Artykuł metodologiczny

Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku

DOI:

10.3791/54091

⸱

3 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. W rzeczywistości te zamrożone materiały mogą odzwierciedlać warunki panujące w długich okresach czasu, a badanie materiałów biologicznych ukrytych w ich wnętrzu może dostarczyć informacji o starożytnych środowiskach. Aby odpowiednio przeanalizować te ekosystemy i wydobyć istotne informacje biologiczne z zamarzniętych gleb i lodu, konieczne jest odpowiednie pobranie i przetworzenie zamrożonych próbek. Jest to szczególnie ważne w przypadku analiz mikrobiologicznych i DNA, ponieważ obecne społeczności mogą tak wyjątkowo różnić się od współczesnych. W tym miejscu przedstawiono protokół skutecznego zbierania i odkażania zamrożonych rdzeni. Zarówno brak kolonii użytych do domieszkowania zewnętrznej powierzchni, jak i egzogenne DNA sugerują, że udało nam się odkazić zamrożone rdzenie i że wykryte mikroorganizmy pochodziły z materiału, a nie z zanieczyszczenia powstałego podczas wiercenia lub przetwarzania rdzeni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriosfera (np. gleby wiecznej zmarzliny, struktury lodu, śnieg lodowcowy, firn i lód) daje wgląd w to, jakie typy organizmów przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Ponieważ substraty te mogą mieć od dziesiątek do setek tysięcy lat, ich zbiorowiska mikrobiologiczne, jeśli są zamrożone od czasu osadzania, odzwierciedlają dawne warunki środowiskowe. Aby odpowiednio przeanalizować te ekosystemy i wydobyć istotne informacje biologiczne z zamarzniętych gleb i lodu, konieczne jest odpowiednie pobranie i przetworzenie zamrożonych próbek. Ma to ogromne znaczenie, ponieważ prognozy klimatyczne na XXIwiek wskazują na możliwość znacznego ocieplenia w regionach arktycznych i subarktycznych1. W szczególności oczekuje się, że wnętrze Alaski i Grenlandii ociepli się odpowiednio o około 5 °C i 7 °C do 2100 roku2,3. Oczekuje się, że będzie to miało znaczący wpływ na glebowe i wodne zbiorowiska mikrobiologiczne, a tym samym na powiązane procesy biogeochemiczne. Oczekuje się, że wyższe temperatury i zmieniony reżim opadów zainicjują degradację wiecznej zmarzliny na wielu obszarach2-5, potencjalnie prowadząc do grubszej, sezonowo rozmarzanej (aktywnej) warstwy6,7, rozmrażania zamarzniętych gleb i topnienia masywnych ciał lodowych, takich jak lód gruntowy, kliny lodowe i lód segregacyjny8. To radykalnie zmieniłoby atrybuty biogeochemiczne, a także różnorodność biologiczną roślin i zwierząt w tych ekosystemach.

Lód lodowcowy oraz syngenetyczne osady i cechy lodu wiecznej zmarzliny uwięziły chemiczne i biologiczne dowody na istnienie środowiska reprezentującego to, co żyło tam w czasie, gdy powstawały te formacje. Na przykład w głębi Alaski zarówno w Illinoisan, jak i Wisconsin występuje wieczna zmarzlina, a ta wieczna zmarzlina w szczególności zapewnia unikalne lokalizacje datowane na okres od czasów współczesnych do 150 000 lat przed naszą erą (YBP), które zawierają biologiczne i geochemiczne dowody wpływu przeszłych zmian klimatycznych na różnorodność biologiczną. W rezultacie, osady te stanowią zapis biogeochemii i różnorodności biologicznej na przestrzeni wielu tysięcy lat. Ponieważ obszar ten ma niskie tempo sedymentacji i nigdy nie był zlodowacony, niezakłócone próbki są dostępne do pobierania i analizy, albo wiercąc pionowo w profilu glebowym, albo wiercąc poziomo w tunelach. Co ważniejsze, istnieją obszerne zapisy, które szczególnie podkreślają unikalne cechy biogeochemiczne wiecznej zmarzliny w tym regionie9-14. W szczególności zastosowanie analizy DNA do oszacowania obecności i zakresu różnorodności biologicznej zarówno w istniejących, jak i starożytnych próbkach lodu i wiecznej zmarzliny umożliwia zbadanie związku dawnych warunków środowiskowych i siedlisk z zamieszkiwaniem przez określone organizmy.

Poprzednie badania zidentyfikowały wpływ klimatu na ssaki, rośliny i mikroorganizmy na podstawie próbek datowanych na 50 tys. YBP11, 15-19, chociaż każde badanie używało innej metodologii do zbierania i odkażania wiecznej zmarzliny lub rdzeni lodowych. W niektórych przypadkach rdzenie wiertnicze zostały wysterylizowane16, 20-21, chociaż konkretna metodologia nie wyjaśniła, czy obce kwasy nukleinowe zostały również wyeliminowane z próbek. W innych badaniach do pomiaru skuteczności procedur odkażania wykorzystano izolaty bakteryjne15 (np. Serratia marcescens) oraz mikrosfery fluorescencyjne22

.

Ten eksperyment był częścią większego badania badającego społeczności mikroorganizmów z próbek wiecznej zmarzliny datowanych na około 40 tys. lat temu. Celem szczegółowym tej części badań było skuteczne odkażenie rdzeni lodowych i wiecznej zmarzliny. O ile nam wiadomo, żadna metodologia nie obejmowała stosowania roztworów zaprojektowanych w celu eliminacji obcych kwasów nukleinowych i związanych z nimi nukleaz z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni. Dzieje się tak pomimo faktu, że roztwory te są powszechnie stosowane do odkażania sprzętu laboratoryjnego do eksperymentów molekularnych.

Po odkażeniu rdzeni, genomowe DNA zostało wyekstrahowane za pomocą protokołów opracowanych przez Griffithsa i wsp.23 oraz Töwe i wsp.24, oznaczone ilościowo za pomocą spektrofotometru i rozcieńczone sterylną wodą wolną od DNA w celu uzyskania 20 ng na reakcję. Bakteryjne geny 16S rRNA amplifikowano starterami 331F i 797R oraz sondą BacTaq25 i archeonowymi genami rRNA 16S amplifikowano starterami Arch 349F i Arch 806R oraz sondą TM Arch 516F26 w następujących warunkach: 95 °C przez 600 sekund, a następnie 45 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 57 °C przez 60 s i 72 °C przez 25 s z końcowym przedłużeniem do 40 °C przez 30 s. Wszystkie reakcje qPCR przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Objętości reakcyjne 20 μl obejmowały 20 ng DNA, 10 μM starterów, 5 μM sondy i 10 μl mieszaniny reakcyjnej qPCR. Wzorce dla bakteryjnego i archeonowego qPCR opracowano przy użyciu genomowego DNA odpowiednio z Pseudomonas fluorescens i Halobacterium salinarum. Oba były uprawiane do fazy kłód. Przeprowadzono liczenie płytek i wyizolowano DNA z kultur. Genomowe DNA określono ilościowo za pomocą spektrofotometru przy założeniu jednej i sześciu kopii genu 16S rRNA na genom dla H. salinarum i P. fluorescens, odpowiednio27-28. Liczba kopii genów bakteryjnych i archeonów została obliczona na podstawie krzywej standardowej, przekształcona logarytmicznie w celu uwzględnienia nierównych różnic między leczeniem i oceniona za pomocą ANOVA.

Skład społeczności został określony poprzez sekwencjonowanie genu 16S rRNA przy użyciu komórek przepływowych i technologii amplifikacji mostków oraz analizę społeczności za pomocą "ilościowego wglądu w ekologię mikrobiologiczną" (QIIME)29. Odczyty do przodu i do tyłu zostały połączone ze sobą, a następnie sekwencje zostały przefiltrowane, zindeksowane, a przedstawiciele wysokiej jakości zostali wybrani do przypisania de novo operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) poprzez wyrównanie sekwencji z referencyjną bazą danych. Dopasowane sekwencje porównano z oddzielną referencyjną bazą danych w celu przypisania taksonomicznego. Stworzono tabelę OTU na poziomie gromady w celu określenia ogólnego składu społeczności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie ekwipunku i kolekcja rdzeni wiecznej zmarzliny

  1. Sprzęt do przygotowania i pobierania próbek w terenie oraz sprzęt do konserwacji
    1. Zamontuj ślimak do pobierania próbek, wkładając adapter napędowy do górnej części lufy i obracając dźwignię, aby zablokować go na miejscu. Przymocuj rurkę adaptera do adaptera napędu i przypnij silnik do rurki adaptera. Włóż noże do lufy.
    2. Nosić lekkie kombinezony, rękawice nitrylowe i maski, aby zmniejszyć zanieczyszczenie próbek. Nosić ochronniki słuchu i kask ochronny dla bezpieczeństwa po wejściu do tunelu wiecznej zmarzliny (rysunek 1).
    3. Wejdź do tunelu i wybierz miejsce, w którym chcesz pobrać próbki (Rysunek 1B).
      Uwaga: W przypadku wiercenia pionowego lub poziomego należy wybrać obszar, w którym znane są dowody na to, że materiał jest zamarznięty (np. lód lub wieczna zmarzlina), nie ma znanych dużych systemów korzeniowych i nie ma znanego żwiru. Usuń cały żywy materiał roślinny z obszaru przed pobraniem próbki. W przypadku wiercenia pionowego lub poziomego wybierz obszar, który jest stosunkowo płaski i dostępny za pomocą ślimaka.
    4. Przygotuj stanowisko pracy, nakładając warstwę na ziemię tworzywa sztucznego, które zostało wysterylizowane 70% izopropanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy.
    5. Umieść rurę z polichlorku winylu (PVC) o średnicy 10 cm przeciętą wzdłuż na stanowisku roboczym, aby zapewnić koryto do przytrzymania rdzeni podczas wyjmowania ze ślimaka. Odkadź rurę PVC za pomocą 70% izopropanolu, roztworu do dekontaminacji DNA i roztworu do odkażania RNazy.
    6. W pobliżu stanowiska roboczego odkaż ślimak, spryskując go 70% izopropanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy. Usuń roztwory ze ślimaka za pomocą ściereczki.
  2. Zbieranie i przechowywanie rdzeni lodu i wiecznej zmarzliny
    1. Wybierz obszar ściany do pobrania próbki (patrz 1.2.1 Uwaga).
    2. Odkaź zamarzniętą ścianę o średnicy około 10 cm, przecierając ją 70% izopropanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy.
    3. Podnieś odkażony świder do obszaru zainteresowania tak, aby był prostopadły do obszaru próbki i rozpocznij wiercenie w oczyszczonej powierzchni ściany (Rysunek 1C, D).
    4. Ostrożnie wyjmij ślimak z obszaru pobierania próbek. Odłącz ślimak od silnika i umieść ślimak nad sterylną rurą PVC w czystym stanowisku pracy. Ostrożnie przechyl ślimak tak, aby zamrożone rdzenie wysunęły się na sterylną rurkę PVC (rysunek 1E).
    5. Odkaż rękawice za pomocą 70% izopropanolu, roztworu do dekontaminacji DNA i roztworu do odkażania RNazy.
    6. Podnieś rdzenie lodu i wiecznej zmarzliny sterylnymi rękawiczkami i umieść je w sterylnych workach.
    7. Umieść rdzenie w chłodniejszym lub chłodniejszym pomieszczeniu do czasu ich wysyłki lub przetworzenia.
    8. Zamrożone rdzenie należy wysyłać za pomocą suchego lodu, aby utrzymać je w temperaturze poniżej 0 °C.
    9. Rdzenie należy natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przetwarzanie wiecznej zmarzliny i rdzeni lodowych

  1. Przygotowanie materiału
    1. Przygotuj sterylną, wolną od kwasów nukleinowych, wytrzymałą folię aluminiową, metalowe stojaki, szkło, metalowe kleszcze i watę szklaną, piecząc w piekarniku w temperaturze 450°C przez 4 godziny. Odłóż te materiały do czasu użycia.
    2. Wysterylizuj 95% etanolu i ultraczystą wodę, przepuszczając roztwory przez filtr 0,22 μm.
    3. Przechowywać roztwór etanolu w temperaturze -20 °C i wodę w temperaturze 4 °C.
    4. Wysterylizuj plastikową linijkę, spryskując ją 70% etanolem, roztworem do odkażania DNA i roztworem do odkażania RNazy i natychmiast wycierając po każdym roztworze.
  2. Przygotowanie kultur bakteryjnych
    1. Przygotuj bulion i talerze, aby wyhodować Serratia marcescens.
      1. W przypadku bulionu połącz 5 g tryptonu, 1 g glukozy, 5 g ekstraktu drożdżowego i 1 g dwuzasadowego fosforanu potasu, a następnie dodaj wodę destylowaną, aż osiągniesz 1 l. Aby zrobić talerze, dodaj 15 g agaru do powyższej mieszanki. W przypadku bulionu i talerzy należy dostosować pH do 7 i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
    2. Przygotować 1x roztwór soli fizjologicznej z fosforanami (PBS), łącząc 8 g chlorku sodu, 0,2 g chlorku potasu, 1,44 g dwuzasadowego fosforanu sodu i 0,24 g jednozasadowego fosforanu potasu i dodać wodę destylowaną, aż osiągnie 800 ml. Dostosować pH do 7,4 i dodać wodę destylowaną, aby osiągnąć 1 l. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min.
    3. Zaszczepić bulion sterylną pętlą, zanurzając go w kulturze S. marcescens, która wcześniej była przechowywana w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C. W warunkach aseptycznych należy seryjnie rozcieńczyć kulturę, dodając 1 ml kultury do 9 ml PBS i ręcznie odwrócić roztwór. Dodać 1 ml tego rozcieńczenia do 9 ml PBS i ręcznie odwrócić roztwór. Powtórz jeszcze osiem razy, aż do uzyskania rozcieńczenia 10-9.
    4. Rozprowadź roztwory 10-6, 10-7, 10-8 i 10-9 na płytkach agarowych, rozprowadzając 1 ml bulionu na płytce i rozprowadzając za pomocą rozsiewacza komórek. Zrobić to trzykrotnie na rozcieńczenie. Oryginalną kulturę przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Policz liczbę kolonii, aby obliczyć liczbę komórek w oryginalnej hodowli. Uwaga: Liczba kolonii w oryginalnej kulturze będzie zależeć od tempa wzrostu bakterii.
    6. Odpipetować 250 μl oryginalnej kultury do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozcieńczyć oryginalną hodowlę, dodając wystarczającą objętość 1x PBS, aby uzyskać około 109 komórek / ml, jak określono na podstawie liczby kolonii w poprzednim kroku. Granulować komórki w probówce do mikrowirówki, odwirowując przy 2 500 x g przez 10 min.
      Uwaga: Objętość 1x PBS będzie się różnić w zależności od tempa wzrostu bakterii.
    7. W sterylnym kapturze biologicznym odpipetować bulion i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia lub około dwóch miesięcy.
    8. W dniu przetwarzania rozcieńczyć kulturę S. marcescens z etapu 2.2.7, dodając 1 ml oryginalnej kultury S. marcescens do 39 ml 1x bufor PBS w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
  3. Przygotowanie chłodni do obróbki rdzeni i sprzętu konserwacyjnego
    1. Przed schłodzeniem chłodni wyczyść ściany, podłogi i metalowy stół 1% roztworem wybielacza.
    2. Ustawić temperaturę w chłodni na około -11 °C.
    3. Gdy komora chłodnicza osiągnie żądaną temperaturę, należy założyć lekkie kombinezony, rękawice nitrylowe i maski, aby zmniejszyć zanieczyszczenie komory chłodniczej i próbek.
      Uwaga: Do tej procedury potrzebne są dwie odpowiednio ubrane osoby.
    4. Sterylne materiały (np. folię aluminiową, metalowe stojaki, szkło, tacę, kulturę S. marcescens i ostrze mikrotomu) i próbki należy przynieść do chłodni i umieścić na sterylnym stole.
  4. Obróbka wiecznej zmarzliny i rdzeni lodowych w chłodni
    1. Umieść rdzeń wiecznej zmarzliny na sterylnym, wolnym od kwasów nukleinowych arkuszu folii aluminiowej.
    2. Lekko zaszczepić zewnętrzną stronę rdzenia rozcieńczoną kulturą S. marcescens za pomocą sterylnego korka piankowego (ryc. 2B).
    3. Umieść rdzeń na sterylnym metalowym stojaku, który znajduje się nad tacą.
    4. Wysterylizuj stalowe ostrze mikrotomu za pomocą 70% etanolu, roztworu do odkażania DNA i roztworu do odkażania RNazy.
    5. Miej czyste rękawice nitrylowe Individual A z 70% etanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy i trzymaj rdzeń pod kątem 45° nad tacą.
    6. Poproś osobę B o delikatne zeskrobanie około 5 mm zewnętrznej strony całego rdzenia, w tym końców, za pomocą sterylnego ostrza, podczas gdy osoba A obraca rdzeń po każdym zadrapaniu (rysunki 2C i 3A, B). W razie potrzeby przetrzyj ostrze 70% etanolem, roztworem do odkażania DNA i roztworem do odkażania RNazy.
    7. Niech osoba B ostrożnie i szybko wleje na rdzeń wysterylizowany przez filtr 95% etanolu, podczas gdy osoba A obraca rdzeń podczas nalewania roztworu (rysunki 2D, 3C).
    8. Osoba B powinna natychmiast przepłukać rdzeń wodą wysterylizowaną z filtrem.
    9. Wymień zużyty metalowy stojak na tacę na nowy sterylny metalowy stojak.
    10. Poproś osobę A o wyczyszczenie rękawic nitrylowych 70% etanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy i przytrzymaj rdzeń pod kątem 45° nad tacą.
    11. Niech Osoba B spryska cały rdzeń roztworem do dekontaminacji DNA.
    12. Osoba B powinna natychmiast przepłukać rdzeń wodą wysterylizowaną z filtrem.
    13. Niech Individual B spryska cały rdzeń roztworem do odkażania RNazy.
    14. Osoba B powinna natychmiast przepłukać rdzeń wodą wysterylizowaną z filtrem.
    15. Umieść rdzeń na sterylnym arkuszu folii aluminiowej i lekko zawiń.
  5. Rozmrożenie jądra zewnętrznego
    1. Umieść sterylny metalowy stojak na sterylnym szklanym naczyniu w sterylnym kapturze biologicznym z przepływem laminarnym.
    2. Umieść dwie płytki agarowe specyficzne dla S. marcescens w szklanym naczyniu poniżej sterylnego stojaka, aby zebrać płyn z rdzenia (ryc. 2E).
    3. Umieść rdzeń na sterylnym metalowym stojaku.
    4. Pozostawić około 2-5 mm zewnętrznej powierzchni rdzenia do rozmrożenia w temperaturze 23 °C (średnio nastąpi to w ciągu około 10 minut). Obracaj rdzeń o około 90° co 2 minuty.
    5. Wymaz z całej powierzchni rdzenia za pomocą sterylnych kleszczyków i sterylnej waty szklanej i zaszczepić dwie płytki agarowe specyficzne dla S. marcescens, pobierając te materiały na powierzchnię płytek. Zaszczepij dwie nowe płytki oryginalną kulturą używaną do domieszkowania zewnętrznej części rdzenia, która była wystawiona na działanie niskich temperatur w zimnym pomieszczeniu.
    6. Zmierz wymiary zewnętrzne rozmrożonego cylindrycznego rdzenia, umieszczając sterylną linijkę w pobliżu, ale nie dotykając rdzenia.
    7. Umieścić rdzeń w dużej sterylnej torbie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Sprawdzanie wzrostu
    1. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 23 °C przez jeden tydzień.
    2. Zbadaj płytki agarowe pod kątem wzrostu kolonii S. marcescens.
      1. Jeśli na płytce nie ma widocznych kolonii, przejdź do kroku 2.5.3.
      2. Jeśli kolonie pojawią się na płycie, powtórz czynności od kroku 2.1.1 w sekcji 2 "Przetwarzanie wiecznej zmarzliny i rdzeni lodowych".
    3. Pobrać rdzeń z zamrażarki i aseptycznie przenieść go do sterylnej torby.
    4. Przechowuj rdzeń w sterylnej torbie w temperaturze 4 °C przez około 24-48 godzin, aby rozmrozić cały rdzeń.

3. Uzyskanie podpróbki do ekstrakcji kwasów nukleinowych z rdzeni lodowych i wiecznej zmarzliny

  1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z rdzeni lodowych
    1. Wymieszaj rozmrożony materiał z rdzenia lodowego, delikatnie mieszając worek (Rysunek 2G).
    2. Rozmrożony materiał wlać do sterylnego pojemnika z filtrem 0,22 μm pod próżnią w celu zebrania mikroorganizmów.
    3. Aseptycznie wyjmij filtr za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść go w sterylnej probówce ceramicznej o pojemności 2 ml (1.4 mm).
    4. Przechowywać filtr w temperaturze -80 °C.
  2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z rdzeni wiecznej zmarzliny
    1. Wymieszaj rozmrożony materiał z rdzenia wiecznej zmarzliny, delikatnie ugniatając worek.
    2. Po dokładnym wymieszaniu wiecznej zmarzliny należy pobrać podpróbkę składającą się z około 0,5 g ziemi luzem za pomocą sterylnej czerpaki i umieścić ją w wytarowanej, sterylnej probówce z koralikami ceramicznymi o pojemności 2 ml (1,4 mm), która jest osadzona pionowo na wadze.
    3. Podpróbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Uzyskać grawimetryczną zawartość wody w próbkach.
      1. Odmierz 10 g wiecznej zmarzliny sterylną miarką i umieść na wadze w wytarowanej formie. Zmierz mokrą masę wiecznej zmarzliny i cyny.
      2. Inkubować wieczną zmarzlinę w piecu nastawionym na 105 °C przez 24 godziny. Zmierzyć suchą masę wiecznej zmarzliny i cyny.
      3. Oblicza się grawimetryczną zawartość wody, odejmując mokrą masę wiecznej zmarzliny przez suchą masę wiecznej zmarzliny i dzieląc przez suchą masę wiecznej zmarzliny.
    5. Wieczną zmarzlinę przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z wiecznej zmarzliny i rdzeni lodowych

  1. Przygotowanie materiału
    1. Przygotować bursztynowe fiolki do przechowywania roztworów, traktując 0,1% dietylowęglanem (DEPC), inkubując O/N w temperaturze 37 °C i sterylizując w autoklawie.
    2. Przygotować 240 mM roztwór buforowy fosforanu potasu. Dodaj 2. 5 g fosforanu potasu jednozasadowego i 38,7 g fosforanu potasu dwuzasadowego. Dostosuj końcową objętość do 500 ml, dodając sterylną wodę.
    3. Przygotować bufor ekstrakcyjny bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), rozpuszczając 4,1 g chlorku sodu w 80 ml wody i powoli dodając 10 g CTAB podczas ogrzewania i mieszania. Dostosuj końcową objętość do 100 ml, dodając sterylną wodę.
    4. Dodać równe objętości roztworu buforu fosforanowego i buforu CTAB i przefiltrować, wysterylizować filtrem 0,22 μm. Przykryj butelkę folią aluminiową i przechowuj w RT.
    5. Przygotować 1,6 M roztwór chlorku sodu (NaCl), łącząc 9,35 g NaCl i 100 ml sterylnej wody. Dodać 10 g glikolu polietylenowego 8000 do 1,6 M roztworu NaCl i wysterylizować filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych według zmodyfikowanej wersji Griffithsa i wsp.22 oraz Töwe i wsp.23
    1. Noś lekkie kombinezony, rękawice nitrylowe i maski. Oczyść przestrzeń laboratoryjną i pipety 70% etanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy.
    2. Wyjąć podpróbkę (filtr z rdzenia lodowego lub próbki gleby z wiecznej zmarzliny) z 2 ml ceramicznej rurki z nakrętką z koralikami ceramicznymi z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać 0,5 ml buforu ekstrakcyjnego bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB) i krótko odwirować.
    4. Dodać 0,5 ml alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego (25:24:1) (pH 8) i wstrząsać probówkami poziomo przez 10 minut za pomocą adaptera do płaskiego panelu na wirówce.
    5. Po ubiciu kulek odwirować probówki o masie 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć warstwę wodną do nowej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać z równą objętością alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1). Wirować przy 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Usunąć warstwę wodną do nowej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać dwie objętości 30% glikolu polietylenowego 8000 i 1,6 M NaCl. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    8. Wirować przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Przemyć osad kwasu nukleinowego około 500 μl lodowatego 70% etanolu i odwirować przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Suchy na powietrzu granulat w sterylnym okapie biologicznym przez 2 godziny. Zawiesić w 50 μl buforu TE wolnego od DNaz/RNaz (pH 8,0). DNA jest gotowe do dalszych zastosowań, takich jak PCR i qPCR.
    11. Określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
    12. Rozcieńczyć DNA sterylną, wolną od DNA wodą, aby osiągnąć 20 ng na reakcję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda może być wykorzystana do dekontaminacji zamrożonych próbek pobranych z różnych środowisk kriosfery, od lodu lodowcowego po wieloletnią zmarzlinę. W niniejszej pracy przedstawiamy dane zebrane konkretnie z próbek lodu i wieloletniej zmarzli przemysłowej, pobranych w tunelu wieloletniej zmarzli Engineering Research and Development Center - Cold Regions Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) znajdującym się w Fox, AK (Ryc. 1A oraz 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w dawnych warunkach środowiskowych. Chociaż odnalezione taksony mogą nie reprezentować całej społeczności historycznej, te odzyskane na podstawie analizy próbek lodu lodowcowego i wiecznej zmarzliny mogą dostarczyć cennych informacji historycznych dotyczących wybranych okresów15-16. Na przykład istotne informacje biologiczne uzyskano z badań lodu badających aktywność beztlenową w pokrywie lodowejGrenlandii 20 oraz z badań wiecznej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Zgoda na publikację tych informacji została udzielona przez Szefa Inżynierów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% IzopropanolWalmart551116880
95% Alkohol etylowy (denaturowany) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
roztwór do dekontaminacji DNA, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
Roztwór do dekontaminacji RNazy, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Lekkie kombinezonyKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Rękawice nitryloweFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Maskiantywirusowe Curad, WalgreensCUR3845
sterylne torby na próbki Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Stalowe ostrze mikrotomu B-Sharp Microknife, Wake Forest,
NC MetalRack Wyprodukowany w CRREL, Hanower, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Folia aluminiowaWestern Plastics, Temecula, CA
Butelka 500 ml z 0,22  μ m FilterCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Kaptur bezpieczeństwa biologicznegoNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Szalka PetriegoFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlukozaFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Ekstrakt drożdżowyFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Fosforan dipotasowyJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Iskry, MD214530
SpektrofotometrUV/VIS NanoDrop 2000Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
em>Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
em>Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Zestaw do izolacji DNA drobnoustrojówMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Ochrona słuchuElvexEP-201
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Wełna szklanaPyrex430330
Linijka
do ważenia cyny Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Chlorek soduSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Chlorek potasuJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Fosforan potasu, jednozasadowyJT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Fosforan potasu, dwuzasadowyJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodnyFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
50 ml Probówki wirówkoweCorning, Corning, NY4558
Probówki do mikrowirówek 2 mlMoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
Rurki z kulkami ceramicznymi o pojemności 2 ml (1,4  mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Heksadecylotrimetyloamonibromek (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
Glikol polietylenowy 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Alkohol fenolowo-chloroformowo-izoamylowy (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
WirówkaEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Alkohol chloroformowo-izoamylowy (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetyRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 i 1,000 &mikro; l pipety
Końcówki do pipetRainin, Woburn, MARainin LTS wstępnie sterylizowane, o niskiej retencji, końcówki filtrowane, 10, 20, 200, 1 000  &mikro; l
VortexorScientific Industries, Bohemia, NYG-560
Vortex AdaptorMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Przezroczysta butelkaCorning, Corning, NYC1395500
Bursztynowa butelkaCorning, Corning, NYC5135250
Filtry butelkowe, 0,22  &mikro; mCorning, Corning, Nowy Jork430513
60 ml StrzykawkaBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJFiltry
Millex, 0,22 μ mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70% etanoluFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500rozcieńczony i sterylizowany filtrem
Isotemp 100 L PiekarnikFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Rozsiewacz komórekFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Jednorazowe pętle do zaszczepianiaFisher Naukowy, Pittsburgh, PA22-363-602
<< Kimwipes strzykawkowe 309653

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
  2. Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
  3. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
  4. Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
  5. Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
  6. Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
  7. Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
  8. Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
  9. Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020(2006).
  10. Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603(2007).
  11. Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
  12. Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
  13. Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
  14. Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
  15. Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
  16. Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
  17. Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
  18. Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
  19. Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
  20. Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
  21. Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
  22. Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
  23. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  24. Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
  25. Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
  26. Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
  27. Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
  28. Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647(2012).
  29. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  30. Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
  31. Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
  32. Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
  33. Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
  34. Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042(2010).
  35. Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
  36. Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
  37. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  38. Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
  39. Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dekontaminacja zamro onego rdzeniaanaliza kriosferypobieranie pr bek z wieloletniej zmarzlinyprzetwarzanie rdzeni lodowychtechnika sterylnakontrola kontaminacji DNAdetekcja Serratia marcescensprotok dla ch odnianaliza spo eczno ci mikrobiologicznychsekwencjonowanie 16S rRNA

Powiązane artykuły