Artykuł metodologiczny

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

DOI:

10.3791/54077

⸱

2 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół ustanawiający mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowane z mazi stawowej i szpiku kostnego świnek miniaturowych i pobrane nieinwazyjnie za pomocą aspiracji strzykawki. Fenotypowanie komórkowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po izolacji komórek oraz hodowli in vitro szpiku kostnego i płynów maziowych pochodzących z MSCs.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały stworzone po izolacji z różnych źródeł tkanek, w tym szpiku kostnego i mazi stawowej. Ostatnio doniesiono, że MSCs pochodzące z płynu maziowego mają potencjał różnicowania wieloliniowego i cechy immunomodulacyjne, co wskazuje, że komórki te mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej i leczeniu ogólnoustrojowym. W pracy przedstawiono protokół prostej i nieinwazyjnej izolacji MSCs pochodzących ze szpiku kostnego i płynu maziowego świnek miniaturowych w celu analizy markerów powierzchniowych komórek do fenotypowania komórek i hodowli in vitro. Wykorzystując dojrzałe płciowo sześciomiesięczne świnki miniaturowe, szpik kostny pobrano z kości grzebienia biodrowego za pomocą ekstraktora szpiku kostnego, a płyn maziowy odessano ze stawu udowo-piszczelowego. Procedury pobierania próbek z obu źródeł były nieinwazyjne. Podano protokoły skutecznej izolacji MSCs od pobranych komórek oraz tworzenia warunków do hodowli in vitro w celu namnażania stabilnych MSCs od świnek miniaturowych oraz stosowania ogólnoustrojowych zabiegów autologicznych. W celu fenotypowania komórek markery powierzchniowe obu komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. W uzyskanych wynikach MSCs wyizolowano z płynu maziowego świnek miniaturowych i wykazano, że MSCs pochodzące z płynu maziowego mają podobną morfologię i fenotyp komórek do MSCs pochodzących ze szpiku kostnego. Dlatego nieinwazyjnie pozyskiwany płyn maziowy jest cennym źródłem MSCs.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) można podzielić na linie komórek mezenchymalnych, a MSC zostały założone i wyizolowane z różnych źródeł tkankowych, takich jak szpik kostny, pępowina, łożyska, tkanka tłuszczowa, skóra skórna, mięśnie szkieletowe, mieszki włosowe, błony maziowe i zęby1-5. Obecnie zwraca się uwagę na MSCs pochodzące z błony maziowej, ponieważ komórki te mogą pomóc w leczeniu chorób stawów, takich jak frakcja kości, choroba zwyrodnieniowa stawów i reumatoidalne zapalenie stawów (RZS), a ze względu na potencjał regeneracyjny MSCs w uszkodzonej chrząstce lub kości, mogą one również pomóc w leczeniu modulacji immunologicznej lub chorób autoimmunologicznych6-8. W większości badań nad MSCs pochodzącymi ze źródeł maziowych wykorzystywano MSCs z błony maziowej, a nie z płynu maziowego2,9; w związku z tym biologiczna wiedza na temat MSC pochodzących z płynu maziowego jest ograniczona.

Płyn maziowy jest łatwo dostępnym źródłem MSC, które mogą być odsysane podczas diagnozowania lub leczenia pacjentów oraz podczas diagnostycznych potwierdzeń różnych stanów zapalenia stawów, które nie wymagają inwazyjnych procedur, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów lub RZS. Populacja MSCs pochodzących z mazi stawowej w jamie maziowej jest znacznie zwiększona u pacjentów z zapaleniem stawów w porównaniu z pacjentami bez zapalenia stawów10-12. Dlatego płyn maziowy jest doskonałym kandydatem na źródło MSCs, szczególnie w terapii autologicznymi komórkami macierzystymi u pacjentów ze stanem zapalnym lub uszkodzonymi stawami. Ponadto MSCs pochodzące z płynu maziowego mają zdolność chondrogenną, zdolności immunomodulacyjne i wysokie tempo proliferacji. W badaniu tym ustanowiono protokoły ekstrakcji szpiku kostnego i aspiracji płynu maziowego od świnek miniaturowych przy użyciu metod nieinwazyjnych oraz ekspansji in vitro izolowanych komórek i analizy fenotypów komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Centrum Eksperymentów Biomedycznych na Uniwersytecie Narodowym w Gyeongsang.

1. Przygotowania do zabiegu na zwierzętach

  1. Przygotować dorosłe samice świnek miniaturowych do nieinwazyjnego pobierania MSCs ze szpiku kostnego i płynu maziowego. Przeprowadzić badanie kliniczne świnek miniaturowych na dzień przed znieczuleniem i pobraniem próbki.
    1. Zapewnić klinicznie normalne zwierzęta do badań fizykalnych, które obejmują temperaturę ciała, częstość oddechów i tętno, oraz do obserwacji zachowania świń i ich stanu hematologicznego, przy użyciu pełnych badań morfologii krwi.
      Uwaga: Przedziały parametrów dla klinicznie zdrowych świnek miniaturowych wynoszą 11 - 29 / min dla częstości oddechów, 68 - 98 / min dla tętna i 37 - 38 °C dla temperatury ciała.
  2. Usuń całą jadalną ściółkę z klatki podczas okresu postu przedoperacyjnego trwającego 6 - 12 godzin przed podaniem znieczulenia dla młodych i dorosłych świnek miniaturowych, należy przestrzegać 3 godzin postu u noworodków. Zapewnij wodę pitną do czasu znieczulenia.

2. Przygotowanie zwierząt do znieczulenia

  1. Przed podaniem znieczulenia świnki należy podać acepromazynę (0,1 mg/kg), medetomidynę (0,03 mg/kg) i atropinę (0,04 mg/kg).
    1. Wszystkie leki należy wstrzykiwać domięśniowo za pomocą igły 21 G o długości co najmniej 30 mm w przypadku dorosłych świnek miniaturowych. Wykonać wstrzyknięcie domięśniowe 1-3 cm za uchem w boczny mięsień szyjny lub w mięsień uda.
      Uwaga: Wykonuj wszystkie procedury bez wywoływania strachu lub stresu u zwierząt lub bez konieczności nieostrożnego obchodzenia się z premedykacją.
  2. Umieść miniświnki w pozycji grzbietowo-leżącej.
  3. Piętnaście minut po podaniu premedykacji należy rozpocząć znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu podawanego wziewnie.
    1. Kontynuować inhalację izofluranu (1,5%) przez rurkę dotchawiczą, a następnie zwiększyć stężenie do 2,5%, podając tlen (1,5 l/min) jako gaz nośny.
  4. Stale monitoruj tętno, temperaturę ciała i przezskórne nasycenie krwi tlenem (SpO2) miniświnek podczas znieczulenia. Używaj koca wodnego z cyrkulacją o temperaturze 38 - 39 °C, aby utrzymać temperaturę ciała. Zastosuj maść okulistyczną, aby chronić oczy przed wysuszeniem podczas znieczulenia.
  5. Postępuj zgodnie z klasyfikacją Guedela, aby ocenić głębokość znieczulenia13.

3. Przygotowania do izolacji i hodowli komórek

  1. Aby wyhodować MSCs pochodzące ze szpiku kostnego i mazi stawowej, należy przygotować 500 ml zaawansowanej zmodyfikowanej pożywki orlikowej (ADMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% Glutamaxu, 10 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 1,0% penicyliny-streptomycyny (odpowiednio 10 000 IU i 10 000 μg/ml, Pen-Strep).
    1. Inkubować ADMEM w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w inkubatorze CO2 .
  2. Przygotować 500 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (DPBS) firmy Dulbecco zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji i przemywania komórek.

4. Zbieranie szpiku kostnego od Minipigs

  1. Wybierz obszar o wymiarach około 15 x 15 cm na grzebieniu biodrowym (ryc. 1) i usuń włosy z tego obszaru za pomocą wysterylizowanych maszynek do golenia lub elektrycznych maszynek do strzyżenia. Po umieszczeniu miniświnki należy na przemian trzykrotnie wyszorować miejsce zabiegu następującymi środkami sterylizującymi: jodopowidonem i 70% etanolem. Po dokładnym wyschnięciu obszaru nałóż sterylne zasłony.
  2. Wstępnie pokryć strzykawkę o pojemności 10 ml 100 j./ml heparyny, spłukując ją 3-4 ml heparyny przed wyrzuceniem środka przeciwzakrzepowego.
    Uwaga: Wykonaj ten krok, aby uniknąć krzepnięcia w strzykawce podczas aspiracji szpiku kostnego.
  3. Pobrać co najmniej 5 ml szpiku kostnego z kości grzebienia biodrowego miniświni w znieczuleniu, używając ekstraktora szpiku kostnego (3,0 × 100 mm) ściśle przymocowanego do strzykawki o pojemności 10 ml pokrytej heparyną.

5. Izolacja komórek pobranych ze szpiku kostnego i hodowla in vitro

  1. Odizolować komórki od pobranego szpiku kostnego.
    1. Rozcieńczyć wyekstrahowany szpik kostny równą objętością DPBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
    2. Dodać 3 ml pożywki wirówkowej o dużej gęstości (Ficoll-Paque) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Rozcieńczyć 4 ml warstwę szpiku kostnego za pomocą DPBS, który umieszcza się na pożywce wirowej o gęstości bez mieszania, i odwirować ją w temperaturze 400 × g przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Pobrać warstwę komórek jednojądrzastych (MNC) z kożucha między dwiema warstwami zawierającymi osocze (górna warstwa) i pożywkę wirującą o gęstości (dolna warstwa) i przenieść MNC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Rozcieńczyć przeniesione MNC 7-8 ml DPBS i odwirować je w temperaturze 500 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki DPBS.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml ADMEM i przenieść go do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm. Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Hodowla in vitro komórek wyizolowanych ze szpiku kostnego.
    1. Po 48 godzinach odessać pożywkę z komórkami, które nie są połączone z naczyniem, zastąpić 2 ml ADMEM i inkubować w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co trzy dni.
    2. Przy zbiegu 70 - 80% umyj komórki DPBS, dysocjuj je 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut, aż komórki się oderwą.
    3. Zebrać komórki za pomocą 10 ml ADMEM, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    4. Pobrane komórki zawiesić w 1 ml świeżego ADMEM i policzyć je za pomocą hemocytometru.
    5. Umieścić komórki w kolbie o wymiarach 5 - 7,5 x 105/25T zawierającej 4 ml ADMEM i inkubować je w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co trzeci dzień.

6. Pobieranie płynu maziowego od świnek

  1. Podobnie jak w przypadku aspiracji szpiku kostnego, wybierz odpowiedni obszar o wymiarach około 15 x 10 cm (długość/szerokość) nad stawem udowym i usuń włosy za pomocą wysterylizowanych maszynek do golenia lub elektrycznych maszynek do strzyżenia, a następnie wykonaj procedury odkażania (krok 4.1).
  2. Wprowadzić strzykawkę o pojemności 3 ml z igłą 23 G do stawu po punktach orientacyjnych badania palpacyjnego (grzebień rzepki i piszczeli).
    1. Delikatnie przyssać strzykawki w celu aspiracji mazi stawowej w stawie. Przybliżona objętość mazi stawowej pobranej ze stawu wynosi 0,5 - 1 ml, ale różni się to w zależności od wielkości świnki lub stawu. Przepłukać przez DPBS w jamie maziowej, jeśli zebrana objętość płynu maziowego jest zbyt mała.
    2. Natychmiast wyjąć strzykawkę, aby uniknąć zanieczyszczenia krwią.

7. Izolacja komórek z pobranego płynu maziowego i hodowla in vitro

  1. Wyizoluj komórki z zasysanego płynu maziowego.
    1. Rozcieńczyć odessany płyn maziowy równą objętością DPBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
    2. Aby usunąć zanieczyszczenia, przefiltruj rozcieńczony płyn maziowy za pomocą sitka do komórek nylonowych o średnicy 40 μm.
    3. Dodać 10 ml DPBS do probówki zawierającej przefiltrowany płyn maziowy i odwirować go przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki DPBS.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml ADMEM, umieścić komórki na naczyniu do hodowli tkankowej 2 - 3 x 10 5 komórek/35 mm z 2 ml ADMEM i inkubować je w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .
  2. Powtórzyć krok 5.2 dla hodowli in vitro izolowanych MSC pochodzących z płynu maziowego.

8. Opieka pozabiegowa nad świnkami miniaturowymi

  1. W razie potrzeby zamknąć skórę w miejscu wstrzyknięcia śpiku kostnego pojedynczym szwem za pomocą zszywacza do skóry, po pobraniu szpiku kostnego.
  2. Po zakończeniu zabiegu należy podawać domięśniowe wstrzyknięcie enrofloksacyny (5 mg/kg) i meloksykamu (0,2 mg/kg) świnkom miniaturowym raz dziennie przez 3 dni.
  3. Po zakończeniu zabiegu należy raz dziennie przez 3 dni zdezynfekować miejsce pobrania szpiku kostnego i płynu maziowego 0,1% jodowidonu. Uważnie obserwuj codziennie, aby monitorować objawy powikłań (np. obrzęk, ropę lub zaczerwienienie).

9. Fenotypowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Gdy MSCs są w 70 - 80% zlewające się w pasażach 3 - 5, przemyj komórki DPBS i potraktuj je 1 ml 0,25% (v/v) Trypsyny/EDTA. Następnie inkubować je w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aż komórki zostaną odłączone.
  2. Zebrać komórki za pomocą 10 ml DPBS, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.
  3. Aby utrwalić komórki, zawiesić osad komórek w 10 ml 3,7% roztworu formaldehydu i utrzymywać go w temperaturze 4 °C przez jeden dzień przed analizą.
    1. Jednego dnia po utrwaleniu przemyć komórki DPBS dwukrotnie, odwirowując w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 4 ml DPBS, który jest uzupełniony 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować osad przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc.
    3. Rozprowadzić 500 μl podwielokrotności zawiesiny komórek do probówek o pojemności 1,5 ml.
    4. W przypadku przeciwciał niesprzężonych (CD29 i wimentyna) przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 3 minuty. Roztwór supernatantu należy wyrzucić.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczeniu 1:100 i inkubować go przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    6. Przemyć komórki dwukrotnie 1% albuminą surowicy bydlęcej przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.
    7. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) w stosunku 1:100 i inkubować go przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. W przypadku przeciwciał sprzężonych z FITC (izotyp, CD34, CD44 i CD45) przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 3 minuty. Roztwór supernatantu należy wyrzucić.
    1. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl przeciwciała sprzężonego z FITC w stosunku 1:100 i inkubować go przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.
    2. W przypadku obu warunków barwienia przemyć komórki dwukrotnie DPBS przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.
    3. Zawiesić komórki w 500 μl DPBS, przenieść je do 5 ml probówki okrągłodennej i przeanalizować wyniki za pomocą cytometru przepływowego8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustanowienie MSC pochodzących ze szpiku kostnego i płynu maziowego świń miniaturowych

MSC zostały pomyślnie wyizolowane ze szpiku kostnego i stawowych stawów maziowych świnek miniaturowych i namnażone in vitro (Rysunek 2). Aspiracja strzykawki płynu maziowego jest prosta i możliwe jest uzyskanie wystarczającej ilości komórek adherentnych podczas hodowli in vitro komórek pierwot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Świnie miniaturowe wykorzystano do wyizolowania MSCs ze szpiku kostnego i płynu maziowego. Aby wyeliminować różne stany fizjologiczne, takie jak wiek, płeć i choroba, wybrano świnie miniaturowe od dawców tła izogenicznego, aby dokładnie ocenić charakterystykę zależną od źródła komórek. Wiadomo, że świnie są anatomicznie, fizjologicznie i genetycznie podobne do ludzi, a w szczególności świnki miniaturowe mogą wytwarzać narządy o dopasowanej wielkości; W związku z tym mogą być stosowane jako zastępcze gatunki dawców do kse...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe udzielone przez Program Next-Generation BioGreen 21 (No. PJ007969), Administracji Rozwoju Obszarów Wiejskich oraz Narodowej Fundacji Badawczej (grant nr NRF-2015R1D1A1A01056639) Republiki Korei.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowany Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle (ADMEM)Gibco12491-023Pożywka hodowlana MSC
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Gibco14190-144Pożywka do przemywania komórek, wolna od Ca2+/Mg2+
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco16000-044Składnik pożywki MSCs
GlutamaxGibco35050-061Składnik pożywki MSCs
Penicylina/streptomycynaGibco10378-016Składnik pożywki MSCs
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)SimgaF0291Składnik pożywki MSCs
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA6003Składnik pożywki MSCs
Trypsyna-EDTAGibco25200-072Odczynnik do dysocjacji komórek 
β-merkaptoetanolSigmaM7522Składnik pożywki MSCs
Przeciwciało izotypoweBD PharmingenPrzeciwciało 550616Kontrola izotypu
Przeciwciało CD29Pharmingen Pharmingen552369Integryna beta-1 Marker MSCs
Przeciwciało CD44BD Pharmingen553133Marker powierzchniowej komórki Marker MSCs
Przeciwciało CD45BD Pharmingenhematopoetycznych komórek macierzystychChAD 340664
Przeciwciało CD34BD PharmingenBD 555821Marker hematopoetycznych komórek macierzystych
Przeciwciało CD90 PrzeciwciałoBD PharmingenBD 555595Marker Thy-1 glikoproteina błonowa Thy-1 Marker MHC
Przeciwciało klasy IISanta CruzSC-32247Marker komórek prezentujących antygen
Przeciwciało VimentinSigmaSigma-S6389Typ III pośredni filament MSCs marker
Fosfataza alkalicznaPromegaS3841Mieszanina 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanu (BCIP) i błękitu nitro tetrazolowego (NBT)
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Wirowanie w gradionym gradimencie gęstości
Sitko komórkoweBD Falcon35234040 µ m Nylonowe sitko do komórek
15 ml polistyrenowa rurka stożkowaBD Falcon351095Pobieranie próbek i izolacja komórek
Szalki 35 mmNunc153066Naczynie do hodowli komórkowych
Ekstraktor szpiku kostnegoGmbH Medizintechnologie, Niemcy1145-1W010TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Komora hematokrytowaMarinfeld640130Komora
AtropineJeil Pharmaceutical Co, KoreaHydrat siarczanu atropiny
AcepromazynaSamu Median, KoreaPrzedznieczulający lek uspokajający i przeciwwymiotny
MedetomidinePfizerLek znieczulający i przeciwbólowy
EnrofloksacynaBayer Healthcare, NiemcyAntybiotyki
Meloksykamnad medycyną weterynaryjną, ArgentynaLek przeciwzapalny i przeciwbólowy
Korea Pharma, KoreaŚrodek sterylizujący
EtanolSigmaE7023Środek sterylizujący
HeparynaSigmaH3393Środek przeciwzakrzepowy
FormaldehydSigmaF8775Środek utrwalający komórki
Maść okulistyczna PfizerOxytetracyklina HCl z siarczanem polimyksyny B
Cyrkulacyjny koc wodnyGaymar IndustriesSystem ocieplający w trakcie i po znieczuleniu
Zszywacz do skóryCovidien, USAZamknięcie skóry szwu
CO2 InkubatorThermo Forma3111Sprzęt do hodowli komórkowych
Cytometr przepływowyBD BiosciencesAnalizator komórek
MinipigPWG Genetics Korea, Ltd.Miniaturowa świniatypu T
Marker zliczania komórek Południowa Południowa Isoflurane Hana pharm, Korea Południowa Znieczulenie wziewne Jod powidonu  Południowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
  2. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  3. De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
  4. Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
  5. Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
  6. Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
  7. Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
  8. Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
  9. Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
  10. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  11. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
  12. Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
  13. John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
  14. Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
  15. Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
  16. Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
  17. Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
  18. Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
  19. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  20. Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
  21. Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mesenchymal Stem CellsSynovial Fluid MSCsBone Marrow MSCsMinipig MSC IsolationCell Surface MarkersFlow CytometryDensity CentrifugationIn Vitro CultureAutologous TherapyJoint Disease Models

Powiązane artykuły