Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Streszczenie

Regeneracja aksonów to chaotyczny proces, spowodowany głównie niezorganizowanym dopasowaniem aksonów. Dlatego, aby wystarczająca liczba zregenerowanych aksonów wypełniła miejsce uszkodzenia, wymagane jest odpowiednio zorganizowane wyrównanie aksonów. Ponieważ demienizacja po uszkodzeniu nerwu silnie upośledza zdolność przewodzenia aksonów, które przeżyły, remielinizacja ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego funkcjonowania zregenerowanych nerwów. Wcześniej wykazaliśmy, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) ustawiają się na anizotropowej powierzchni indukowanej przed rozciągnięciem, ponieważ komórki mogą wyczuwać większą efektywną sztywność w kierunku rozciągniętym niż w kierunku prostopadłym. Wykazaliśmy również, że powierzchnia anizotropowa powstająca z mechanicznej powierzchni wstępnie rozciągniętej w podobny sposób wpływa na wyrównanie, a także wzrost i mielinizację aksonów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania wstępnie rozciągniętej powierzchni anizotropowej, izolacji i hodowli neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) na wstępnie rozciągniętej powierzchni oraz pokazujemy zachowanie mielinizacyjne kokultury neuronów DRG z komórkami Schwanna (SC) na wstępnie rozciągniętej powierzchni.

Wprowadzenie

W uszkodzeniach nerwów, proksymalne i dystalne kikuty nerwowe są często uniemożliwione przed bezpośrednim wyrównaniem pęczków nerwowych ze względu na miejsce uszkodzenia ^1-2. Zwykle trakty aksonów składają się z wysoce uporządkowanych i wyrównanych wiązek aksonów, które tworzą złożone sieci połączeń. Jednak regeneracja nerwów jest procesem chaotycznym z powodu źle zorganizowanego ustawienia aksonów ^3-4. Dlatego, aby wygenerować wystarczającą liczbę regenerujących się aksonów, które wypełniają miejsce uszkodzenia, konieczne jest wywołanie dobrze zorganizowanego wyrównania aksonów. Dodatkowo demienizacja towarzyszy urazom nerwów spowodowanym obumarciem komórek mielinizujących w miejscu urazu. Ponieważ demienizacja silnie upośledza zdolność przewodzenia aksonów, które przeżyły, leczenie ukierunkowane na demielinizację lub promowanie remielinizacji jest istotne dla powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów ⁵. Tak więc celem tego protokołu jest zilustrowanie podejścia inżynieryjnego, które odnosi się do tych dwóch kwestii regeneracji nerwów.

Anizotropia powierzchniowa, która jest definiowana jako różnica, mierzona wzdłuż różnych osi, w fizycznych lub mechanicznych właściwościach materiału, została zastosowana do wpływania na wyrównanie, wzrost i migrację komórek, ^6-7. Oprócz topografii istnieją inne metody wywoływania anizotropii. Wcześniej badaliśmy anizotropię powierzchni indukowaną mechanicznym statycznym wstępnym rozciąganiem membrany polidimetylosiloksanowej (PDMS). Teoria "małej deformacji nałożonej na dużą" przewidywała, że efektywna sztywność, którą komórki wyczuwają w kierunku rozciągnięcia, różni się od kierunku prostopadłego, a ta różnica w efektywnej sztywności wynika z anizotropii ^{powierzchni 8}. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) hodowane na wstępnie rozciągniętej błonie PDMS są w stanie wyczuć anizotropię poprzez aktywne ciągnięcie powierzchni i w rezultacie wyrównać się w kierunku wstępnie rozciągniętym ⁹. Podobnie powierzchnia anizotropowa powstająca z mechanicznej wstępnie rozciągniętej powierzchni wpływa na wyrównanie, a także wzrost i mielinizację aksonów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) ¹⁰. W tym miejscu przedstawiamy protokół indukowania anizotropii powierzchni na statycznym, wstępnie rozciągniętym podłożu PDMS w celu poprawy regeneracji aksonów ¹⁰.

Aby wywołać wyrównanie aksonów, wykazano, że cechy topologiczne z pożądanymi wzorcami, które zapewniają prowadzenie kontaktu przez wyrównane włókna i kanały ^6,11-12, ułatwiają wyrównanie aksonów ^11,13. Jednak zgłoszone techniki indukowania wyrównania aksonów za pomocą cech topologicznych, takich jak włókna, kanały i wzory, nie były w stanie wydłużyć i zwiększyć grubości aksonów. W przeciwieństwie do tego, stopniowe rozciąganie mechaniczne prowadziło do wyrównania aksonów w kierunku rozciągania z dłuższymi i grubszymi aksonami, które zwiększały się wraz z wielkością rozciągnięcia ¹⁴. Jednak włączenie zasilanego urządzenia silnikowego in vivo nie jest możliwe. W przeciwieństwie do tego, statyczna anizotropia indukowana jest mniej skomplikowana i może być łatwiej włączona do przyszłych projektów rusztowań do zastosowań in vivo.

W tym protokole, statyczny system hodowli komórek wstępnie rozciągniętych jest używany do wywoływania anizotropii powierzchni bez cech topologicznych. System hodowli wstępnie rozciągniętej składa się z membrany PDMS, rozciągliwej ramy i etapu rozciągania, po czym membrana jest mocowana do ramy, a na etapie rozciągania nakładana jest z góry określona wielkość rozciągania. Świeżo wyizolowane neurony DRG hodowane na wstępnie rozciągniętej powierzchni przez okres do 21 dni są monitorowane pod kątem wyrównania i grubości aksonów. Następnie komórki Schwanna (SC) hodowane wspólnie z wyrównanymi aksonami są monitorowane pod kątem mielinizacji. Włączając anizotropię powierzchniową indukowaną przed rozciągnięciem, byliśmy w stanie zwiększyć wyrównanie-różnicowanie komórek i wzrost wyrównania aksonów odpowiednio neuronów MSC i DRG ^9-10.

Protokół

Wszystkie procedury izolacji komórek zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Michigan.

1. Przygotowanie wstępnie rozciągniętej powierzchni anizotropowej

1. Wymieszaj roztwór bazy i utwardzacza w stosunku 10:1 i wlej mieszaninę do naczynia do hodowli tkankowej (średnica 12 cm). Użyj 4,900 mg zasady i 490 mg utwardzacza dla całkowitej mieszaniny sieciującej.
2. Trzymaj mieszaninę żelu w próżni przez 20 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
3. Umieść mieszaninę żelu w piekarniku do utwardzania przez noc w temperaturze 60 °C.
4. Po utwardzeniu membrany PDMS należy pokryć powierzchnię plazmą tlenową za pomocą systemu czyszczenia/trawienia plazmowego przez 3 minuty przy przepływie 165 mTorr i 65 sccm przepływu_O2.
5. Wytnij kawałek prostokątnej membrany (5 × 3,5 cm) z naczynia, mając świadomość, która strona jest poddana działaniu tlenu, upewnij się, że strona poddana działaniu tlenu jest skierowana do góry i przymocuj do ramy rozciągającej. Umieść ramkę na stoliku rozciągającym i równomiernie rozciągnij, obracając pokrętło na stoliku, aż osiągnie 10% wydłużenia (lub inne z góry określone rozciągnięcie; wydłużenie można odczytać bezpośrednio z etapu rozciągania) na dłuższej osi ⁹. Napraw rozciągnięcie, dokręcając na ramie.
6. Usuń ramkę ze stołu montażowego. Upewnij się, że powierzchnia membrany jest sucha i wolna od kurzu, a następnie umieść silikonową komorę na membranie, pozwalając lepkiej stronie komory mocno przylegać do membrany.
   Uwaga: Silikonowa komora zapewnia dołek do zatrzymywania podłoża komórkowego na membranie PDMS. Konstrukcję urządzenia pokazano na rysunku 1.
7. Sterylizuj powierzchnię promieniami UV przez 10 min.
8. Dodać 1 ml poli-L-lizyny (PLL) (0,01% w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) do powierzchni PDMS w komorze, w ciągu 6 godzin od obróbki osoczem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przed wysiewem neuronów DRG. Zwiększa to przyczepianie komórek.

2. Izolacja DRG

1. Przygotuj standardową pożywkę wzrostową dla neuronów DRG.
2. Przed izolacją należy przelać w autoklawie sprzęt do izolacji i przefiltrować odczynniki. Dodać 5 ml buforu izolacyjnego do jednego dołka na płytce 6-dołkowej i umieścić płytkę na lodzie. Przygotować 10 ml pożywki dysocjacyjnej, dodając 1 ml kolagenazy A (500 U/ml) do 9 ml 0,05% trypsyny-EDTA (1 mg/ml), przefiltrować roztwory filtrem 0,22 μm i umieścić na lodzie.
3. Do izolacji użyj dziesięciu do dwunastu 5-7-dniowych szczurów Sprague-Dawley. Spryskaj szczenięta 75% izopropanolem i złóż w ofierze przez ścięcie.
4. Odetnij skórę pokrywającą rdzeń kręgowy od tyłu i usuń nadmiar tkanki wokół kręgosłupa. Pod lupą chirurgiczną z włączonymi chirurgicznymi światłami punktowymi wykonaj pierwsze nacięcie od szyi, a następnie jedno nacięcie wzdłuż kręgosłupa po obu stronach nożyczkami. Odłącz kręgosłup od ciała szczeniąt i usuń nadmiar mięśni. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż długiej osi kręgosłupa i użyj pęsety, aby całkowicie otworzyć kręgosłup i usunąć rdzeń kręgowy. Zdjąć końcówkę z pipety, aby utworzyć większy otwór do przenoszenia DRG z buforem izolacyjnym do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
5. Za pomocą cienkiej pęsety usuń ganglion z kieszonki kostnej i zbierz około 10 – 16 DRG z obu stron. Przyciąć korzenie nerwowe i przenieść zwoje nerwowe do lodowatego bufora izolacyjnego.
6. Zdjąć końcówkę z pipety, aby utworzyć większy otwór do przenoszenia DRG z buforem izolacyjnym do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Po dysocjacji chemicznej odwirować zwoje jaj w temperaturze 900 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
7. Pozwól tkankom osiąść na dnie probówki i delikatnie usuń bufor izolacyjny z góry i dodaj 10 ml pożywki dysocjacyjnej do probówki.
8. Wypreparowane tkanki inkubować w pożywce dysocjacyjnej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wstrząsając probówką co 5 - 10 minut.
9. Po dysocjacji chemicznej odwirować zwoje jaj w temperaturze 900 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml standardowej pożywki wzrostowej i odwirować.
11. Ponownie odwirować zdysocjowane komórki, jak wskazano w sekcji 2.9.
12. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 12 ml standardowej pożywki wzrostowej i odwirować.

3. Kultura DRG na wstępnie rozciągniętej powierzchni

1. Przed wysiewem komórek należy usunąć roztwory PLL z komory i spłukać powierzchnię PDMS sterylną wodą i wysuszyć na powietrzu.
2. Po ponownym zawieszeniu ogniw pozwól zawiesinie zastygnąć na 1 - 2 minuty, aby zanieczyszczenia opadły na dno rurki. Dodać 1,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej komory rozciągania i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
3. Aby wyeliminować komórki glejowe, po 1 dniu in vitro (DIV) dodać 10 μl (lub 15 μl) mieszaniny fluoro-2 deoksyurydyny i roztworu podstawowego urydyny (FDU-U) (patrz tabela materiałów) do każdego dołka. Po 7 godzinach zastąpić tę pożywkę świeżą standardową pożywką wzrostową i umieścić wstępnie rozciągnięte urządzenie do hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
4. W okresie hodowli komórkowej (2-3 tygodnie) zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką. Uwaga: Po hodowli na rozciągniętych i nierozciągniętych powierzchniach przez 2 tygodnie, oczyszczone SC dodaje się do komory i hoduje przez kolejny tydzień (krok 4.7).

4. Współhodowla komórek Schwanna (SC) z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej powierzchni

1. Izoluj SC zgodnie z opisem grupy dr Campana wcześniej ¹⁵.
   1. Krótko mówiąc, odizoluj SC od 1-dniowego szczeniaka. Zbierz i oddziel nerwy kulszowe zarówno chemicznie (Trypsyna-EDTA i Kolagenaza A), jak i mechanicznie (igła 18 G / strzykawka 10 ml) ¹⁵.
   2. Zasiać zdysocjowane komórki w kolbie T25 pokrytej poli-D-lizyną (PDL) i wyhodować w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ . W dniu 5 oczyść komórki poprzez selekcję przeciwciał przy użyciu przeciwciała Anti-thy 1.1 i dopełniacza królika i subkulturuj oczyszczone komórki do pasażu 2 - 4. Należy użyć pożywki zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (Penn/Strep), 21 μg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE) i 4 μM forskoliny.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z SC i dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ przez 2-3 minuty.
3. Sprawdzić komórki pod mikroskopem optycznym za pomocą obiektywu 10X, aby zobaczyć, czy podnoszą się z kolby, a następnie dodać 5 ml pożywki hodowlanej i wymieszać z komórkami w kolbie.
4. Dodać zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut.
5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 7 ml standardowej pożywki wzrostowej DRG.
6. Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml, wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego, a następnie policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopią optyczną przy użyciu obiektywu 10X. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 5 000 komórek na ml, dodając pożywkę wzrostową DRG.
7. Usunąć 0,5 ml pożywki z kultury DRG w rozciągniętej komorze i dodać 0,5 ml zawiesiny SC do kultury DRG.
8. Hodować komórki przez 1 tydzień w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą standardową pożywką do DRG. Po 1 tygodniu kohodowli przetworzyć komórki za pomocą immunohistochemii ¹⁰.

Wyniki

System hodowli komórek wstępnie rozciągniętych sprzyjał ułożeniu wąsko równoległym aksonów z gangliów korzeni grzbietowych ¹⁰. Neurony z gangliów korzeni grzbietowych hodowano na powierzchniach wstępnie rozciągniętych i nierozciągniętych przez 12 dni. Aksony wybarwiono za pomocą przeciwciała przeciwko β-III-tubulinie, aby zademonstrować ich uporządkowanie. Rycina 2 porównuje orientację aksonów na rozciągniętych i nierozciągniętych podłożach PDMS po 12 dniach ho...

Dyskusja

Aby wywołać wyrównanie aksonów na wstępnie rozciągniętej powierzchni, istnieją dwa krytyczne kroki: 1) membrana PDMS musi być płaska i mieć jednorodną grubość; oraz 2) komórki glejowe muszą zostać usunięte z DRG. Po wymieszaniu PDMS i środka sieciującego oraz utwardzeniu w piekarniku, usieciowany żel PDMS należy przechowywać na płaskim blacie i obchodzić się z nim ostrożnie, aby uniknąć przechylenia. Po obróbce plazmą tlenową membrany PDMS należy w ciągu 6 godzin nałożyć powłokę PLL, ponieważ hydrofilowość powierzchni (w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże neuropodstawowe 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Suplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Czynnik wzrostu nerwów-7S	Invitrogen	13290-010
Penicylina-streptomycyna	GibcoBRL	15140-122
0,05% Trypsyna-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poli-L-Lizyna	Trevigen	3438-100-01
Poli-D-Lizyna	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoksy-urydyna	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Bufor izolacyjny
typu I Kolagenaza	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Inaktywowany termicznie hyklon płodowej surowicy bydlęcej		SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Komora silikonowa	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
	March Instruments	PX-250
Przeciwciało Anti-Thy 1.1	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standardowe podłoże wzrostowe			Na 500 ml Neurobasal Medium 1x dodać 10 ml B-27 50x, 5 ml Glutamax-I 100x, 2,5 ml Penicyliny/Streptomycyny (Penn/Strep), 1 ml Albumax-I i 1 μ l z NGF-7S (50 μ g/ml).
FDU Roztwór			FDU 100 mg w 10 ml ddH2O (10 mg/ml), przefiltrować w kapturze i podzielić na 500 μ; l porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Urydyna 5 g w 166,7 ml ddH2O (33 mg/ml), przefiltrować w kapturze, podzielić na 200 μ; l porcje i przechowywać w temperaturze -20 ºC. Weź 61.5 μ l FDU (10 mg/ml) i 20,5 μ l urydyny (33 mg / ml) i dodać 4,918 μ l ddH2O do końcowego stężenia podstawowego, następnie podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

System do czyszczenia/trawienia plazmowego podstawowy urydyny