Artykuł metodologiczny

Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate

DOI:

10.3791/54064

⸱

25 kwietnia 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje Golden Gate Assembly i plazmid pGR-blue do szybkiego ilościowego określenia siły terminatorów znalezionych w silico.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest umożliwienie szybkiej weryfikacji biologicznie zidentyfikowanych terminatorów. Co więcej, plazmid (pGR-Blue) został zaprojektowany specjalnie dla tego protokołu i pozwala na ilościowe określenie wydajności terminatora. Jako dowód słuszności koncepcji, w mykobakteriofagu Bernal13 zidentyfikowano bioinformatyczny sześć terminatorów. Po zidentyfikowaniu terminatory zostały następnie wykonane jako oligonukleotydy z odpowiednimi lepkimi końcami i wyżarzane razem. Korzystając z Golden Gate Assembly (GGA), terminatory zostały następnie sklonowane do pGR-Blue. W świetle widzialnym fałszywie dodatnie kolonie wydają się niebieskie, a dodatnio przekształcone kolonie są białe/żółte. Po indukcji promotora indukowanego arabinozą (pBad) arabinozą, siłę kolonii można określić, mierząc stosunek wytwarzanego białka zielonej fluorescencji (GFP) do wytwarzanego białka czerwonej fluorescencji (RFP). Dzięki pGR-Blue protokół można ukończyć w ciągu zaledwie trzech dni i jest idealny w środowisku edukacyjnym. Ponadto wyniki pokazują, że protokół ten jest przydatny jako środek do zrozumienia przewidywań in silico dotyczących wydajności terminatora związanej z regulacją transkrypcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duże projekty biologii syntetycznej wymagają użycia wysoce skutecznych terminatorów transkrypcji, aby pomóc regulować ekspresję genów. Identyfikacja nowych terminatorów wymaga bioinformatycznej analizy nowych genomów. Jednak wraz z rozwojem coraz większej ilości oprogramowania bioinformatycznego, z których każde ma unikalny algorytm wykorzystywany do przewidywania, pojawia się większa rozbieżność między przypuszczalnymi wynikami. Ponieważ proces ten jest nieco subiektywny i odbywa się in silico, przewidywania te wymagają biologicznego potwierdzenia. 1 Ponadto liczba domniemanych terminatorów zidentyfikowanych za pomocą analizy in silico wymaga zastosowania strategii klonowania, które można ukończyć w stosunkowo krótkim czasie.

Plazmid PGR-Blue jest modyfikacją plazmidu PGR, która została przeprojektowana tak, aby używała Golden Gate Assembly (GGA) w celu uproszczenia procedury klonowania, umożliwiając jednoczesne przeprowadzenie wszystkich etapów reakcji w jednej probówce mikrowirówki. 2,3 Selekcja kolorów została włączona do plazmidu, aby zwiększyć łatwość identyfikacji dodatnich kolonii. Udana ligacja powinna być biało-żółta w świetle widzialnym i fluoryzować na zielono w świetle niebieskim (450 nm) lub ultrafioletowym (UV), gdy jest uprawiana na płytkach zawierających arabinozę. Ponieważ nieoszlifowany pGR-blue zawiera niebieskie białko chromo (amilCP), kolonie zawierające niezmodyfikowany plazmid są niebieskie w świetle widzialnym. To uproszczenie wraz z uproszczonym protokołem pozwala naukowcom przejść od identyfikacji bioinformatycznej do potwierdzenia biologicznego w ciągu trzech do czterech dni. Konstrukcja tego systemu może być korzystna zarówno w laboratorium badawczym, jak i w środowisku edukacyjnym.

Plazmid pGR-Blue pozwala na ilościowe określenie siły terminatora. 4 Pojedynczy promotor indukowany arabinozą jest używany do produkcji białka zielonej fluorescencji (GFP) i białka czerwonej fluorescencji (RFP). Terminator jest klonowany do plazmidu po sekwencji GFP, ale przed sekwencją RFP, zatrzymując w ten sposób transkrypcję białka RFP. Wytrzymałość terminatora zależy od stosunku wyprodukowanej GFP do wyprodukowanego zapytania ofertowego.

Raport Vision and Change5 sugerował, że edukacja w zakresie nauk ścisłych, technologii, inżynierii i matematyki (STEM) wprowadza do klasy doświadczenia oparte na badaniach. 6 Wymaga to jednak opracowania protokołów, które mogą być wykonane przez uczniów o ograniczonych umiejętnościach w określonym czasie. Chociaż protokół można zrealizować w ciągu zaledwie trzech dni, został on również zaprojektowany tak, aby każdy główny krok można było wykonać w oddzielnym tygodniowym (2-3 godzinnym) okresie laboratoryjnym, aby stworzyć Course Research Experience (CRE). W przypadku zastosowania w ten sposób procedura trwa od trzech do sześciu tygodni i jest odpowiednia zarówno dla początkujących, jak i zaawansowanych kursów z genetyki, biologii komórki lub bioinformatyki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i porządkowanie oligonukleotydów z odpowiednimi lepkimi końcami

  1. Zidentyfikuj potencjalnych terminatorów niezależnych od rho poprzez analizę genomiczną za pomocą programów, które są swobodnie dostępne online. 7
  2. Podczas pracy z dwuniciowym DNA określ orientację terminatora, który ma być testowany. 7 Plazmid pGR-Blue weryfikuje tylko terminatory zligowane w kierunku od 5' do 3' na górze (pasmo przednie).
    1. Przekształć zakończenie dolnej (odwróconej) nici na jego odwrócone uzupełnienie, aby zmienić orientację sekwencji do testowania w pGR-Blue za pomocą bezpłatnego oprogramowania online, np. ApE.
  3. Po ustaleniu, że orientacja jest prawidłowa, dodaj lepki koniec " 5'-CGAC-3' " do końca 5' górnego pasma. Dodaj lepki koniec " 5'-CCGC-3' " do końca 5' dolnego pasma. 8 Zapewni to, że podwiązana wkładka zostanie wprowadzona w odpowiedniej orientacji za pomocą GGA.
  4. Po ustaleniu sekwencji uporządkuj komercyjnie jako jednoniciowe oligonukleotydy.

2. Oligonukleotydy wyżarzające (dotyczy tylko liofilizowanego DNA)

  1. Ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 100 μM.
  2. Wykonaj 10x bufor do wyżarzania: 1 M NaCl i 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Bufor do wyżarzania może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Po wykonaniu buforu do wyżarzania i ponownym zawieszeniu oligonukleotydów rozpocznij wyżarzanie8.
  3. Dla każdego testowanego terminatora dodać 16 μl ultraczystej wody do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 2 μl 10x buforu do wyżarzania do każdej probówki mikrowirówki.
  5. Dodaj 1 μl oligonukleotydu górnej nici (100 μM) z żądanego terminatora.
  6. Dodać 1 μl oligonukleotydu dolnej nici (100 μM) z żądanego terminatora.
  7. Przygotuj wrzącą kąpiel wodną za pomocą zlewki o pojemności 1 000 ml zawierającej około 400 ml wody z kranu i umieść na gorącym talerzu.
  8. Umieść probówki do mikrowirówek z kroku 2.6 w pływaku i gotuj przez 4 minuty. Po 4 minutach wyłącz płytę grzewczą, ale pozostaw rurkę i zanurz się w łaźni wodnej, aby powoli schłodzić O/N (18 godzin) 8. Wyżarzone zakończniki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

3. Montaż Golden Gate (Standard Mix — Opłacalny)

  1. Wykonać rozcieńczenie 40 nM wyżarzonych zakończeń. Dodać 124 μl wody wolnej od nukleaz do 1 μl wyżarzonej mieszanki terminatorów (100 μM).
    1. Odwirować próbki przez 30 sekund przy 10 000 x g i przechowywać na lodzie.
  2. Do nowej probówki odpowiedniej dla używanego termocyklera dodać 6 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Dodaj 1 μl komercyjnego buforu ligazy DNA [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT i 10 mM ATP]. Wszystkie kolejne kroki wykonuj na lodzie.
  4. Dodać 1 μl plazmidu docelowego pGR-Blue (35-50 ng/μl) do probówki mikrowirówkowej.
  5. Dodać 1 μl wyżarzonych terminatorów o długości 40 nM do probówki mikrowirówki.
  6. Dodać 0,5 μl komercyjnej endonukleazy restrykcyjnej BsaI o wysokiej wierności do probówki mikrowirówkowej.
  7. Dodać 0,5 μl komercyjnej ligazy DNA do probówki mikrowirówkowej.
  8. Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 10 000 x g przez 120 sek. Następnie umieść probówkę bezpośrednio w termocyklerze.
  9. Uruchom program termocyklera: 20 cykli po 1 minutę w temperaturze 37 °C, następnie 1 minuta w temperaturze 16 °C, a następnie 1 cykl po 15 minut w temperaturze 37 °C. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.8

4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix — Time Efficient)

  1. Dodaj 124 μl wody wolnej od nukleaz do 1 μl 100 μM wyżarzonych terminatorów utworzonych w kroku 2. Powoduje to rozcieńczenie stężenia DNA terminatora do 40 nM. Wykonaj ten krok w nowej, oznaczonej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Do nowej probówki odpowiedniej dla termocyklera dodać 14 μl wody wolnej od nukleaz. Upewnij się, że nowa tuba jest odpowiednio oznaczona.
  3. Dodać 2 μl komercyjnego buforu Master Mix do probówki mikrowirówkowej.
  4. Dodać 1 μl plazmidu pGR-Blue (35-50 ng/μl) do probówki mikrowirówkowej.
  5. Dodać 2 μl wyżarzonych zakończeń 40 nM do probówki mikrowirówkowej.
  6. Dodać 1 μl Commercial Master Mix do probówki mikrowirówkowej.
  7. Odwirować probówkę 40 nM o masie 10 000 x g przez 120 sekund. Następnie umieść probówkę bezpośrednio w termocyklerze.
  8. Uruchomić program termocyklera: 1 cykl trwający 60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie 1 cykl trwający 15 minut w temperaturze 55 °C. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.

5. Transformacja i wybór kolonii

  1. Przygotować agarowe płytki Petriego na bazie Lurii (LB) zawierające 1 mM stężenie ampicyliny (Amp) i 10 mM stężenie arabinozy (arb). Przygotować co najmniej 10 ml 1 M roztworu podstawowego L-arabinozy, ponieważ ten roztwór podstawowy zostanie użyty w późniejszych etapach.
  2. Do transformacji należy użyć dowolnych wysokowydajnych (10,8 - 10,9 transformantów/μg), chemicznie kompetentnych komórek E. coli (JM109). 9 Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodaj 3-5 μl reakcji ligacji do 50 μl kompetentnych komórek. W przypadku korzystania z komórek kompetentnych chemicznie należy postępować zgodnie z protokołem transformacji specyficznym dla używanych komórek.
  3. Rozprowadzić połowę (25 μl) przekształconych komórek na wstępnie podgrzanych płytkach agarowych LB (Amp/arb) za pomocą sterylnego "kija hokejowego" w kształcie litery L i inkubować O/N w temperaturze 37 °C. Ze względu na szybkie tempo rozkładu ampicyliny, nie inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  4. Dokonaj selekcji kolonii na podstawie koloru przez oględziny. Udana ligacja powinna być biało-żółta w świetle widzialnym i fluoryzować na zielono w świetle niebieskim (450 nm) lub UV. Nieudana ligacja wytworzy kolonię o niebieskim kolorze w świetle widzialnym po 18 - 20 godzinach.

6. Weryfikacja i kwantyfikacja Terminatora

  1. Przygotować 5 ml sterylnych probówek bulionowych LB z 1 mM ampicyliny i 10 mM arabinozy. Liczba potrzebnych probówek zależy od liczby testowanych terminatorów oraz kontroli (komórki z opornością na ampicylinę, które nie fluoryzują i komórki zawierające nieprzecięty plazmid pGR-Blue).
  2. W świetle widzialnym wybierz 2-3 białe/żółte kolonie (krok 5.4) za pomocą sterylnej pętli. Pozostawić próbki do inkubacji w bulionach na wytrząsarce w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 160 obr./min przez 16–18 godzin. Nie należy inkubować tych próbek dłużej niż 24 godziny.
    1. Opcjonalnie użyj spektrofotometru, aby określić gęstość komórek optycznych przy 600 nm (OD600), aby zapewnić odpowiedni wzrost komórek. Ogólnie rzecz biorąc, OD600 wynoszący ~0,8-1,0 obserwuje się po 16-18 godzinach wzrostu.
  3. Do pozostałych etapów użyj sterylnej płytki 96-dołkowej. Czynności te należy wykonywać w warunkach aseptycznych i w trzech egzemplarzach. Do każdej studzienki dodać 199 μl sterylnego bulionu LB+ Amp/arabinozy (1 mM ampicyliny/10 mM arabinozy). Na płycie uwzględnij miejsce na trzy oddzielne elementy sterujące.
    1. Użyj następujących trzech kontrolek: studzienki (1) zawierającej tylko bulion LB + Amp/arabinoza i studzienki (2) dla nieprzekształconych kompetentnych komórek (ślepa), które mają służyć jako ślepa próba. Do oznaczania ilościowego (3) siły terminatora należy włączyć komórki zawierające nieoszlifowane pierwotne pGR lub zawierające pGR-Blue zligowane sekwencją niezakończeniową (kontrola referencyjna dla oznaczania ilościowego). Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z układem czytnika płyt.
  4. Odpipetować 1 μl roztworu komórkowego z bulionów O/N do poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej.
  5. Uszczelnij płytki oddychającą pokrywą i potrząsaj przez 18-20 godzin w temperaturze 37 °C i 160 obr./min.
  6. Za pomocą czytnika płytek oznaczyć OD600, odczytując absorbancję przy 600 nm. Zmierz fluorescencję GFP w następujący sposób: wzbudzenie 395 i emisja 509. Zmierz fluorescencję RFP w następujący sposób: wzbudzenie 575 i emisja 605. Po 18-20 godzinach OD600 powinien wynosić około 0,5.
  7. Aby znormalizować zmienność wzrostu, użyj równania: figure-protocol-1 zarówno dla GFP, jak i RFP.
  8. Po normalizacji wyznacz względną siłę terminatora za pomocą równania figure-protocol-2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wytworzy komórki zawierające pGR-Blue z terminatorem ligowanym między GFP a RFP przy użyciu Golden Gate Assembly (Rysunek 2). Dodatnie kolonie zawierające podwiązaną wkładkę można wybrać na podstawie koloru. W świetle widzialnym dodatnie kolonie będą białe/żółte, a fałszywie dodatnie wytworzą niebieskie kolonie po 18-20 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C (ryc. 3).

Po wybraniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest odpowiednie zaprojektowanie oligonukleotydu przed złożeniem zamówienia. Oligonukleotydy muszą mieć odpowiednie lepkie końce dodane do końców 5' zarówno górnej, jak i dolnej nici, aby zapewnić możliwość włączenia GGA. Ponadto ważne jest, aby zmienić orientację terminatorów skierowanych w lewo (terminatorów, które zatrzymują transkrypcję na dolnej nici) na orientację terminatorów skierowanych w prawo (kończy transkrypcję na górnej nici), ponieważ wyrażenie GFP i RFP jest skierowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Malcomowi Campbellowi i Toddowi Eckdahlowi z programu Genome Consortium for Active Teaching (GCAT) oraz HHMI-Science Education Alliance - Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (SEA-PHAGES).

Ten projekt był wspierany przez granty z National Center for Research Resources (P20RR016460) i National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) z National Institutes of Health. Badania te były częściowo wspierane przez National Science Foundation w ramach grantu# IIA-1457888. Dodatkowo fundusze instytucjonalne (Ouachita Baptist University) zostały zapewnione za pośrednictwem J.D. Patterson Summer Research Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pGR-Niebieski plazmidAddgene68374
pGR-PlasmidAddgene46002
AeraSeal-(sterylne arkusze)Excel ScientificBS-25Tylko sterylne arkusze
10x bufor ligazy DNA T4NEB
BsaI-HFNEBR3535SEnzym inny niż HF będzie działał, ale jest mniej stabilny termicznie.
NEB Golden Gate Assembly Mix NEBE1600SCommerial Master Mix, o którym mowa w protokole.
Ligaza DNA T4NEBM0202S
Okrągła mikrowirówka pływającaNova Tech InternationalF18875-6401
Sól sodowa ampicylinySigma AldrichA9518
L-(+)-ArabinozaSigmaAldrich A-3256D-Arabinoza nie wywoła promotora pBAD
Luria Base (LB) - Broth, MillerSigma AldrichL1900
Luria Base (LB) - Agar, MillerSigma AldrichL2025
Tecan-Infinite M200 Czytnik płytekTecan
Mix & Go Competent Cells - Szczep JM109Zymo ResearchT3005Użyj zalecanego przez firmę protokołu transformacji
ApE: Oprogramowanie do edytora plazmidówhttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, klasa molekularnaPromegaH5121
Chlorek sodu (krystaliczny / biologiczny, certyfikowany)Fisher ChemicalS671
Komercjalna synteza oligonukleotydówZintegrowane technologie DNA (IDT)http://www.idtdna.com/site
Mikrotestowe płytki do hodowli tkanek - 96 dołków (sterylne)Falcon35-3072
Mycobacteriophage "Bernal13""Bank genówKJ510413
bez nukleazyIDT)IDT004
Sterylny, w kształcie litery L Hockey-Stick Cell LifeScience Products6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis SpectrometerThermo Scientific2000c
ARNold: narzędzie internetowe do przewidywania terminatorów transkrypcji niezależnych od Rho.
Zintegrowane technologie DNA (http://rna.igmors.u-psud.fr/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  3. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  4. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  5. Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
  6. Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
  7. Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
  8. Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
  9. Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
  10. Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
  11. Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
  12. Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
  13. Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Weryfikacja terminatoraKwantyfikacja si y terminatoraBioinformatyczna identyfikacja terminatoraHybrydyzacja oligonukleotyd wAnaliza stosunku fluorescencjiPrzesiew kolorystyczny koloniiPromotor indukowany arabinozNormalizacja GFP RFP

Powiązane artykuły