Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54090

⸱

4 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Streszczenie

Sekwencjonowanie RNA (RNAseq) to wszechstronna metoda, która może być wykorzystana do wykrywania i charakteryzowania ekspresji genów, mutacji, fuzji genów i niekodujących RNA. Standardowy RNAseq wymaga od 30 do 100 milionów odczytów sekwencjonowania i może zawierać wiele produktów RNA, takich jak mRNA i niekodujące RNA. Pokazujemy, w jaki sposób ukierunkowane sekwencjonowanie (wychwytywanie) RNAseq (wychwytywanie) pozwala na ukierunkowane badanie wybranych produktów RNA przy użyciu sekwencera stacjonarnego. Przechwytywanie RNAseq może charakteryzować transkrypty bez adnotacji, o niskiej lub przejściowej ekspresji, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte przy użyciu tradycyjnych metod RNAseq. Tutaj opisujemy ekstrakcję RNA z linii komórkowych, zubożenie rybosomalnego RNA, syntezę cDNA, przygotowanie bibliotek kodów kreskowych, hybrydyzację i wychwytywanie docelowych transkryptów oraz sekwencjonowanie multipleksowe na sekwencerze stacjonarnym. Przedstawiamy również proces analizy obliczeniowej, który obejmuje ocenę kontroli jakości, dopasowanie, wykrywanie fuzji, kwantyfikację ekspresji genów i identyfikację wariantów pojedynczych nukleotydów. Test ten pozwala na ukierunkowane sekwencjonowanie transkryptów w celu scharakteryzowania ekspresji genów, fuzji genów i mutacji.

Wprowadzenie

Sekwencjonowanie całego transkryptomu lub RNA (RNAseq) to bezstronna metoda sekwencjonowania do oceny wszystkich produktów RNA. Celem celowanego RNAseq (Capture) jest ukierunkowana ocena wybranych transkryptów o zwiększonej czułości, zakresie dynamiki, zmniejszonym koszcie lub skali oraz zwiększonej przepustowości w porównaniu ze standardowym RNAseq. Podobnie jak w przypadku standardowego RNAseq, ukierunkowane podejścia wzbogacające mogą być stosowane do oceny ekspresji genów, wielu gatunków RNA, takich jak mRNA, mikroRNA (miRNA), lncRNA1, inne niekodujące RNA2, fuzje genów3 i mutacje4-6.

Capture obejmuje hybrydyzację komplementarnych oligonukleotydów w celu wzbogacenia bibliotek cDNA do sekwencjonowania. Uzasadnienie wychwytywania RNAseq jest podobne do podejść mikromacierzowych, w których komplementarne oligonukleotydy lub sondy są hybrydyzowane z próbkami, a następnie mierzone pod kątem względnej obfitości. W przypadku technologii mikromacierzy ekspresja opiera się na względnym sygnale mierzonym dla transkryptów wiążących się z tymi sondami. Mikromacierze są zatem ograniczone zasięgiem, potencjalnym szumem tła wynikającym z niespecyficznego wiązania i hybrydyzacją krzyżową sond. Co więcej, macierze mają ograniczony zakres dynamiki dla transkryptów o niskiej i wysokiej ekspresji w porównaniu z RNAseq1. Mikromacierze są szeroko stosowane ze względu na ich obniżony koszt i wysoką przepustowość w porównaniu z RNAseq.

Tutaj demonstrujemy metodę przechwytywania RNAseq, która oferuje pośrednie rozwiązanie między RNAseq a podejściem mikromacierzowym do oceny transkryptomu. RNAseq Capture ma średnią przepustowość, większy zakres dynamiki i czułość oraz jest skalowany w celu szybkiego zwrotu na sekwencerach stacjonarnych. RNAseq Capture wymaga również ograniczonych zasobów obliczeniowych w zakresie przestrzeni dyskowej i przetwarzania danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Ten protokół opisuje jednoczesne przetwarzanie i analizę czterech próbek. Metoda ta jest kompatybilna z RNA wyizolowanym z komórek, świeżo zamrożonej tkanki i tkanki zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE). Protokół ten rozpoczyna się od 50 - 1,000 ng (zalecane 250 ng) początkowego wejścia RNA dla każdej próbki.

1. Procedura zubożenia i fragmentacji RNA

  1. Zubożenie rRNA
    1. Usunąć elucję, grunt, mieszaninę fragmentów, mieszaninę usuwającą rRNA, bufor wiążący rRNA i bufor do resuspensji z -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor elucyjny, kulki do usuwania rRNA i kulki paramagnetyczne specyficzne dla RNA/cDNA z 4 °C i doprowadzić do temperatury pokojowej.
    2. Dodaj 0,25 μg RNA do probówki PCR. Rozcieńczyć całkowite RNA ultraczystą wodą wolną od nukleaz do całkowitej końcowej objętości 10 μl. Dodaj 5 μl buforu wiążącego rRNA do każdej probówki, a następnie dodaj 5 μl mieszanki do usuwania rRNA i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Umieścić probówki w termocyklerze z pokrywką wstępnie podgrzaną do 100 °C i zaprogramować termocykler na 68 °C na 5 minut, aby zdenaturować RNA.
    3. Po denaturacji RNA wyjmij probówki z termocyklera i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Energicznie odwiruj rurkę do usuwania rRNA, aby ponownie zawiesić kulki. Dodać 35 μl kulek usuwających rRNA do nowych probówek i przenieść reakcję denaturacji RNA (20 μl) do probówek zawierających kulki usuwające rRNA.
    4. Ustaw pipetę na 45 μl i pipetuj szybko w górę i w dół 20x, aby wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 1 min. Następnie umieść probówki w stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 1 minutę. Przenieść supernatant do nowo oznakowanych probówek PCR i ponownie umieścić te probówki w stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 1 minutę. Gwarantuje to, że żadne koraliki nie zostaną przeniesione. Przenieść supernatant do nowo oznakowanych probówek do PCR.
    5. Wiruj kulki paramagnetyczne specyficzne dla RNA/cDNA i dodaj 99 μl kulek do każdej probówki. Delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 10x, aby wymieszać. Jeśli zaczynasz od zdegradowanego RNA, dodaj 193 μl dobrze wymieszanych kulek paramagnetycznych specyficznych dla RNA/cDNA do każdej probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowane nad osadem.
    6. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu (EtOH). Trzymaj rurki na stojaku magnetycznym i uważaj, aby nie przeszkadzać koralikom. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 5 - 10 minut do wyschnięcia.
    7. Odwirować rozmrożony bufor elucyjny o temperaturze pokojowej o stężeniu 600 × g przez 5 sekund. Dodać 11 μl buforu elucyjnego do każdej probówki i delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść probówki na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut. Przenieś 8,5 μl supernatantu do nowo oznakowanych probówek PCR.
  2. Fragmentacja rRNA Zubożone RNA
    1. Do każdej probówki dodać 8,5 μl elucji, 8,5 μl prime'a i 8,5 μl mieszanki fragmentów. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 10x, aby wymieszać. Umieść probówki w termocyklerze z następującym programem: wstępnie podgrzana pokrywka do 100 °C, 94 °C przez 8 minut, następnie 4 °C przytrzymaj.
      UWAGA: Ten etap ma na celu wygenerowanie średniej wielkości płytki wynoszącej 155 pz. Jeśli średni rozmiar fragmentu próbki RNA jest mniejszy niż 200 pz, pomiń ten krok i przejdź do syntezy pierwszej nici cDNA.

2. Synteza cDNA

  1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA
    1. Wyjąć pierwszą nić mieszanki syntezy z temperatury -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej.
    2. Zaprogramuj termocykler z następującymi ustawieniami: opcja wstępnego podgrzewania pokrywy i ustaw na 100 °C, następnie 25 °C przez 10 minut, 42 °C przez 15 minut, 70 °C przez 15 minut i przytrzymaj w temperaturze 4 °C. Zapisz ten program jako "Syntetyzuj 1st. pasmo".
    3. Odwirować probówkę do syntezy rozmrożonej pierwszej nici o masie 600 × g przez 5 sek. Wymieszać 1 μl odwrotnej transkryptazy z 9 μl mieszanki do syntezy pierwszej nici.
    4. Dodaj 8 μl pierwszej nici syntezy i mieszanki odwrotnej transkryptazy do każdej probówki, delikatnie pipetuj w górę iw dół 6x, aby wymieszać. Wiruj probówki przez 4 sekundy za pomocą mini wirówki stołowej o stałej prędkości 6,0 x g, aby doprowadzić ciecz na dno. Umieść probówki w termocyklerze i wybierz Zsyntetyzuj 1. pasmo. Gdy termocykler osiągnie 4 °C, wyjmij rurki i natychmiast przystąp do syntezy drugiej nici cDNA.
  2. Zsyntetyzuj drugą nić cDNA
    1. Podgrzać termocykler do temperatury 16 °C z pokrywą podgrzaną do temperatury 30 °C. Rozmrozić drugą nić mieszanki wzorcowej i ponownie zawiesić bufor na lodzie. Wcześniej należy wyjąć butelkę z kulkami paramagnetycznymi z temperatury 4 °C i odstawić na co najmniej 30 minut, aby osiągnęły temperaturę pokojową.
    2. Dodać 5 μl buforu do reprodukcji do każdej probówki do PCR. Odwirować drugą nić mieszanki wzorcowej o masie 600 × g przez 5 sekund i dodać 20 μl do każdej probówki PCR. Umieścić probówki w nagrzanym termocyklerze w temperaturze 16 °C na 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji wyjmij z termocyklera i pozwól, aby probówki osiągnęły temperaturę pokojową.
    3. Wiruj kulki paramagnetyczne, aż będą dobrze rozproszone. Do każdej probówki dodać 90 μl dobrze wymieszanych kulek paramagnetycznych. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut.
    4. Usunąć i wyrzucić 135 μl supernatantu, a następnie pozostawić probówki na stojaku magnetycznym w celu przepłukania EtOH. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH do każdej probówki bez naruszania kulek, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Usunąć i wyrzucić cały supernatant z każdego z nich. Powtórz w sumie dla dwóch prań 80% EtOH.
    5. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 5 - 10 minut do wyschnięcia na stojaku magnetycznym. Odwirować rozmrożony bufor do sporządzania zawiesiny w temperaturze pokojowej o masie 600 × g przez 5 sekund. Wyjmij probówki PCR ze stojaka magnetycznego. Dodaj 17,5 μl buforu do reprodukcji do każdej probówki PCR i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 10x, aby dokładnie wymieszać. Inkubować probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Umieść probówki na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie przenieś 15 μl supernatantu (dwuniciowego cDNA) do 0,2 ml probówek paskowych PCR.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, ponieważ cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni.

3. Przygotowanie biblioteki

  1. Końce Adenylate 3'
    1. Usunąć mieszaninę ogonów A z temperatury -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Zaprogramuj termocykler z następującymi ustawieniami: wybierz opcję pokrywy podgrzewania wstępnego i ustaw na 100 °C, a następnie ustaw na 37 °C przez 30 minut, 70 °C na 5 minut i przytrzymaj w 4 °C. Zapisz ten program jako "ATAIL70".
    2. Do każdej probówki dodać 2,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny. Następnie dodaj 12,5 μl rozmrożonej mieszanki ogonkowej. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Umieść probówki w termocyklerze i wybierz ATAIL70. Gdy temperatura termocyklera osiągnie 4 °C, wyjmij probówki PCR z termocyklera i natychmiast przystąp do podwiązywania adapterów.
  2. Adaptery Ligate
    1. Wyjąć odpowiednie probówki z adapterem RNA, zatrzymać bufor do ligacji i bufor do reprodukcji w temperaturze -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Nie wyjmować probówki z mieszanką do podwiązywania od -20 °C, dopóki nie zostanie to zalecone w protokole. Wyjąć butelkę z kulkami paramagnetycznymi z 4 °C i odstawić na co najmniej 30 minut, aby osiągnąć temperaturę pokojową.
    2. Podgrzej termocykler do temperatury 30 °C i wybierz opcję pokrywy do podgrzewania wstępnego i ustaw ją na 100 °C. Odwiruj rozmrożone probówki z adapterem RNA o masie 600 × g przez 5 sekund. Bezpośrednio przed użyciem wyjmij probówkę z mieszanką do ligacji z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C.
    3. Dodać 2,5 μl buforu do sporządzania zawiesiny do każdej probówki z próbką. Dodać 2,5 μl mieszanki do podwiązywania. Natychmiast po użyciu umieścić probówkę z mieszanką do podwiązywania w temperaturze -20 °C. Dodać 2,5 μl wskaźnika adaptera rozmrożonego RNA do każdej probówki z próbką. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać.
    4. Wiruj probówki przez 4 sekundy za pomocą mini wirówki stołowej o stałej prędkości przy 6,0 x g. Umieść probówki w podgrzanym termocyklerze. Zamknąć pokrywę i inkubować w temperaturze 30 °C przez 10 minut.
    5. Wyjmij probówki z termocyklera i dodaj 5 μl buforu do podwiązania zatrzymującego do każdej probówki, aby dezaktywować ligację. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać.
    6. Powtórzyć płukanie zgodnie z opisem w ppkt 2.2.3 - 2.2.4, używając 42 μl zmieszanych kulek paramagnetycznych i odrzucając 79,5 μl supernatantu. Trzymając probówki na stojaku magnetycznym, pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut.
    7. Wyjmij probówki z paskami do PCR ze stojaka magnetycznego i dodaj 52,5 μl buforu do reprodukcji do każdej probówki. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść probówki na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny. Przenieść 50 μl supernatantu z każdej probówki do nowych probówek z paskami PCR o pojemności 0,2 ml. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
    8. Powtórzyć pranie zgodnie z opisem w ppkt 2.2.3 - 2.2.4, używając 50 μl zmieszanych kulek paramagnetycznych i odrzucając 95 μl supernatantu. Trzymając probówki na stojaku magnetycznym, pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut.
    9. Wyjmij probówki z paskami do PCR ze stojaka magnetycznego i dodaj 22,5 μl buforu do reprodukcji do każdej probówki. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać.
    10. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny. Przenieść 20 μl supernatantu z każdej probówki do nowej probówki z paskiem PCR o pojemności 0,2 ml. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, a cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni.

4. Wzmocnienie biblioteki

  1. Wzbogacić fragmenty DNA
    1. Wyjąć główną mieszankę PCR, koktajl startera PCR i bufor do reprodukcji z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Wyjąć butelkę z kulkami paramagnetycznymi z magazynu w temperaturze 4 °C i odstawić na co najmniej 30 minut, aby osiągnąć temperaturę pokojową.
    2. Zaprogramuj termocykler z następującymi ustawieniami: wybierz opcję pokrywy podgrzewania wstępnego i ustaw na 100 °C, następnie ustaw początkową denaturację na 98 °C na 30 sekund, 15 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 10 sekund, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 72 °C na 30 sekund, jeden ostatni cykl przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut i utrzymać w temperaturze 4 °C. Zapisz ten program jako "PCR".
    3. Odwirować rozmrożoną mieszankę wzorcową PCR i probówki ze starterami do PCR o masie 600 × g przez 5 sekund. Do każdej probówki z próbką dodać 5 μl rozmrożonych starterów do PCR. Dodać 25 μl rozmrożonej mieszanki wzorcowej PCR do każdej probówki z próbką. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać.
    4. Umieść zakryte probówki paskowe do PCR we wstępnie zaprogramowanym termocyklerze. Zamknij pokrywę i uruchom program PCR. Po zakończeniu PCR wyjmij probówki z termocyklera i trzymaj na lodzie.
    5. Powtórzyć pranie zgodnie z opisem w ppkt 2.2.3 - 2.2.4, używając 50 μl zmieszanych kulek paramagnetycznych i odrzucając 95 μl supernatantu. Trzymając probówki na stojaku magnetycznym, pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut.
    6. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj 32,5 μl buforu do reprodukcji do każdej probówki z próbką. Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść probówki PCR na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej na 5 minut lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny. Następnie przenieś 30 μl supernatantu do świeżych probówek PCR o pojemności 0,2 ml.
    7. Przeprowadzić kwantyfikację cDNA za pomocą fluorometru7 i określić jakość cDNA za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej8.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, a cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni. Uwaga: Ta biblioteka jest uważana za bibliotekę RNAseq.
      Kolejne kroki prowadzą do biblioteki przechwytywania.

5. Hybrydyzacja, przechwytywanie i sekwencjonowanie

  1. Hybrydyzacja multipleksowa
    1. Usuń niestandardowe uwodnione sondy, DNA Cot-1, uniwersalne oligonukleotydy blokujące i specyficzne dla adaptera oligonukleotydy blokujące z -20 °C i rozmrozić na lodzie.
    2. W probówce o niskim poziomie wiązania 1,5 ml połącz 500 ng DNA (125 ng na próbkę podczas multipleksowania 4 próbek), 5 μl DNA Cot-1 (1 μg/μl), 1ul uniwersalne oligonukleotydy blokujące, 0,5 μl P7 (6 nukleotydów) specyficznych dla adaptera oligonukleotydów blokujących (ilość ta może wymagać dostosowania w zależności od warunków multipleksu) i 0,5 μl P7 (8 nukleotydów) specyficznych dla adaptera oligonukleotydów blokujących (ilość ta może wymagać dostosowania w zależności od multipleksu warunki pracy).
    3. Umieścić probówkę z próbką w koncentratorze próżniowym z otwartą nasadką skierowaną w kierunku przeciwnym do kierunku obrotu. Suszyć zawartość w temperaturze 45 °C przez 20 minut lub do całkowitego odparowania cieczy.
    4. Ponownie zawiesić wysuszoną zawartość za pomocą 8,5 μl 2x buforu hybrydyzacyjnego, 3,4 μl składnika hybrydyzacyjnego A i 1,1 μl wody wolnej od nukleaz. Odczekać 10 minut do ponownego zawieszenia i wirować co 2,5 minuty. Przenieść ponownie zawieszony materiał do probówki PCR o pojemności 0,2 ml i inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut na termocyklerze.
    5. Wyjąć probówkę z próbką do hybrydyzacji z termocyklera i dodać 2 μl niestandardowych sond zawieszonych w stężeniu 1,5 pmol/μl. Alternatywnie dodać 4 μl niestandardowych sond zawieszonych w stężeniu 0,75 pmol/μl. Inkubować reakcję hybrydyzacji przez noc (16 - 24 godziny) w temperaturze 65 °C.
      UWAGA: Można używać sond zakupionych od różnych dostawców i należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Czas trwania etapu hybrydyzacji może się również różnić.
  2. Przygotowanie i wychwytywanie koralików
    1. Wyjmij butelkę z kulkami paramagnetycznymi sprzężonymi ze streptawidyną z 4 °C i równoważ w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozcieńczyć 10x do płukania (I, II, III i rygorystyczne) i 2,5x bufor do płukania kulek, aby uzyskać 1x roztwory robocze.
    2. Podaniec 140 μl 1x buforu do przemywania I do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Podgrzewać całą ilość 1x rygorystycznego bufora i podwielokrotność 1x buforu płuczącego I w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym przez co najmniej 2 godziny.
    3. Podać 100 μl kulek paramagnetycznych sprzężonych ze streptawidyną na uchwycenie do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieścić na magnesie i wyrzucić supernatant. Dodać 200 μl buforu do płukania kulek na 100 μl kulek i wirować przez 10 sekund. Umieścić na magnesie na 2 - 5 minut lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Gdy supernatant będzie czysty, wyrzuć go i powtórz jeszcze raz, w sumie dwa płukania.
    4. Po usunięciu buforu do płukania kulek dodać taką samą objętość buforu do płukania kulek jak początkowa objętość początkowa (tj. 100 μl na jeden wychwyt). Zawiesić ponownie i przenieść do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 2 - 5 minut lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Odrzucić supernatant.
    5. Mając zarówno próbkę hybrydyzacyjną, jak i kulki w termocyklerze w temperaturze 65 °C, przenieś mieszaninę hybrydyzacyjną do probówki z kulkami i pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 45 minut, wirować i odwirowywać próbkę przez 4 sekundy za pomocą miniwirówki stołowej o stałej prędkości (6,0 x g).
  3. Mycie koralików
    1. Wyjmij probówkę wychwytującą z termocyklera i dodaj 100 μl wstępnie podgrzanego 1x bufor do płukania I do probówki i wiruj przez 10 sekund w celu wymieszania. Przenieść mieszaninę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml o niskim stopniu wiązania. Umieść probówkę w magnetycznym stojaku separacyjnym i odczekaj 2 - 5 minut na separację lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Odrzucić supernatant.
    2. Dodaj 200 μl podgrzanego 1x rygorystycznego buforu do płukania i pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Umieść probówkę w stojaku do separacji magnetycznej i odczekaj 2-3 minuty na separację lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty. Odrzucić supernatant. Powtórz dokładne pranie jeszcze raz, w sumie dwa prania.
    3. Dodaj 200 μl o temperaturze pokojowej 1x bufor do płukania I i wiruj przez 2 minuty do wymieszania. Umieść probówkę w stojaku do separacji magnetycznej i odczekaj 2 - 5 minut na separację lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty. Odrzucić supernatant.
    4. Dodaj 200 μl o temperaturze pokojowej 1x bufor do płukania II i wiruj przez 1 minutę do mieszania. Umieść probówkę w stojaku do separacji magnetycznej i odczekaj 2 - 5 minut na separację lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty. Odrzucić supernatant.
    5. Dodaj 200 μl o temperaturze pokojowej 1x bufor do płukania III i wiruj przez 30 sekund do wymieszania. Umieść probówkę w stojaku do separacji magnetycznej, pozostawiając 2 - 5 minut na separację lub do momentu, gdy supernatant będzie czysty. Odrzucić supernatant.
    6. Wyjmij probówkę ze stojaka do separacji magnetycznej i dodaj 20 μl wody wolnej od nukleazy, aby ponownie zawiesić kulki. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.
  4. Amplifikacja PCR po przechwyceniu
    1. Usunąć kulki paramagnetyczne z 4 °C i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Wyjmij gorącą mieszankę PCR Ready Mix (2x) i PCR Primer Mix z -20 °C i rozmroź w temperaturze pokojowej, a następnie umieść na lodzie. Przygotuj bibliotekę amplifikacji Master Mix, łącząc 27,5 μl 2x hot start PCR Ready Mix z 2,75 μl PCR Primer 1 i 2,75 μl startera PCR 2 (te objętości są przeznaczone dla 1 biblioteki hybrydyzacji plus 10% nadmiaru).
    3. Ustaw reakcję w probówce do PCR, dodając 20 μl kulek plus przechwycone DNA z 30 μl biblioteki amplifikacji głównej mieszanki, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl. Prawidłowo zamknij probówkę i wiruj do mieszania. Wirować probówki przez 4 sekundy za pomocą mini wirówki stołowej o stałej prędkości 6,0 x g.
      1. Ustaw następujący program PCR: wybierz opcję pokrywki do podgrzewania wstępnego i ustaw na 100 °C, następnie ustaw początkową denaturację na 98 °C przez 45 sekund, 10 - 12 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 65 °C przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 60 sekund, jeden ostatni cykl przedłużania w temperaturze 72 °C przez 60 sekund i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć próbkę z termocyklera i dodać 75 μl kulek paramagnetycznych. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    5. Umieść probówki na magnesie w temperaturze pokojowej na 2 - 3 minuty, a następnie usuń supernatant. Umyj koraliki na magnesie, dodając 200 μl 80% etanolu, inkubując przez 30 sekund, a następnie usuwając supernatant. Powtórz w sumie dwa 80% prania.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut, aby kulki wyschły. Nie przesuszać do pękania. Ponownie zawiesić kulki w 22 μl Tris-EDTA pH 8,0 (1x roztwór TE) i odczekać 3 minuty na elucję. Umieść próbkę na magnesie na 3 - 5 minut, a następnie przenieś 20 μl eluowanego produktu do świeżej probówki o niskim poziomie wiązania 1,5 ml, upewniając się, że nie przenoszono na nią żadnych kulek.
    7. Przeprowadzić kwantyfikację wychwyconego cDNA za pomocą fluorometru7 i określić jakość wychwyconego cDNA za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej 8.
  5. Procedura ładowania sekwencera pulpitu 9
    1. Rozcieńczyć przechwyconą bibliotekę cDNA do końcowego stężenia 4 nM przy użyciu 10 mM Tris-Cl pH 8,5 z 0,1% Tween 20. Rozmrozić 10 N NaOH i bufor hybrydyzacyjny na lodzie. Około 30 minut przed użyciem rozmrozić zestaw odczynników Desktop Sequencer v2 w wodzie RT. Nie wypełniaj powyżej LINII MAKSYMALNEGO WYPEŁNIENIA 10. Należy pamiętać, że jest to procedura specyficzna dla platformy sekwencjonowania i może się różnić w zależności od instrukcji producenta.
    2. Przygotować 1 ml 0,2 N NaOH, łącząc 20 μl 10 N NaOH z 980 μl wody wolnej od nukleaz w probówce do mikrowirówek (zawsze przygotowuj świeże). Rozcieńczyć bibliotekę PhiX (kontrolkę biblioteki) do 4 nM, łącząc 2 μl z 10 nM kontrolki bibliotecznej z 3 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,5 z 0,1% Tween 20.
    3. Denaturuj końcową bibliotekę i kontrolę biblioteki, łącząc 5 μl biblioteki 4 nM z 5 μl 0,2 N NaOH i krótko wirować w celu wymieszania. Wirować probówki przez 4 sekundy za pomocą mini wirówki stołowej o stałej prędkości 6,0 x g. Inkubuj w RT przez 5 minut, aby denaturować biblioteki.
    4. Dodać 990 μl wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego do probówek zawierających 10 μl zdenaturowanych bibliotek. Daje to bibliotekę o wartości 20 pM. Oznacz zdenaturowaną bibliotekę 20 pM datą i może być przechowywana do 3 tygodni w temperaturze -20 °C.
    5. Wymieszaj 375 μl kontrolki bibliotecznej 20 pM z 225 μl wstępnie schłodzonego bufora hybrydyzacyjnego i rozcieńczonej kontrolki bibliotecznej, aby uzyskać kontrolę biblioteki 12,5 pM. Odwróć kilka razy, aby wymieszać roztwór.
    6. Połącz 594 μl zdenaturowanej biblioteki końcowej z 6 μl 12,5 pM zdenaturowanej kontroli bibliotecznej i wiru, aby wymieszać. Odłóż połączoną bibliotekę próbek i kontrolkę biblioteki na lód, aż próbki będą gotowe do załadowania do wkładu z odczynnikiem do sekwencera biurkowego.

6. Analiza danych

  1. Ocena jakości sekwencji
    1. Oblicz jakość surowych danych sekwencji (pliki fastq) za pomocą oceny jakości sekwencji11.
      UWAGA: Ten krok pomaga ocenić dane przed ich dalszym poddaniem analizie. Oprogramowanie działa z wbudowanymi parametrami i generuje zestaw metryk dla każdego pliku fastq.
  2. wyrównanie
    1. Dostosuj odczyty sekwencji (pliki fastq) do referencyjnego ludzkiego genomu hg19 i transkryptomu za pomocą Tophat2 12 (wersja 2.0.10), dostarczając jednocześnie znane transkrypty jako plik GTF. Dane wyjściowe mają postać binarnego formatu wyrównania zwanego plikiem BAM.
    2. Wykonaj kroki przetwarzania końcowego, w tym sortowanie i indeksowanie, za pomocą Samtools13 (wersja 0.1.19) w pliku BAM. Wykonuj zduplikowane znakowanie, zmieniaj kolejność SAM, obliczaj rozmiar wkładki oraz dodawaj lub zastępuj grupy odczytu za pomocą Picard tools14 (wersja 1.84).
  3. Ocena jakości RNAseq
    1. Obliczanie serii wskaźników kontroli jakości dla danych RNAseq przy użyciu oceny jakości RNAseq. Dane wejściowe do tego oprogramowania to plik BAM 15 z wyrównania Tophat2. Wyjściem jest plik HTML, który zawiera między innymi całkowitą liczbę odczytów, duplikaty, zmapowany procent odczytu i procent rRNA itp.
  4. Wywoływanie wariantów
    1. Użyj STAR (wersja 2.4.0)16 do wyrównania, a następnie wywołaj warianty pojedynczego nukleotydu za pomocą GATK (wersja 3.3-0) HaplotypeCaller17. Postępuj zgodnie z krokami przetwarzania końcowego GATK BAM i kryteriami filtrowania, aby oflagować i usunąć wyniki fałszywie dodatnie z danych wyjściowych.
  5. ekspresja genu
    1. Oblicz ekspresję genów za pomocą oprogramowania Spinki do mankietów (wersja 2.1.1) z pakietu Tuxedo18.
      UWAGA: Dane wejściowe to plik BAM z narzędzia do wyrównywania Tophat2. Dane wyjściowe są wytwarzane na poziomie izoformy, genu i transkryptu, gdzie ekspresja jest obliczana jako FPKM (fragmenty na kilobazę na milion zmapowanych odczytów).
  6. Fuzja Wzywanie
    1. Wywołaj fuzje z każdej próbki za pomocą ChimeraScan19 (wersja 0.4.5), Tophat Fusion20 custom i TRUP21. Dodawanie adnotacji do fuzji dla domen przy użyciu programu Oncofuse22 (wersja 1.0.9b2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat przedstawiający kluczowe etapy metody RNAseq Capture pokazano na Rysunku 1. W celu zademonstrowania skuteczności techniki RNAseq Capture wykorzystano cztery linie komórek nowotworowych o znanych mutacjach (K562 z fuzją ABL1, LC2 z fuzją RET, EOL1 z fuzją PDGFRalpha oraz RT-4 z fuzją FGFR3). Cztery próbki połączono w pulę i poddano sekwencjonowaniu z odczytami 2x 100 bp na sekwenatorze desktopowym, co pozwoliło na wygenerowanie p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wychwytywanie RNAseq jest strategią pośrednią między podejściem RNAseq a mikromacierzowym do oceny wybranej części transkryptomu. Zalety Capture obejmują obniżone koszty, szybki czas realizacji sekwencera biurkowego, wysoką przepustowość i wykrywanie zmian w genomie. Metodę można dostosować do charakteryzowania niekodujących RNA23, wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów4-6, badania splicingu RNA oraz identyfikacji fuzji genów lub rearanżacji strukturalnych24. Ponadto podejście to m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

S.R. otrzymuje dofinansowanie od firm Novartis i Ariad Pharmaceuticals na prowadzenie badań klinicznych. Członkowie najbliższej rodziny S.R. są właścicielami akcji Johnson and Johnson.

Podziękowania

Specjalne podziękowania kierujemy do Ezry Lyona, Eliota Zhu, Michele Wing, Esko Kautto i Erica Samorodnitsky'ego za wsparcie techniczne. Chcielibyśmy również podziękować Jenny Badillo za jej wsparcie administracyjne dla naszego zespołu. Dziękujemy Centrum Superkomputerowemu Ohio (OSC) za udostępnienie przestrzeni dyskowej, mocy obliczeniowej i wsparcia w przeprowadzaniu naszych analiz. Dziękujemy Comprehensive Cancer Center (CCC) przy The Ohio State University Wexner Medical Center za wsparcie administracyjne tej pracy. S.R. i jego zespół są wspierani przez American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association i Pelotonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Thermomixer REppendorf21516-166
Wirówka 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
Biologia molekularna EtanolSigma AldrichE7023-6X500ML
Termoblok 24 x 1,5 mlEppendorf21516-166
Zestaw odczynników MiSeq v2 (300- cykle)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Desktop SequencerIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® Uniwersalny Oligo Blokujący - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® Uniwersalny Oligo Blokujący - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® Uniwersalny Oligo Blokujący - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - Koraliki oczyszczające PCR Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 StreptawidynaLife Technologies65305
COT Ludzkie DNA, klasa fluorometryczna, 1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® Probówki testowe Life TechnologiesQ32856
Zestaw do oznaczania kubitów® dsDNA HS LifeTechnologiesQ32851
SeqCap® Zestawy do hybrydyzacji i mycia EZ  (24 lub 96 reakcji)Roche NimbleGen 05634261001 lub 05634253001 
Fluorometr kubitowy® 2.0 Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x roztwór TE)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Woda wolna od nukleazLife TechnologiesAM9937
C1000 Dotyk&handel; Termocykler z 96– Well Fast Rection ModuleBiorad185-1196
SeqCap EZ Zestawy do hybrydyzacji i myciaRoche Applied Science05634253001
SuperScript II Odwrotna transkrypcja 200 U/μ lLife Technologies18064-014
D1000 Taśma ekranowaAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
Taśma ekranowa RNAAgilent Technol. Inc.5067-5576
Drabinka taśmowa RNAAgilent Technol. Inc.5067-5578
Bufor próbki RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5577
Wodorotlenek soduSigma72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptawidin T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 STRONA KAŻDALife Technologies12331D
ChloroformSigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
Spektrofotometr NanoDrop 2000Thermo Scientific
My Block Mini Dry BathBenchmarkBSH200
D1000 OdczynnikiAgilent Technol. Inc.5067- 5583
Odkurzacz PlusEppendorf022829861 

Bibliografia

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815(2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36(2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72(2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7(2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wychwytu RNAusuwanie rrn RNAwychwyt hybrydyzacyjnyPCR po wychwycieanaliza ekspresji gen wwykrywanie fuzjiwarianty pojedynczego nukleotydusekwenator stacjonarnywzbogacanie transkrypt w
Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.