Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Regeneracja aksonów to chaotyczny proces, spowodowany głównie niezorganizowanym dopasowaniem aksonów. Dlatego, aby wystarczająca liczba zregenerowanych aksonów wypełniła miejsce uszkodzenia, wymagane jest odpowiednio zorganizowane wyrównanie aksonów. Ponieważ demienizacja po uszkodzeniu nerwu silnie upośledza zdolność przewodzenia aksonów, które przeżyły, remielinizacja ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego funkcjonowania zregenerowanych nerwów. Wcześniej wykazaliśmy, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) ustawiają się na anizotropowej powierzchni indukowanej przed rozciągnięciem, ponieważ komórki mogą wyczuwać większą efektywną sztywność w kierunku rozciągniętym niż w kierunku prostopadłym. Wykazaliśmy również, że powierzchnia anizotropowa powstająca z mechanicznej powierzchni wstępnie rozciągniętej w podobny sposób wpływa na wyrównanie, a także wzrost i mielinizację aksonów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania wstępnie rozciągniętej powierzchni anizotropowej, izolacji i hodowli neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) na wstępnie rozciągniętej powierzchni oraz pokazujemy zachowanie mielinizacyjne kokultury neuronów DRG z komórkami Schwanna (SC) na wstępnie rozciągniętej powierzchni.
Wprowadzenie
W uszkodzeniach nerwów, proksymalne i dystalne kikuty nerwowe są często uniemożliwione przed bezpośrednim wyrównaniem pęczków nerwowych ze względu na miejsce uszkodzenia 1-2. Zwykle trakty aksonów składają się z wysoce uporządkowanych i wyrównanych wiązek aksonów, które tworzą złożone sieci połączeń. Jednak regeneracja nerwów jest procesem chaotycznym z powodu źle zorganizowanego ustawienia aksonów 3-4. Dlatego, aby wygenerować wystarczającą liczbę regenerujących się aksonów, które wypełniają miejsce uszkodzenia, konieczne jest wywołanie dobrze zorganizowanego wyrównania aksonów. Dodatkowo demienizacja towarzyszy urazom nerwów spowodowanym obumar....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury izolacji komórek zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Michigan.
1. Przygotowanie wstępnie rozciągniętej powierzchni anizotropowej
- Wymieszaj roztwór bazy i utwardzacza w stosunku 10:1 i wlej mieszaninę do naczynia do hodowli tkankowej (średnica 12 cm). Użyj 4,900 mg zasady i 490 mg utwardzacza dla całkowitej mieszaniny sieciującej.
- Trzymaj mieszaninę żelu w próżni przez 20 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Umieść mieszaninę żelu w piekarniku do utwardzania przez noc w temperaturze 60 °C.
- Po utwardzeniu membrany PDMS nal....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
System hodowli komórek wstępnie rozciągniętych sprzyjał ułożeniu wąsko równoległym aksonów z gangliów korzeni grzbietowych 10. Neurony z gangliów korzeni grzbietowych hodowano na powierzchniach wstępnie rozciągniętych i nierozciągniętych przez 12 dni. Aksony wybarwiono za pomocą przeciwciała przeciwko β-III-tubulinie, aby zademonstrować ich uporządkowanie. Rycina 2 porównuje orientację aksonów na rozciągniętych i nierozciągniętych podłożach PDMS po 12 dniach ho.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby wywołać wyrównanie aksonów na wstępnie rozciągniętej powierzchni, istnieją dwa krytyczne kroki: 1) membrana PDMS musi być płaska i mieć jednorodną grubość; oraz 2) komórki glejowe muszą zostać usunięte z DRG. Po wymieszaniu PDMS i środka sieciującego oraz utwardzeniu w piekarniku, usieciowany żel PDMS należy przechowywać na płaskim blacie i obchodzić się z nim ostrożnie, aby uniknąć przechylenia. Po obróbce plazmą tlenową membrany PDMS należy w ciągu 6 godzin nałożyć powłokę PLL, ponieważ hydrofilowość powierzchni (w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Vasco za pomoc w przygotowaniu substratów PDMS, dr Shiyong Wang z laboratorium dr Mariny Maty na Uniwersytecie Michigan za pomocne sugestie i szkolenie dotyczące izolacji DRG, oraz dr Markowi Tuszynskiemu i dr W. Marie Campana z UC San Diego za pomocne sugestie i protokół izolacji SC. Badanie to było częściowo wspierane przez National Science Foundation (CBET 0941055 i CBET 1510895), National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 i R01EB014986).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podłoże neuropodstawowe 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Suplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Czynnik wzrostu nerwów-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicylina-streptomycyna | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0,05% Trypsyna-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poli-L-Lizyna | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poli-D-Lizyna | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoksy-urydyna | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Bufor izolacyjny |
| typu I Kolagenaza | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Inaktywowany termicznie hyklon płodowej surowicy bydlęcej | SH30080.03 | ||
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Komora silikonowa | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| March Instruments | PX-250 | ||
| Przeciwciało Anti-Thy 1.1 | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standardowe podłoże wzrostowe | Na 500 ml Neurobasal Medium 1x dodać 10 ml B-27 50x, 5 ml Glutamax-I 100x, 2,5 ml Penicyliny/Streptomycyny (Penn/Strep), 1 ml Albumax-I i 1 μ l z NGF-7S (50 μ g/ml). | ||
| FDU Roztwór | FDU 100 mg w 10 ml ddH2O (10 mg/ml), przefiltrować w kapturze i podzielić na 500 μ; l porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Urydyna 5 g w 166,7 ml ddH2O (33 mg/ml), przefiltrować w kapturze, podzielić na 200 μ; l porcje i przechowywać w temperaturze -20 ºC. Weź 61.5 μ l FDU (10 mg/ml) i 20,5 μ l urydyny (33 mg / ml) i dodać 4,918 μ l ddH2O do końcowego stężenia podstawowego, następnie podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. |
Bibliografia
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
