liczba potrzebnych probówek zależy od liczby testowanych terminatorów oraz kontroli (komórki z opornością na ampicylinę, które nie fluorescują, oraz komórki zawierające niecięty plazmid pGR-Blue).
2. W świetle widzialnym należy za pomocą sterylnej pętli pobrać 2–3 białe/żółte kolonie (krok 5.4). Próbki należy inkubować w bulionach na wytrząsarce w 37 °C oraz 160 obr./min przez 16–18 godz. Próbek tych nie należy inkubować dłużej niż przez 24 godz.
   1. Opcjonalnie można użyć spektrofotometru do oznaczenia gęstości optycznej hodowli przy 60 nm (OD₆₀₀) w celu zapewnienia odpowiedniego wzrostu komórek. Zazwyczaj wartość OD₆₀₀ po 16–18 godzinach wzrostu obserwuje się wartość ~0,8–1,0.
3. W pozostałych krokach należy użyć sterylnej płytki 96-dołkowej. Kroki te należy przeprowadzić w środowisku aseptycznym i w trzech powtórzeniach. Dodać 199 µl sterylnego bulionu LB z ampicyliną i arabinozą (1 mM ampicyliny/10 mM arabinozy) do każdego dołka. Pozostaw na płytce miejsce na trzy oddzielne kontrole.
   1. Należy zastosować trzy poniższe kontrolki: dołek (1) zawierający wyłącznie pożywkę LB + Amp/arabinose oraz dołek (2) z nieprzekształconymi komórkami kompetentnymi (próba ślepa), służący jako tło. Do kwantyfikacji (3) siły terminatora należy włączyć komórki zawierające niecięty oryginalny pGR lub pGR-Blue zligowany z sekwencją nieterminującą (kontrolka referencyjna do kwantyfikacji). Patrz Rysunek 1 do układu płytki w czytniku płytek.
4. Pipetka 1 µl zawiesiny komórkowej z pożywek inkubowanych przez noc do poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej.
5. Uszczelnić płytki przepuszczalną osłoną i inkubować z wytrząsaniem przez 18–20 h w temperaturze 37 °C oraz 160 obr./min.
6. Za pomocą czytnika płytek wyznaczyć OD₆₀₀ poprzez odczyt absorbancji przy 60 nm. Fluorescencję GFP należy mierzyć przy następujących parametrach: wzbudzenie 395 i emisja 509. Fluorescencję RFP należy mierzyć przy następujących parametrach: wzbudzenie 575 i emisja 605. Po 18–20 godzinach wartość OD₆₀₀ powinna wynosić około 0,5.
7. Aby znormalizować wyniki pod kątem różnic w przyroście, należy zastosować następujące równanie: zarówno dla GFP, jak i RFP.
8. Po normalizacji należy wyznaczyć względną siłę terminatora, korzystając z równania 

Wyniki

Niniejszy protokół pozwoli na otrzymanie komórek zawierających pGR-Blue z terminatorem ligowanym pomiędzy GFP i RFP przy użyciu metody Golden Gate Assembly (Rysunek 2). Pozytywne kolonie zawierające zligowany insert można wyselekcjonować na podstawie koloru. W świetle widzialnym kolonie pozytywne będą białe/żółte, natomiast wyniki fałszywie dodatnie objawią się powstaniem kolonii niebieskich po 18-20 h inkubacji w 37 °C (Rysunek 3).

Dyskusja

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest odpowiednie zaprojektowanie oligonukleotydu przed złożeniem zamówienia. Oligonukleotydy muszą mieć odpowiednie lepkie końce dodane do końców 5' zarówno górnej, jak i dolnej nici, aby zapewnić możliwość włączenia GGA. Ponadto ważne jest, aby zmienić orientację terminatorów skierowanych w lewo (terminatorów, które zatrzymują transkrypcję na dolnej nici) na orientację terminatorów skierowanych w prawo (kończy transkrypcję na górnej nici), ponieważ wyrażenie GFP i RFP jest skierowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pGR-Niebieski plazmid	Addgene	68374
pGR-Plasmid	Addgene	46002
AeraSeal-(sterylne arkusze)	Excel Scientific	BS-25	Tylko sterylne arkusze
10x bufor ligazy DNA T4	NEB
BsaI-HF	NEB	R3535S	Enzym inny niż HF będzie działał, ale jest mniej stabilny termicznie.
NEB Golden Gate Assembly Mix NEB		E1600S	Commerial Master Mix, o którym mowa w protokole.
Ligaza DNA T4	NEB	M0202S
Okrągła mikrowirówka pływająca	Nova Tech International	F18875-6401
Sól sodowa ampicyliny	Sigma Aldrich	A9518
L-(+)-Arabinoza	Sigma	Aldrich A-3256	D-Arabinoza nie wywoła promotora pBAD
Luria Base (LB) - Broth, Miller	Sigma Aldrich	L1900
Luria Base (LB) - Agar, Miller	Sigma Aldrich	L2025
Tecan-Infinite M200 Czytnik płytek	Tecan
Mix & Go Competent Cells - Szczep JM109	Zymo Research	T3005	Użyj zalecanego przez firmę protokołu transformacji
ApE: Oprogramowanie do edytora plazmidów	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, klasa molekularna	Promega	H5121
Chlorek sodu (krystaliczny / biologiczny, certyfikowany)	Fisher Chemical	S671
Komercjalna synteza oligonukleotydów	Zintegrowane technologie DNA (IDT)		http://www.idtdna.com/site
Mikrotestowe płytki do hodowli tkanek - 96 dołków (sterylne)	Falcon	35-3072
Mycobacteriophage "Bernal13"	"Bank genów	KJ510413
bez nukleazy	IDT)	IDT004
Sterylny, w kształcie litery L Hockey-Stick Cell Life	Science Products	6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	2000c
ARNold: narzędzie internetowe do przewidywania terminatorów transkrypcji niezależnych od Rho.

Zintegrowane technologie DNA (http://rna.igmors.u-psud.fr/