Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54068

⸱

26 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

W tym artykule

Podsumowanie

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Streszczenie

Demonstrujemy doskonałą metodę spektralno-przestrzennego obrazowania 2D stabilnych rodników reporterowych na częstotliwości 250 MHz za pomocą szybkiego skanowania rezonansu paramagnetycznego elektronów (RS-EPR), które mogą dostarczyć ilościowych informacji w warunkach in vivo na temat stężenia tlenu, pH, statusu redoks i stężenia cząsteczek sygnałowych (tj. OH•, NO•). Technika RS-EPR charakteryzuje się wyższą czułością, lepszą rozdzielczością przestrzenną (1 mm) i krótszym czasem akwizycji w porównaniu ze standardową techniką fali ciągłej (CW). Przetestowano różne konfiguracje fantomowe, z rozdzielczością przestrzenną od 1 do 6 mm i szerokością spektralną cząsteczek reporterowych w zakresie od 16 μT (160 mG) do 5 mT (50 G). Rezonator bimodalny z pętlą krzyżową rozdziela wzbudzenie i detekcję, redukując szum, podczas gdy efekt szybkiego skanowania pozwala na wprowadzenie większej mocy do systemu spinowego przed nasyceniem, zwiększając sygnał EPR. Prowadzi to do znacznie wyższego stosunku sygnału do szumu niż w konwencjonalnych eksperymentach z EPR CW.

Wprowadzenie

W porównaniu z innymi metodami obrazowania medycznego, obrazowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPRI) jest wyjątkowo zdolne do ilościowego obrazowania właściwości fizjologicznych, w tym pH1-3, pO24-7, temperatury8, perfuzji i żywotności tkanek9, mikrolepkości i łatwości dyfuzji małych cząsteczek10 oraz stresu oksydacyjnego11. Oszacowanie łatwości rozszczepienia dwusiarczku przez glutation (GSH) w tkankach i komórkach12,13 może informować o statusie redoks. Do obrazowania in vivo wybiera się EPR w zakresie częstotliwości od 250 MHz do 1 GHz, ponieważ częstotliwości te zapewniają wystarczającą głębokość penetracji tkanek (do kilku cm) do generowania obrazów dla małych zwierząt, u których intensywność nie jest zmniejszana przez efekty utraty dielektryka. Wyższe częstotliwości, takie jak 9,5 GHz14 (pasmo X) i 17 GHz (pasmo Ku)15,16 mogą być używane do obrazowania odpowiednio skóry i włosów lub pojedynczych komórek. Sukces EPRI na wszystkich częstotliwościach zależy od paramagnetycznych sond spinowych, które są specyficzne dla tkanek, dzięki czemu można zobrazować ich lokalizację i los.

Jeśli środowisko sondy do spinu elektronów jest przestrzennie heterogeniczne, widmo EPR jest sumą wkładów ze wszystkich lokalizacji. Obrazowanie spektralno-przestrzenne dzieli objętość próbki na szereg małych segmentów przestrzennych i oblicza widmo EPR dla każdego z tych segmentów17. Pozwala to na mapowanie środowiska lokalnego poprzez pomiar zmienności przestrzennej w widmie EPR. Gradienty pola magnetycznego służą do kodowania informacji przestrzennych w widmach EPR, które nazywane są projekcjami. Obraz spektralno-przestrzenny jest rekonstruowany na podstawie tych rzutów18,19.

W RS-EPR pole magnetyczne jest skanowane przez rezonans w czasie, który jest krótki w stosunku do czasów relaksacji spinu elektronu (Rysunek 2)20,21. Dekonwolucja sygnału szybkiego skanowania daje widmo absorpcyjne, które jest równoważne pierwszej całki konwencjonalnego widma CW pierwszej pochodnej. Sygnał szybkiego skanowania jest wykrywany w kwadraturze, dzięki czemu mierzone są zarówno składowe absorpcyjne, jak i dyspersyjne odpowiedzi układu spinowego. Zasadniczo jest to zbieranie dwukrotnie większej ilości danych w jednostce czasu. Nasycenie sygnału w eksperymencie szybkiego skanowania zachodzi przy wyższych mocach niż w przypadku CW, więc wyższe moce mogą być używane bez obawy o nasycenie. 20,22 W porównaniu z CW można wykonać znacznie więcej średnich na jednostkę czasu. Wyższa moc, bezpośrednia detekcja kwadraturowa i więcej średnich na jednostkę czasu łączą się, aby zapewnić szybkiemu skanowaniu lepszy stosunek sygnału do szumu (SNR), szczególnie w przypadku projekcji o wysokim gradiencie, które definiują separację przestrzenną, prowadząc do wyższej jakości obrazów. Osiągnięcie mniej więcej takiego samego sygnału do szumu (SNR) dla obrazu fantomu wymagało około 10 razy dłuższego czasu dla CW niż dla szybkiego skanowania23.

Zwiększony SNR pozwala również na eksperymenty na częstotliwości 250 MHz z adduktami pułapek spinowych o niskim stężeniu, powstałych w wyniku reakcji OH z N-tlenkiem 5-tert-butoksykarbonylo-5-metylo-1-piroliny (BMPO-OH), które byłyby niewidoczne dla metody CW24. Dinitrooksydy połączone ze łącznikiem dwusiarczkowym są wrażliwe na rozszczepienie przez glutation, a więc mogą informować o stanie redoks w komórkach. Istnieje równowaga, zależna od stężenia obecnego glutationu, między formami dwu- i monorodnikowymi. Obserwacja tych zmian wymaga uchwycenia całego spektrum o szerokości 5 mT i może być osiągnięta znacznie szybciej dzięki szybkiemu skanowaniu EPR w porównaniu do stopniowania pola magnetycznego w eksperymencie CW.

Kompletny system szybkiego skanowania składa się z czterech części: spektrometru, głównego magnesu polowego, sterownika cewki szybkiego skanowania i rezonatora szybkiej pętli skanowania. Spektrometr i magnes pola głównego działają tak samo jak w eksperymencie CW, ustawiając główne pole Zeemana i zbierając dane z rezonatora. Sterownik cewki szybkiego skanowania generuje sinusoidalny prąd skanowania, który trafia do specjalnie zaprojektowanych cewek szybkiego skanowania w rezonatorze szybkiej pętli skanowania. Cewki szybkiego skanowania w rezonatorze z pętlą krzyżową szybkiego skanowania generują duże jednorodne pole magnetyczne, które jest omiatane przy częstotliwościach od 3 do 15 kHz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja sterownika cewki Rapid Scan przy 250 MHz

  1. Obliczanie warunków eksperymentalnych dla szybkiego skanowania
    Uwaga: Najważniejszym parametrem w RS-EPR jest szybkość skanowania, α, która jest iloczynem częstotliwości skanowania i szerokości skanowania (Równanie 3). W przypadku wąskich szerokości skanowania stosuje się szybsze szybkości skanowania, natomiast dla szerszych szerokości skanowania stosuje się wolniejsze szybkości skanowania. Poniższe instrukcje opisują ten drugi przypadek i pokazują, jak uzyskać eksperymentalne parametry sterownika cewki: szerokość skanowania 7 mT oraz częstotliwość skanowania 6,8 kHz.
    1. Wyznacz szerokość pasma (BW) rezonatoraRes).
      Wzór na obliczanie szerokości pasma z wykorzystaniem częstotliwości rezonansowej i dobroci. (1)
      gdzie vwynik częstotliwość robocza rezonatora i Q jest współczynnikiem dobroci. Wartość Q = 90 jest typowa dla rezonatora do szybkiego skanowania, użytego do uzyskania danych przedstawionych w Reprezentatywnych Wynikach.
    2. Wyznacz szybkość szybkiego skanowania, α, dopuszczalne przez szerokość pasma rezonatora Równanie parametru alfa; wynik spektroskopowy; wzór na obliczanie szerokości pasma i rozdzielczości. (2)
      Równanie pola magnetycznego: a=√3π(0,1 mT)(1,39 MHz)/5=150 T/s, obliczenia według wzoru, fizyka.

      gdzie N jest stałą często konserwatywnie przyjmowaną jako 5-6, ΔBpp szerokość linii pochodnej od szczytu do szczytu wyrażona w mT, a a Szybkość skanowania wynosi T/s dla szerokości linii Lorentza.
      Uwaga: Typowa wartość dla rodników w sekcji reprezentatywnej wynosi symbol Delta B_pp w równaniu fizycznym służącym do analizy przesunięć pola B. = 0,1 mT. W porównaniu z wcześniejszą literaturą dotyczącą szybkiego skanowania; Równanie 2 zostało wyprowadzone poprzez przyjęcie szerokości pasma sygnału (BWSygnał) równe BWRes.
    3. Wyznacz maksymalną dopuszczalną częstotliwość szybkiego skanowania określoną przez szybkość.
      Równanie ruchu obrotowego a=πwf, ilustrujące częstotliwość kątową w fizyce. (3)
      Równanie pola magnetycznego, 150 T/s=π(7 mT)f, ilustruje koncepcję elektromagnetyczną.
      gdzie W szerokość skanu oraz f jest częstotliwość skanowania. Szerokość przejścia wynosząca 7 mT pokryje 10% widma dla obecnie stosowanych sond. in vivoWartość tę oraz szybkość obliczoną w (równaniu 2) należy wykorzystać do wyznaczenia częstotliwości skanowania.
      Wzór na obliczenie częstotliwości, f=150T/s/(π(7mT))=6,8kHz, analiza elektromagnetyczna.
  2. Wybór kondensatorów strojeniowych i strojenie sterownika cewki do szybkiego skanowania
    Uwaga: Sterownik cewki szybkiego skanowania zazwyczaj pracuje w trybie rezonansowym, generując falę sinusoidalną. Rezonans występuje przy częstotliwości skanowania, przy której reaktancje indukcyjna i pojemnościowa mają taką samą wartość i przeciwne znaki, w związku z czym całkowita reaktancja jest bliska zeru.
    1. Wyznacz odpowiednią pojemność dla częstotliwości określonej w punkcie 1.1.3, korzystając z wartości indukcyjności, L, cewek szybkiego skanowania oraz (Równanie 4).
      Schemat równania wzoru na pojemność \( C_{TOT} = \frac{1}{L(2\pi f)^2} \), badanie elektroniczne.
      Wzór na równowagę statyczną, \(C_{TOT}=4.8 \, \text{mF}\), do analizy obwodów, inżynieria elektryczna.
    2. Podziel CTOT z (równania 4) przez połowę, aby uzyskać wartości kondensatorów dla każdej strony skrzynki kondensatorów sterownika cewki.
      Wzór na pojemność, \(C_1 = C_2 = \frac{C_{TOT}}{2}\), równanie w analizie obwodów elektrycznych.
      Obliczenia według wzoru na kondensatory równolegle, C1=C2=4,8mF/2=2,4mF, koncepcja obwodu elektrycznego.
      Uwaga: Sterownik cewki szybkiego skanowania posiada dwa wzmacniacze. Podczas wyboru kondensatora, skrzynka kondensatorów musi być zrównoważona poprzez zastosowanie takiej samej pojemności po każdej stronie skrzynki. Obie strony są połączone szeregowo.
    3. Odkręć górną pokrywę obudowy kondensatora i wstaw po obu stronach kondensatory o wartości odpowiadającej wartości wyznaczonej w kroku 1.2.2.
    4. Załóż pokrywę obudowy kondensatora i przykręć ją, aby zapewnić jej stabilne utrzymanie.
    5. Za pomocą panelu przedniego sterownika cewki rezonansowej należy dostroić częstotliwość wyjściową tak, aby przebieg sinusoidalny osiągnął maksymalną amplitudę.

2. Przygotowanie odczynników i fantomów

  1. Przygotowanie rodników
    1. Wyjmij 15N-PDT z zamrażarki i poczekaj, aż pojemnik osiągnie temperaturę pokojową (10-15 min).
    2. Odważ 1,4 mg 15N-PDT za pomocą wagi analitycznej.
    3. Dodaj 1,4 mg 15N-PDT do 15 ml dejonizowanej (DI) H2O, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 mM.
      Uwaga: Rodniki 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)metylu-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperydyloksylu (15N-PDT), 4-1H-3-karbamoylo-2,2,5,5-tetra(2H3)metylu-3-pirolinyloksylu (15N-mHCTPO) oraz 3-karboksy-2,2,5,5-tetra(2H3)metylu-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pirolidynyloksylu (15N-Proxyl)25 (Rysunek 1E-G) charakteryzują się długoterminową stabilnością (2 lata) w roztworze wodnym i w temperaturze pokojowej. Ich formy stałe są zazwyczaj przechowywane w zamrażarce lub lodówce, aby zachować stabilność rodników przez lata. Stabilność rodników nitroksylowych sprawia zazwyczaj, że są one nietoksyczne, a ich przygotowanie może odbywać się na zwykłym blacie laboratoryjnym, gdy rozpuszczalnikiem jest woda. W przypadku użycia rozpuszczalników organicznych, roztwory nitroksydów należy przygotowywać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI).
  2. Przygotowanie wrażliwych na pH rodników trytylowych
    1. Odważ 0,7 mg rodnika triarylo-metylowego (aTAM4)26 (1 40 g/mol) i rozpuść w 20 µl bezwodnego etanolu.
    2. Odważ 0,0681 g KH2PO4 (136,1 g/mol) i rozpuść w 50 ml wody DI, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM.
    3. Odważ 2,8 g KOH (56 g/mol) i rozpuść w 50 ml wody DI, aby uzyskać stężenie końcowe 1 M.
    4. Dodawaj KOH kroplami do buforu fosforanowego (2.2.2), aby dostosować pH do wartości 7,0.
    5. Dodaj 80 µl 1 mM buforu fosforanowego oraz 200 µl aTAM4 w bezwodnym etanolu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 mM w mieszaninie bufor:etanol w stosunku 80:20.
    6. Powtórz kroki 2.2.1–2.2.5, aby przygotować próbkę aTAM4 przy pH = 7,2.
    7. Umieść aTAM4 (pH=7,0) oraz aTAM4 (pH=7,2) w osobnych kwarcowych probówkach pomiarowych o średnicy 6 mm.
    8. Włóż obie kwarcowe probówki EPR o średnicy 6 mm do kwarcowej probówki EPR o średnicy 16 mm, oddzielając je przekładką ze styropianu o grubości 2 mm.
      Uwaga: Ścianki kwarcowej probówki pomiarowej mają grubość 0,5 mm, co wraz z przekładką 2 mm zapewnia 3 mm odstępu między próbkami aTAM. Wykorzystane wrażliwe na pH rodniki trytylowe zostały zsyntezowane na Uniwersytecie stanowym Ohio26. Przykład użyty do obrazowania to aTAM4. Reakcja odpowiedzialna za wrażliwość na pH jest przedstawiona na Rysunku 1A.
  3. Generowanie BMPO-OH
    1. Odważ 680 mg KH2PO4 i rozpuść w 10 ml wody DI, aby uzyskać stężenie końcowe 50 mM.
    2. Dodawaj 1 M KOH kroplami do buforu fosforanowego, aż osiągnięte zostanie pH=7,3.
    3. Odważ 50 mg BMPO (19,25 g/mol).
    4. Połącz 50 mg BMPO z 5 ml buforu fosforanowego w kwarcowej probówce do naświetlania o średnicy 16 mm.
    5. Dodaj 10 µl 30 mM nadtlenku wodoru.
    6. Naświetlaj mieszaninę w kwarcowej probówce do naświetlania o średnicy 16 mm lampą UV o średnim ciśnieniu i mocy 450 W przez 5 min.
    7. Za pomocą szklanej pipety transferowej przenieś 2,5 ml naświetlonego roztworu BMPO-OH z kwarcowej probówki do naświetlania do jednej z części kwarcowej probówki pomiarowej o średnicy 16 mm z dzielnikiem 3 mm.
    8. Przenieś pozostałe 2,5 ml naświetlonego BMPO-OH do drugiej części kwarcowej probówki pomiarowej o średnicy 16 mm z dzielnikiem 3 mm.
  4. Przygotowanie rodnika dinitroksydowego
    1. Odważ 24,7 mg 2H,15N-disiarczku dinitroksydu (Rysunek 1C) i rozpuść w 1 ml DMSO, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 47,5 mM.
    2. Przygotuj bufor Tris 10 mM i dostosuj pH do 7,2.
    3. Pobierz 40 µl roztworu zapasowego dinitroksydu i rozcieńcz buforem Tris do stężenia końcowego 1 mM.
    4. Umieść 250 µl roztworu dinitroksydu w buforze w kwarcowej probówce pomiarowej o średnicy 16 mm z dzielnikiem 10 mm w centrum.
    5. Odważ 154 mg glutationu i dodaj do 5 ml buforu Tris, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM.
    6. Dodaj 5 µl 10 mM roztworu glutationu do 250 µl 1 mM roztworu dinitroksydu po jednej stronie dzielnika 10 mm, aby przekształcić diradykał w monoradykał.
  5. Przygotowanie nitronyl nitroksydu
    1. Wyjmij rodnik z zamrażarki i poczekaj, aż pojemnik osiągnie temperaturę pokojową (10-15 min).
    2. Odważ 1,9 mg nitronylu (390 g/mol).
    3. Odważ 0,56 mg KOH i rozpuść w 10 ml wody DI, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM.
    4. Wymieszaj 1,9 mg nitronylu w 10 ml 1 mM roztworu KOH, aby uzyskać stężenie końcowe nitronylu 0,5 mM.
      Uwaga: W razie potrzeby użyj wortexera lub sonikatora, aby przyspieszyć solubilizację nitronylu.

3. Konfiguracja instrumentu Rapid Scan przy 250 MHz

Uwaga: Strojenie rezonatora przy użyciu wodnej próbki rodnika nitrylowego, która wywiera podobny wpływ na dobroć Q i strojenie rezonatora jak roztwór buforowy, jest dobrą metodą przygotowania do obrazowania właściwej próbki

  1. Strojenie rezonatora przy użyciu wodnego roztworu rodnika nitroksylowego.
    1. Wprowadź 15 ml próbki 0,5 mM 15N-PDT w wodzie do kwarcowej rurki EPR o średnicy 16 mm.
    2. Wsuń rurkę kwarcową do strony detekcyjnej rezonatora RS-EPR z pętlą krzyżową.
    3. Zmieniaj częstotliwość źródła urządzenia, aż zrówna się ona z częstotliwością strony detekcyjnej zawierającej próbkę. Ręcznie zmień częstotliwość nośną źródła 250 MHz, wpisując żądaną wartość w oprogramowaniu.
    4. Zmień częstotliwość strony wzbudzenia tak, aby dopasować ją do częstotliwości źródła eksperymentalnego i strony detekcyjnej rezonatora. Zmień częstotliwość strony wzbudzenia, obracając kondensatorem zmiennym wewnątrz wnęki rezonatora zgodnie z protokołem producenta.
  2. Konfiguracja konsoli instrumentu i magnesu głównego
    1. Włącz spektrometr i wybierz eksperyment rejestrujący dane przejściowe z czasem na osi odciętych.
    2. W oprogramowaniu ustaw liczbę punktów na 65 536 oraz bazę czasową na 10 nsec.
    3. Ustaw liczbę uśrednień na 10 0 dla sygnału silnego lub wąskiego oraz na 45 00 dla sygnału szerokiego lub słabego.
    4. Naciśnij przycisk „engage” w oprogramowaniu, aby przesłać parametry eksperymentalne z oprogramowania do konsoli i zasilić magnes pola głównego.
    5. Ustaw główne pole magnetyczne na 9 mT.
    6. Ustaw pokrętło tłumienia mocy na 50 dB i włącz wzmacniacz mocy 7 W.

4. Przeprowadzenie eksperymentu szybkiego skanowania

Uwaga: Szczegółowe instrukcje dotyczące analizy fantomów zawierających BMPO-OH24, pH-wrażliwe rodniki TAM19,27 oraz redox-wrażliwe dinitroksydy28 zostały przedstawione w literaturze.

  1. Nasycenie mocy standardowej próbki nitroksylu
    Uwaga: Zaleca się wykonanie krzywej nasycenia mocy na standardowej próbce rodnika nitroksylowego w tych samych warunkach eksperymentalnych, które zostaną zastosowane do badania rodników wrażliwych na pH lub stan redoks.
    1. Włącz sterownik cewki szybkiego skanowania, wprowadzając wartości z Sekcji 1 (częstotliwość skanowania 6,8 kHz i szerokość skanowania 7 mT).
    2. Zaczynając od 50 dB, zarejestruj widmo szybkiego skanowania z 10k uśrednieniami. Zmniejsz tłumienie o 3 dB i powtórz pomiar. Kontynuuj, aż do ustawienia tłumika 0 dB lub dopóki pomiar izolacji na odczycie mostka jest < 0.
    3. Przenieś surowe dane szybkiego skanowania do programu dekonwolucyjnego (np. napisanego w Matlab) i przetwórz surowe dane na widmo absorpcyjne.
    4. Wprowadź do programu częstotliwość skanowania, szerokość zakresu, liczbę punktów oraz bazę czasową, a następnie uruchom program, aby przetworzyć surowy sygnał szybkiego skanowania na sygnał absorpcyjny.
    5. Przedstaw amplitudę sygnału absorpcyjnego jako funkcję pierwiastka kwadratowego mocy (w Watach) padającej na rezonator. W reżimie nienasyceniowym amplituda zależy liniowo od pierwiastka kwadratowego mocy padającej.
    6. Dopasuj linię trendu rozpoczynającą się w punkcie 0,0 i uwzględnij wszystkie punkty danych mieszczące się w obszarze odpowiedzi liniowej. W obszarze odpowiedzi liniowej amplituda sygnału wzrasta proporcjonalnie do pierwiastka kwadratowego mocy mikrofalowej.
    7. Ekstrapoluj ten trend dla wyższych mocy i porównaj intensywność sygnału EPR. Użyj najwyższej mocy, przy której amplituda sygnału nie odbiega o więcej niż 3% od ekstrapolowanej linii trendu. Aby dekonwolucja sygnału szybkiego skanowania przebiegała prawidłowo, sygnał musi nadal znajdować się w obszarze odpowiedzi liniowej względem mocy padającej.
      Uwaga: Przenoszenie surowych danych szybkiego skanowania można przeprowadzić poprzez połączenie sieciowe lub za pomocą dysku USB. W tym przypadku transfer jest konieczny, ponieważ program do przetwarzania surowych danych (Matlab) nie znajduje się na tym samym komputerze, co oprogramowanie do zbierania danych. Algorytm dekonwolucyjny przetwarzający surowe dane opisany jest w 29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Produktem eksperymentu jest zestaw projekcji, które zostają zrekonstruowane w obrazy dwuwymiarowe (jeden spektralny, jeden przestrzenny) z zastosowaniem fałszywej skali kolorów reprezentującej amplitudę sygnału. Ciemnoniebieski oznacza poziom bazowy, w którym sygnał nie występuje, zielony oznacza niską amplitudę, a czerwony najwyższą. Przekroje wzdłuż osi x (wymiar spektralny) przedstawiają sygnał EPR (przejście EPR) na osi pola magnetycznego. Wzdłuż osi y (wymiar przestrzenny) odległość ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sygnały szybkiego skanowania mają wyższe składowe częstotliwości niż CW i wymagają większej szerokości pasma rezonatora w zależności od szerokości linii, czasów relaksacji i szybkości szybkich skanów. Szerokość pasma wymagana dla danego eksperymentu zależy od szerokości linii i szybkości skanowania pola magnetycznego (równanie 2). W zależności od czasów relaksacji badanej sondy (T2 i T2*) oraz szybkości skanowania, na krawędzi spływu sygnału mogą pojawić się oscylacje. W przypadku rodników nitroksyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Częściowe wsparcie tej pracy przez NIH przyznaje NIBIB EB002807 i CA177744 (GRE i SSE) oraz P41 EB002034 dla GRE, Howarda J. Halperna, PI i Uniwersytetu w Denver jest wdzięczne za uznanie. Mark Tseytlin był wspierany przez NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH/NIGMS U54GM104942. Autorzy są wdzięczni Walerijowi Chramcowowi, obecnie pracującemu na Uniwersytecie Wirginii Zachodniej, i Illirianowi Dhimitruce z Uniwersytetu Stanowego Ohio za syntezę wrażliwych na pH rodników TAM, a także Geraldowi Rosenowi i Josephowi Kao z Uniwersytetu Maryland za syntezę rodników mHCTPO, proxyl, BMPO i nitronylu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-okso-2,2,6,6-tetra(2H3)metylo-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperydynyloksyl (15N-PDT)Izotopy CDN M-232798% atomu 15N, 98% atomu D, Quebec Kanada
4-1H-3-karbamoilo-2,2,5,5-tetra(2H3)metylo-3-pirolinylooksyl (15N-mHCTPO)N/AN/Asyntetyzowany w U. Maryland i opisany w pozycji referencyjnej 29
3-karboksyl-2,2,5,5-tetra(2H3)metylo-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pirolidynyloksyl (15N-proxyl)N/A/Asyntetyzowany w U. Maryland i opisany w pozycji referencyjnej 25
4 mm kwarcowe rurki EPRWilmad Glass707- SQ-100M
4-okso-2,2,6,6-tetra(2H3)metylo-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT)Izotopy CDND-232898% atomu D, Quebec Kanada
Wrażliwy na pH rodnik trytylowy (aTAM4)Uniwersytet Stanowy OhioN/AZsyntetyzowany w stanie Ohio Uniwersytet i opisany w piśmiennictwie 26
Fosforan potasu, monozasadowyJ.T. Baker Chemicals1-3246
mm kwarcowe rurki EPRWilmad GlassQ-5M-6M-0-250/RB
8 mm kwarcowe rurki EPRWilmad GlassQ-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoksykarbonylo-5-metylo-1-pirolino-N-tlenek (BMPO)N/AN/AZsyntetyzowany w U. Maryland i opisany w Reference 30
Nadtlenek wodoruSigma AldrichH1009 SIGMA30%
16 mm Kwarcowa rurka EPRWilmad Glass16-7PP-11QTZ
Średniociśnieniowa lampa UV 450 WHanovia679-A36Fairfield, NJ
L-Glutation, zredukowanySigma AldrichG470-5
NitronylNAN/AZsyntetyzowany w U. Maryland i opisany w pozycji referencyjnej 31
Wodorotlenek sodu J.T. Baker Chemikalia1-3146
N 6

Bibliografia

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122(2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szybki skan EPRobrazowanie in vivostężenie tlenupomiar pHstan redokscząsteczki sygnałoweobrazowanie spektralno-przestrzennerezonator pętlowykrzywa nasycenia mocy
Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.