Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja chromosomów gigantycznej szczotki lampowej z żywych oocytów żab i salamander

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54103

⸱

5 grudnia 2016

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy proste techniki izolowania gigantycznych transkrypcyjnie aktywnych chromosomów lampbrush z żywych oocytów żab i salamander. Opisujemy, jak obserwować te chromosomy "na żywo" za pomocą kontrastu fazowego lub kontrastu interferencji różnicowej oraz jak naprawić je do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ lub barwienia immunofluorescencyjnego.

Streszczenie

Opisujemy metody badania gigantycznych transkrypcyjnie aktywnych chromosomów lampbrush (LBC) znajdujących się w oocycie, czyli niezłożonym jaju żab i salamander. Pojedyncze LBC mogą mieć do 1 mm długości i znajdują się w gigantycznym jądrze, które samo ma średnicę do 0,5 mm. Duży rozmiar chromosomów pozwala na niezrównane obserwacje aktywnych genów za pomocą lekkiej mikroskopii optycznej, ale jednocześnie wymagane są specjalne techniki izolowania jądra, usuwania otoczki jądrowej i rozprzestrzeniania chromosomów na szkiełku mikroskopowym. Jądro oocytu, zwane również pęcherzykiem rozrodczym (GV), jest izolowane w pożywce, która umożliwia częściowe żelowanie aktyny jądrowej i zachowuje delikatną strukturę LBC. Ten etap jest wykonywany ręcznie pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy jubilerskich. Następnie usuwa się otoczkę jądrową, ponownie ręcznie za pomocą kleszczy jubilerskich. Zawartość jądrowa jest szybko przenoszona do pożywki, która rozprasza żel aktynowy i pozwala nieuszkodzonym LBC osiąść na szkiełku mikroskopowym. W tym momencie LBC i inne organelle jądrowe można oglądać za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii kontrastu interferencyjnego, chociaż drobniejsze szczegóły są przesłonięte przez ruchy Browna. W przypadku obserwacji mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości lub analizy molekularnej cały preparat jest odwirowywany w celu mocnego przymocowania delikatnych LBC do szkiełka. Po krótkim utrwaleniu w paraformaldehydzie następuje barwienie immunofluorescencyjne lub hybrydyzacja in situ. LBC są w stanie aktywnym transkrypcyjnie, a ich ogromny rozmiar pozwala na analizę molekularną na poziomie poszczególnych genów przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub superrozdzielczej.

Wprowadzenie

Większość kręgowców, z wyjątkiem torbaczy i ssaków łożyskowych, produkuje duże jaja żółtkowe. Pomimo swoich czasami ogromnych rozmiarów, jaja te są pojedynczymi komórkami, które osiągają swój ostateczny wymiar jeszcze w jajniku samicy. Jaja jajnikowe nazywane są oocytami i każda z nich zazwyczaj zawiera pojedyncze gigantyczne jądro, znane od początkuXIX wieku jako pęcherzyk zarodkowy lub po prostu GV. 1 Oocyty pospolitych żab laboratoryjnych, Xenopus laevis i Xenopus tropicalis, osiągają maksymalną średnicę odpowiednio 1,2 mm i 0,8 mm (ryc. 1). GV z dojrzałych oocytów tych dwóch żab mają średnicę 0,3 - 0,4 mm (ryc. 2, 3). Salamandry mają zazwyczaj jeszcze większe oocyty i GV. W pełni dojrzałe oocyty meksykańskiego aksolotla Ambystoma mexicanum mają średnicę ponad 2 mm, a GV wynosi około 0,5 mm. Jądra te są więc łatwo widoczne gołym okiem i można nimi manipulować na wiele sposobów, co jest niemożliwe w przypadku jąder typowych komórek somatycznych.

Równie niezwykły jest gigantyczny rozmiar chromosomów w GV, fakt rozpoznany już pod koniecXIX wieku. Poszczególne chromosomy Ambystomy i innych salamander mogą mieć do 1 mm długości (ryc. 4, 5). Te z Xenopus są znacznie mniejsze, chociaż przy długości do 100 μm lub większej przyćmiewają typowe chromosomy somatyczne większości organizmów. Ważną cechą chromosomów oocytów jest ich niezwykła aktywność transkrypcyjna, która prowadzi do jednej z ich najbardziej charakterystycznych cech morfologicznych - setek sparowanych pętli bocznych (ryc. 5). Każda pętla składa się z jednej lub kilku jednostek transkrypcyjnych, które aktywnie syntetyzują RNA. Pętle nadają chromosomom oocytów rozmyty wygląd, co doprowadziło do nazwy chromosom "lampbrush" ze względu na ich powierzchowne podobieństwo do szczotek używanych we wcześniejszych czasach do czyszczenia kominów lamp naftowych. cyfra arabska

Tematem tego artykułu jest wykorzystanie izolowanych GV do badania LBC i organelli jądrowych (jąderka, ciała locus histonów i plamki). Zostaną opisane dwie dość różne techniki. W pierwszej, bardziej powszechnej technice, GV są izolowane w roztworze soli za pomocą kleszczy jubilerskich, krótko płukane w celu usunięcia przylegającego żółtka, a następnie usuwa się otoczkę jądrową, ponownie za pomocą kleszczy jubilerskich. Galaretowatą zawartość, zawierającą LBC i organelle jądrowe, pozostawia się do osadzenia na szklanym szkiełku mikroskopowym lub szkiełku nakrywkowym. Takie preparaty można badać bezpośrednio za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii DIC. Alternatywnie, preparaty można odwirować w celu przyłączenia LBC i organelli do szkiełka podstawowego lub szkiełka nakrywkowego. Takie preparaty można następnie przetworzyć do szczegółowej analizy molekularnej kwasów nukleinowych i białek, głównie za pomocą immunofluorescencji i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). 3-7

Druga technika polega na izolacji GV w oleju mineralnym. 8 Izolowane olejem GV pozostają aktywne transkrypcyjnie przez wiele godzin i są potencjalnie przydatne w badaniach, w których chce, aby zawartość jądrowa była jak najbardziej realistyczna. 9,10 Ponieważ współczynnik załamania światła jądrowego "soku" jest zbliżony do współczynnika LBC i innych organelli jądrowych (ryc. 3), techniki mikroskopowe mogą stanowić wyzwanie w przypadku izolowanych olejem GV.

Na koniec, ze względu na ich rozmiar i łatwość manipulacji, GV są idealnym materiałem do badań nad powłoką jądrową. Kompleks porów jądrowych został po raz pierwszy opisany na podstawie badań mikroskopem elektronowym na otoczkach GV11, a nowsze obserwacje nadrozdzielcze wykorzystały ten sam materiał. 12,13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ogólne informacje o żabach i salamandrach, a także źródła pochodzenia zwierząt, można znaleźć na następujących stronach internetowych: Xenbase (http://www.xenbase.org) i Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Protokół ten jest zgodny z wytycznymi Wydziału Embriologii Carnegie Institution for Science dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Rozwiązania

  1. Przygotować 10 l "żabiej wody": Dodać 10 ml 1 M CaCl2 i 10 ml 1 M NaHCO3 do 10 l dejonizowanego lub odchlorowanego H2O, mieszając.
  2. Zrób 1 l 20% paraformaldehydu: Zrób 1 l 4 mM Na2CO3. Do kaptura chemicznego dodać 200 g sproszkowanego paraformaldehydu i podgrzać do około 80 oC do rozpuszczenia. Ostudzić i przefiltrować przez bibułę filtracyjną. Uwaga: paraformaldehyd jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Alternatywnie kup komercyjny roztwór paraformaldehydu.
  3. Przygotuj 1 l roztworu znieczulającego dla: Dodaj 1,5 g metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu do 1 l wody żaby. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Zrobić 1 L pożywki hodowlanej oocytów OR214: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na2HPO4, 5 mM HEPES (z 500 mM zapasu, pH 8,3). Końcowe pH wyniesie około pH 7,8. Dodać 100 mg ampicyliny i 100 mg streptomycyny, aby zapobiec rozwojowi bakterii.
  5. Przygotować 1 l roztworu izolacyjnego GV: 83 mM KCl, 17 mM NaCl, 6,5 mM Na2HPO4, 3,5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT). Dostosuj do pH 7,0.
  6. Przygotować 100 ml roztworu dyspersyjnego GV: 20,7 mM KCl, 4,3 mM NaCl, 1,6 mM Na2HPO4, 0,9 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1% paraformaldehydu. Dostosuj do pH 7,0. Aby ułatwić szybsze rozproszenie żelu jądrowego, dodaj 10-50 μM CaCl2.
  7. Przygotuj 500 ml roztworu do subbingu. Pęcznieć 0,5 g handlowej żelatyny w 20 ml H2O przez 5 - 10 min. Dodać 500 ml wrzącegoH2Oi ostrożnie zamieszać, aby rozpuścić żelatynę. Ostudzić i dodać 50 mg CrK(SO4)2 ·12H2O. Filtrować z odsysaniem i przechowywać w temperaturze 4 oC.
  8. Przygotuj 10 ml pożywki montażowej. Rozpuścić 10 mg fenylenodiaminy w 5 ml PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, dostosowane do pH 9). Dodaj 5 ml glicerolu. Przechowywać w 250 μl porcji w temperaturze -80 oC.

2. Materiały

  1. W przypadku szkiełek z podkładem umieść szklane szkiełka mikroskopowe o wymiarach 3 cale x 1 cal w dostępnym w handlu roztworze detergentu i przetrzyj je, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Umieść w stojaku na szkiełka i dobrze spłucz w wodzie z kranu, a następnie w wodzie dejonizowanej. Zanurz szkiełka w roztworze do podgrzewania, odcedź pod kątem i piecz przez noc w temperaturze 60 oC.
  2. W przypadku kwadratów z tworzywa sztucznego wytnij kwadraty o średnicy 25 mm z arkusza poli(metakrylanu metylu) o grubości 1 mm. Wywierć okrągły otwór o średnicy 5 mm na środku każdego kwadratu. Przeszlifuj zarówno powierzchnie, jak i krawędzie kwadratu, a także obwód otworu.
    UWAGA: Jako alternatywę dla domowych plastikowych kwadratów i szkiełków studzienkowych, jak opisano w następnym akapicie, użyj komercyjnego kleju in situ PCR i komór hybrydyzacyjnych (25 μL). Prawdopodobnie można by również użyć izolatorów silikonowych wielokrotnego użytku do hodowli komórkowych, chociaż nie zostało to jeszcze dokładnie przetestowane.
  3. W przypadku szkiełek studzienkowych rozpuść 20 - 30 g wosku parafinowego (56 - 57 oC) w szklanej zlewce o pojemności 50 ml na płycie grzejnej. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl rozprowadź po jednej kropli parafiny o pojemności 5 μl z każdej strony środka szkiełka podstawowego. Wciśnij plastikowy kwadrat do parafiny i umieść szkiełko na płycie grzejnej. Parafina stopi się i powinna równomiernie rozprowadzić się pod plastikowym kwadratem.
    1. Zdejmij szkiełko z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć. Umieść podporę pod każdym końcem zjeżdżalni, tak aby prowadnica nie stykała się z blatem podczas procesu chłodzenia. Jeśli parafina ostygnie zbyt szybko, może oderwać się od centralnego otworu. Przygotuj 10 lub więcej szkiełek dołkowych: każde przygotowanie GV wykorzystuje nowy szkiełko studzienne.
  4. W przypadku nośników szkiełek do wirowania należy użyć specjalnie skonstruowanych nośników dla zastosowanego wirnika. Kilku producentów dostarcza wirówki z nośnikami na 96-dołkowe płytki z tworzywa sztucznego. Nośniki te można dość łatwo przystosować do przechowywania szkiełek mikroskopowych.

3. Izolacja oocytów

  1. Umieścić dorosłą samicę żaby (Xenopus laevis lub Xenopus tropicalis) lub salamandry (Ambystoma mexicanum) w roztworze znieczulającym wystarczającym do całkowitego pokrycia zwierzęcia. Kiedy zwierzę przestanie się poruszać, połóż je brzuchem do góry na łóżku z rozdrobnionego lodu w odpowiednim pojemniku.
  2. Nożyczkami chirurgicznymi wykonaj 2-3 cm nacięcie w dolnej części brzucha bocznie do linii środkowej. Delikatnie odsuń narządy wewnętrzne na bok, aby znaleźć jajnik po stronie nacięcia (są dwa jajniki, po jednym z każdej strony brzucha). Wytnij część jajnika z wystarczającą ilością oocytów do planowanych eksperymentów. Ponieważ w każdym jajniku znajdują się tysiące oocytów, zwykle wystarczy stosunkowo mały fragment jajnika (1 - 3 cm).
  3. Umieść jeden lub kilka kawałków jajnika w soli fizjologicznej OR2 na dużej szalce Petriego (100 mm) w temperaturze pokojowej. Oocyty mogą być przechowywane w dobrym stanie przez kilka dni, jeśli uszkodzone oocyty zostaną usunięte, a roztwór OR2 będzie codziennie zmieniany.
  4. Zszyj nacięcie jedwabiem chirurgicznym i włóż zwierzę z powrotem do indywidualnej szklanej miski w celu odzyskania zdrowia. Dodaj tylko tyle "żabiej wody", aby przykryć zwierzę do czasu odzyskania przytomności (około 15 min). Po tym, jak zwierzę wykaże dobrowolne ruchy, napełnij miskę wodą. Chociaż należy używać świeżej wody, bezpłodność nie jest konieczna, ponieważ prawie nigdy nie zarażają się po operacji. W razie potrzeby neomycynę można nałożyć na szwy. Rana zwykle całkowicie goi się po kilku dniach, a to samo zwierzę można ponownie wykorzystać po około 2 miesiącach.

4. Izolacja pęcherzyka zarodkowego (GV)

  1. Umieść porcję jajnika (10 - 20 dużych oocytów) na małej szalce Petriego (35 x 10 mm) zawierającej roztwór OR2.
  2. Usuń oocyt z jajnika za pomocą dwóch par kleszczy jubilerskich #5, aby rozerwać cienką łodygę tkanki łączącej oocyt ze ścianą jajnika. Umieść oocyt na innej małej szalce Petriego zawierającej pożywkę izolacyjną GV.
    UWAGA: Stan LBC zależy od wielkości (dojrzałości) oocytu. LBC osiągają maksymalną długość z wyraźnymi pętlami w oocytach, które są nieco mniejsze niż pełny rozmiar. Najbardziej dojrzałe oocyty często zawierają krótkie chromosomy ze skurczonymi pętlami.
  3. Wykonaj następujące czynności w małym powiększeniu mikroskopu preparacyjnego (średnica pola około 10 - 20 mm).
    1. Chwyć oocyt obiema parami kleszczy w pobliżu bieguna zwierzęcia (ciemna półkula) i zrób małe rozdarcie. Poszukaj w wytłaczanym żółtku przezroczystego jądra oocytu, zwanego również pęcherzykiem rozrodczym lub GV.
    2. Alternatywnie, przebij dużą dziurę w pobliżu słupa dla zwierząt za pomocą jednej pary kleszczy i delikatnie wyciśnij GV wraz z żółtkiem (ryc. 2).
    3. Delikatnie odtoczyć GV od większości żółtka. Zwykle niewielka ilość żółtka będzie ściśle przylegać do GV.

5. Usunięcie powłoki jądrowej

  1. W przypadku X. laevis i X. tropicalis przenieść GV z pożywki izolacyjnej na pożywkę rozsiewającą w ciągu 60 s od izolacji, nawet jeśli nadal jest trochę przylegającego żółtka.
    UWAGA: GV tych dwóch gatunków "twardnieją" w ciągu około 60 sekund, jeśli zostaną pozostawione w pożywce izolacyjnej i nie będą się rozprzestrzeniać w kolejnych etapach. Dlatego szybkość ma ogromne znaczenie podczas badania zawartości Xenopus GV.
    1. Chwyć kopertę jądrową w pobliżu górnej części GV jedną parą kleszczy jubilerskich, uważając, aby nie naciskać. Chwyć kopertę drugą parą kleszczy jak najbliżej pierwszej. Odciągnij dwie pary kleszczy od siebie, a zawartość GV "wyskoczy" z koperty, która ściśle przylega do jednego lub obu kleszczy.
    2. Zawartość GV należy pobrać za pomocą szklanej pipety lub regulowanej mikropipety o pojemności 20 μl. Jeśli używasz pipety regulowanej, ustaw pipetę na 10 μl i odetnij koniec plastikowej końcówki żyletką. Wciągnąć 5 μl płynu przed pobraniem GV w pozostałych 5 μl.
    3. Przenieść jeszcze zżelowaną zawartość jądrową na środek szkiełka studziennego uprzednio wypełnionego roztworem do rozprowadzania. Roztwór do rozprowadzania musi mieć wypukłą powierzchnię, tak aby pęcherzyk nie został uwięziony podczas dodawania szkiełka nakrywkowego.
    4. Dodaj szkiełko nakrywkowe (18 mm) i umieść szkiełko w wilgotnej komorze. Żel jądrowy będzie się powoli rozpraszał w ciągu następnych 10 - 60 minut, tak że chromosomy i organelle jądrowe zaczną leżeć na powierzchni szkiełka.
      UWAGA: GV salamander A. mexicanum i N. viridescens nie "twardnieją" nadmiernie w pożywce izolacyjnej. Dlatego można postępować z usuwaniem otoczki jądrowej wolniej niż z Xenopusem.
  2. Usunąć otoczkę jądrową z GV salamandry zgodnie z opisem w sekcji 5.1.1, ale zrobić to w pożywce izolacyjnej.
    1. Pobrać lekko zżelowaną zawartość GV za pomocą pipety i przenieść na szalkę Petriego zawierającą roztwór do rozprowadzania.
    2. Szybko wypłucz końcówkę pipety w roztworze do rozprowadzania, podnieś żel jądrowy i umieść go na środku szkiełka studziennego uprzednio wypełnionego roztworem do rozprowadzania. Dodaj szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm i umieść całe szkiełko w wilgotnej komorze. Sok jądrowy będzie się powoli rozpraszał w ciągu najbliższych 10 - 60 minut, a chromosomy i organelle jądrowe zaczną leżeć na powierzchni szkła.

6. Wstępna obserwacja LBC i organelli

  1. Oglądaj LBC i organelle jądrowe za pomocą kontrastu fazowego (konwencjonalny mikroskop pionowy) przy małym powiększeniu po rozproszeniu zawartości jądrowej w komorze rozsiewającej. Ponieważ komora ma głębokość około 1 mm, a zawartość jądrowa znajduje się na dnie, użyj obiektywu o małym powiększeniu i dużej odległości roboczej (5X - 10X).
    UWAGA: Głównym powodem zbadania preparatu w tym momencie jest ustalenie, czy warto przeprowadzić przez kolejne kroki. W dobrym przygotowaniu chromosomy są nieuszkodzone i osiadły na dnie komory. Przejdź do etapu wirowania w ciągu godziny od przygotowania preparatu, ponieważ zapewni to optymalne przymocowanie pętli chromosomów szczotki do lampbrusha do szkiełka.

7. Odwirowanie zawartości jądrowej

  1. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej na szkiełku nakrywkowym i dociśnij, aby usunąć nadmiar płynu z komory.
  2. Umieść około 1 mm3 wazeliny z każdej strony szkiełka nakrywkowego. Rozpuść wazelinę za pomocą metalowego pręta podgrzanego do około 70 - 80 oC, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe na leżącym pod spodem plastikowym kwadracie.
  3. Umieść szkiełka w nośnikach szkiełek do odwirowania, upewniając się, że przeciwległe nośniki są zrównoważone. Odwirować szkiełka o stężeniu około 4 800 x g przez 30 min - 1 godzinę w temperaturze 4 oC. Użyć funkcji powolnego startu na wirówce.

8. Naprawianie zawartości nuklearnej

  1. W przypadku większości kolejnych procedur należy utrwalić zawartość jądrową za pomocą paraformaldehydu.
  2. Umieść stojak na szkiełka w standardowym naczyniu do barwienia szkiełek mikroskopowych, a następnie umieść szkiełka pojedynczo w stojaku. Dodaj tyle utrwalacza, aby przykryć szkiełka (2 - 4% paraformaldehydu w OR2 lub PBS).
  3. Za pomocą kleszczy popchnij szkiełko nakrywkowe na boki, podnieś je i wyrzuć do odpowiedniego szklanego kosza. Pozostaw szkiełka w utrwalaczu na co najmniej 15 - 30 minut. W przypadku hybrydyzacji in situ i większości barwień przeciwciał dopuszczalne są dłuższe okresy utrwalenia (h lub d).
  4. Aby usunąć plastikowy kwadrat, umieszczaj szkiełka pojedynczo w lodowatym OR2 lub PBS w naczyniu do barwienia. Włóż ostrą żyletkę do krawędzi plastikowego kwadratu i podważ ją.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby plastik odpadł czysto, pozostawiając cały wosk parafinowy na szkiełku. Wosk służy użytecznemu celowi: ponieważ otacza mały centralny obszar, w którym zawartość jądrowa jest przymocowana do szkiełka, działa jak zapora, która umożliwia pracę z małymi objętościami (5 - 10 μl) odczynników do barwienia immunologicznego itp. Slajdy mogą być przechowywane w nieskończoność w zimnym OR2 lub PBS.

9. Barwienie immunologiczne LBC i organelli jądrowych

  1. Usuń stały preparat GV z magazynu w OR2 lub PBS. Zetrzyj nadmiar płynu i umieść na podporach w wilgotnej komorze. Wygodną komorą jest szalka Petriego o wymiarach 90 x 15 mm zawierająca okrąg o średnicy 90 mm z wilgotnej bibuły filtracyjnej.
    UWAGA: W tym momencie zawartość jądrowa jest mocno przymocowana do szkiełka w okrągłym obszarze o średnicy 5 mm wolnym od wosku parafinowego. Ponieważ wosk jest wodoodporny, można zmieniać roztwory, dodając i usuwając małe objętości płynu na krawędź centralnego obszaru za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Głównym środkiem ostrożności jest unikanie dotykania końcówką pipety obszaru wolnego od wosku.
  2. Barwienie immunologiczne przeprowadzić małymi objętościami (10 - 20 μl) odczynników. Ponieważ chromosomy i organelle jądrowe są bardzo małe i mają bezpośredni kontakt z dodanymi odczynnikami, protokoły barwienia mogą być krótkie. Czas barwienia przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi może wynosić nawet 1 godzinę lub mniej. Nie dodawaj detergentu do żadnego etapu, ponieważ może to spowodować uszkodzenie preparatu. W razie potrzeby zabarwić preparat DAPI (1 μg/ml) przez 10 - 20 minut, aby uwydatnić osie LBC.
  3. Zamontuj w glicerolu lub komercyjnym podłożu montażowym odpowiednim do immunofluorescencji. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza na etapie montażu, wykonaj następujące czynności.
    1. Wciągnąć 15 μl podłoża montażowego na końcówkę pipety o pojemności 20 μl. Usuń jak najwięcej płynu z obszaru bezpośrednio wokół rozprzestrzeniania się jądra, "odprowadzając" go kawałkiem bibuły filtracyjnej (wyciętej w kształcie bardzo cienkiego trójkąta z koła o średnicy 90 mm z bibuły filtracyjnej #1).
    2. Odpipetować większość podłoża mocującego na preparat, uważając, aby nie dotknąć obszaru rozprzestrzeniania się jądra. Umieść ostatnie około 1 μl podłoża montażowego na środku szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm (grubość #1.5). Odwróć szkiełko nakrywkowe na preparat i ostrożnie wrzuć na miejsce.
    3. W przypadku tymczasowych mocowań, do kilku dni, należy użyć 1 mg/ml fenylenodiaminy w 50% glicerolu. W przypadku mocowań stałych, zwłaszcza w badaniach nadrozdzielczych, należy użyć ośrodka o niskiej fluorescencji, który twardnieje do współczynnika załamania światła około 1,46.

10. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) LBC i organelli jądrowych

  1. Ponieważ protokoły FISH zwykle wymagają kroku w podwyższonej temperaturze, należy usunąć wosk parafinowy z preparatu. Ostrożnie zeskrobać żyletką, chociaż procedura jest żmudna i może doprowadzić do przypadkowego uszkodzenia preparatu. Przydatne jest oznaczenie obszaru preparatu z tyłu szkiełka za pomocą diamentowego ostrza.
    1. Alternatywnie rozpuść wosk parafinowy w ksylenie. Ustaw serię słoików Coplin lub naczyń barwiących zawierających: 30%, 50%, 70%, 95% i 100% etanolu; 3 pojemniki z ksylenem; 2 dodatkowe pojemniki ze 100% etanolem i jeden aceton.
    2. Umieść szkiełka w nośniku szkiełek i odwadnij je w serii etanolowej, pozostawiając szkiełka na 3 - 5 minut w każdym stężeniu (krótsze czasy w przypadku mieszania).
    3. Rozpuść wosk parafinowy, przepuszczając szkiełka przez 3 pojemniki z ksylenem, około 5 minut każdy, jeśli są poruszone. Usuń ksylen, przechodząc przez dwa 100% etanole, a na koniec usuń etanol acetonem. Weź szkiełka z acetonu i przechyl je do wyschnięcia.
  2. Przeprowadź hybrydyzację in situ przy użyciu dowolnego standardowego protokołu. 15,16

11. Izolacja GV pod olejem

  1. Za pomocą kleszczy jubilerskich pobierz oocyt z roztworu OR2, uwzględniając jak najmniej otaczającej tkanki. Umieść oocyt na małym kawałku bibuły filtracyjnej #1. Nadmiar roztworu OR2 przeniesie się na bibułę filtracyjną, pozostawiając oocyt prawie wolny od płynu. Podnieś "suchy" oocyt i umieść go pod powierzchnią lekkiego oleju mineralnego (oleju parafinowego) na małej szalce Petriego (35 x 10 mm).
    1. Drobną igłą wolframową lub jednym zębem kleszczy zrób mały otwór w oocycie w pobliżu ciemnego bieguna zwierzęcia. Podnieś oocyt jedną parą kleszczy (omijając końcówki) i delikatnie ściśnij. GV będzie wytłaczać się wraz z mniejszą lub większą ilością żółtka na swojej powierzchni (ryc. 3).
    2. Usuń jak najwięcej żółtka, delikatnie zamiatając GV bokiem kleszczy. W większości przypadków trudno będzie usunąć całe żółtko. Jednak w większości przypadków niewielka ilość żółtka nie stanowi problemu.
  2. Aby obserwować zawartość GV, spłaszcz GV w mniejszym lub większym stopniu.
    1. Wyjmij plastikowy kwadrat ze szkiełka studziennego i użyj pozostałego wosku parafinowego jako płytkiego pojemnika na olej parafinowy. 10 Pobrać GV wraz z olejem parafinowym do pipety o pojemności 20 μl i przenieść do środka obszaru parafiny. Dodać szkiełko nakrywkowe i obserwować zawartość częściowo spłaszczonej GV. Ta technika nie uszkadza LBC.
  3. Alternatywnie, spłaszcz GV do grubości około 10 μm w celu obserwacji organelli jądrowych.
    1. Odetnij ostatni 1 mm plastikowej końcówki pipety ostrą żyletką. Zassaj GV do końcówki wraz z dokładnie 5 μl oleju mineralnego. Wyciśnij GV i cały olej na środek szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm.
    2. Powoli opuść standardową szklaną prowadnicę o wymiarach 3 x 1 cal, aż dotknie kropli oleju. Kropla i szkiełko nakrywkowe zostaną podniesione przez kapilarność, a olej rozprzestrzeni się na krawędzie szkiełka nakrywkowego. Gdy kropla całkowicie się rozprzestrzeni, olej będzie miał grubość około 10 μm. LBC zostaną uszkodzone, a duże jąderka zostaną lekko ściśnięte, ale większość mniejszych organelli jądrowych będzie wyglądać mniej więcej tak, jak istnieją w nienaruszonym GV (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać gigantyczne chromosomy lampbrush, należy rozpocząć od izolacji oocytów z żaby lub salamandry. Rycina 1 przedstawia grupę dojrzałych oocytów w buforowanym roztworze soli fizjologicznej po usunięciu ich z jajnika żaby Xenopus. Takie oocyty pozostają w dobrym stanie przez kilka dni w temperaturze pokojowej. Następnie z oocytu usuwa się jądro (lub pęcherzyk zarodkowy) za pomocą pęsety jubilerskiej, albo w roztworze soli fizjologicznej (Rycina 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwsze obserwacje "żywych" LBC z ręcznie izolowanych GV żab i salamander zostały wykonane prawie 80 lat temu przez amerykańskiego biologa Williama Duryee, przed wprowadzeniem kontrastu fazowego i mikroskopii DIC, przed fluorescencyjnym barwieniem immunologicznym i przed FISH. Zalety LBC w badaniu szczegółów struktury chromosomów i transkrypcji na poziomie poszczególnych genów wymagały opracowania technik mocowania LBC do szkiełek szkiełkowych, utrwalania ich w realistyczny sposób oraz stosowania technik mole...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem R01 GM33397. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. J.G.G. jest profesorem genetyki rozwojowej w American Cancer Society.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Paraformaldehyd (klasa odczynnika, krystaliczny)Sigma-AldrichP6148-500GPomimo ostrzeżeń w wielu protokołach, stężony roztwór może być przechowywany w nieskończoność w RT
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonianSigma-AldrichA5040-100GCzasami określany jako MS-222
Ethicon RB-1 1/2 okrągły punkt stożkowy 3-0szwy VWR 95057-000
Paraplast (wosk parafinowy)Sigma-AldrichP3558-1KG
p-FenylenodiaminaSigma-AldrichP6001
ŻelatynaSklepKomercyjna żelatyna Knox działa dobrze
Antyblakowy uchwyt przeciwblakowy ProLong GoldThermoFisher ScientificP10144
Szkło pokrywowe Gold Seal  22 x 22 mm #1 1/2 (grubość 0,16 - 0,19 mm)Mikroskopia elektronowa Nauki63786-01Te szkiełka nakrywkowe mają zalecaną grubość do mikroskopii nadrozdzielczej
Kleszcze Dumonta #5Mikroskopia elektronowa Sciences72700-Dhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx
Olej parafinowy (lekki) EMD ChemicalsPX0047-1Do izolowania GV w
kleju olejowym in situ komorach PCR i hybrydyzacyjnych (25 &mikro; L)Komory ślizgowe BioRad Frame-Seal #SLF0201http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers
Izolatory silikonoweGrace-Biolabswybierz z linku do kataloguhttp://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html
Słoiki z kopliny i naczynia do barwieniaMikroskopia elektronowa Naukiwybierz z linkudo kataloguhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx
spożywczy

Bibliografia

  1. Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
  2. Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
  3. Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
  4. Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
  5. Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
  6. Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
  7. Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
  8. Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
  9. Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
  10. Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
  11. Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
  12. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
  13. Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
  14. Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
  15. Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
  16. Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
  17. Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
  18. Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
  19. Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja pęcherzyka zarodkowegousuwanie otoczki jądrowejmikroskopia fazokontrastowabarwienie immunofluorescencyjnehybrydyzacja in situmikroskopia konfokalnamikroskopia superrozdzielczapreparat rozciągniętego jądra oocytaprzygotowanie preparatów metodą wirowania na szkiełku
Izolacja chromosomów gigantycznej szczotki lampowej z żywych oocytów żab i salamander
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.