Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54113

⸱

20 czerwca 2016

 ,  , 
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Streszczenie

Identyfikacja alleli genów leżących u podstaw zmian ewolucyjnych jest niezbędna do zrozumienia, jak i dlaczego ewolucja zachodzi. W tym celu wiele ostatnich prac skupiło się na identyfikacji genów kandydujących do ewolucji cech u różnych gatunków. Jednak do niedawna walidacja funkcjonalna interesujących genów kandydujących była wyzwaniem. Niedawno opracowane narzędzia inżynierii genetycznej umożliwiają manipulowanie określonymi genami w wielu różnych organizmach. Zastosowanie tej technologii w organizmach istotnych z ewolucyjnego punktu widzenia pozwoli na bezprecedensowy wgląd w rolę genów kandydujących w ewolucji. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) to gatunek ryby o formach zarówno żyjących na powierzchni, jak i w jaskiniach. Wiele niezależnych linii form żyjących w jaskiniach wyewoluowało od przodków ryb powierzchniowych, które przenikają się ze sobą i z rybami powierzchniowymi, co pozwala na wyjaśnienie genetycznych podstaw cech jaskiniowych. A. mexicanus był używany w wielu badaniach ewolucyjnych, w tym w analizie sprzężeń w celu zidentyfikowania genów kandydujących odpowiedzialnych za szereg cech. Tak więc A. mexicanus jest idealnym systemem do zastosowania edycji genomu w celu zbadania roli genów kandydujących. Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN) do mutacji genów w powierzchni A. mexicanus. Edycja genomu za pomocą TALEN-ów u A. mexicanus została wykorzystana do generowania mutacji w genach pigmentacji. Technika ta może być również wykorzystana do oceny roli genów kandydujących dla wielu innych cech, które wyewoluowały w formach jaskiniowych A. mexicanus.

Wprowadzenie

Zrozumienie genetycznych podstaw ewolucji cech jest kluczowym celem badawczym biologów ewolucyjnych. Poczyniono znaczne postępy w identyfikacji loci leżących u podstaw ewolucji cech i wskazywaniu genów kandydujących w tych loci (na przykład1-3). Jednak funkcjonalne testowanie roli tych genów pozostaje wyzwaniem, ponieważ wiele organizmów wykorzystywanych do badania ewolucji cech nie jest obecnie genetycznie podatnych na manipulacje. Pojawienie się technologii edycji genomu znacznie zwiększyło możliwości manipulacji genetycznej szeroką gamą organizmów. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) zostały wykorzystane do wygenerowania ukierunkowanych mutacji w genach w wielu organizmach (na przykład4-11). Narzędzia te, zastosowane do systemu istotnego z ewolucyjnego punktu widzenia, mają potencjał, aby zrewolucjonizować sposób, w jaki biolodzy ewolucyjni badają genetyczne podstawy ewolucji.

Astyanax mexicanus to gatunek ryby, który występuje w dwóch formach: formy powierzchniowej zamieszkującej rzekę (ryba powierzchniowa) i wielu form żyjących w jaskiniach (ryby jaskiniowe). Ryba jaskiniowa A. mexicanus wyewoluowała z przodków ryb powierzchniowych (omówionych w12). Populacje ryb jaskiniowych wyewoluowały szereg cech, w tym utratę oczu, spadek lub utratę pigmentacji, zwiększoną liczbę kubków smakowych i neuromastów czaszkowych oraz zmiany w zachowaniu, takie jak utrata zachowania szkolnego, zwiększona agresja, zmiany w postawie żywieniowej i hiperfagia13-19. Ryby jaskiniowe i powierzchniowe są interferentne, a eksperymenty z mapowaniem genetycznym przeprowadzono w celu zidentyfikowania loci i genów kandydujących do cech jaskiniowych1,20-26. Niektóre geny kandydujące zostały przetestowane pod kątem funkcjonalnej roli w przyczynianiu się do cech jaskiniowych w hodowli komórkowej1,19, w organizmach modelowych innych gatunków21 lub przez nadekspresję27 lub przejściowy knockdown przy użyciu morpholinos28 u A. mexicanus. Jednak każda z tych metod ma ograniczenia. Zdolność do generowania zmutowanych alleli tych genów u A. mexicanus ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji w ewolucji ryb jaskiniowych. Tak więc A. mexicanus jest idealnym organizmem kandydującym do zastosowania technologii edycji genomu.

Tutaj przedstawiamy metodę edycji genomu u A. mexicanus za pomocą TALENs. Metoda ta może być wykorzystana do oceny ryb założycielskich z wstrzyknięciem mozaiki pod kątem fenotypów oraz do izolowania linii ryb ze stabilnymi mutacjami w genach będących przedmiotem zainteresowania29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Stanowym Iowa i Uniwersytecie Maryland.

1. Projekt TALEN

  1. Wprowadź żądaną sekwencję docelową do witryny projektu TALEN. (Na przykład: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen). Wprowadź wybrane długości tablicy odstępów/powtórzeń.
    1. Skopiuj sekwencję genomową do pola oznaczonego "Sekwencja".
    2. W zakładce "Podaj niestandardowe długości dystansu/RVD" wybierz długość dystansu i długość tablicy.
      Uwaga: Długości dystansów wynoszące 15 par zasad i powtarzające się długości tablic 15-17 działają dobrze i sprawiają, że montaż jest mniej skomplikowany.
  2. Wybierz parę TALEN. Pary TALEN zaprojektowane wokół unikalnego miejsca enzymu restrykcyjnego pozwalają na genotypowanie poprzez trawienie produktu PCR przez enzym restrykcyjny.
  3. Zaprojektuj startery do amplifikacji regionu genomowego otaczającego miejsce docelowe TALEN, korzystając ze strony internetowej, takiej jak Primer330-32. Podczas genotypowania za pomocą enzymu restrykcyjnego należy zaprojektować startery, aby wzmocnić region, który zawiera miejsce enzymu restrykcyjnego tylko raz. Zaleca się, aby region ten został amplifikowany i sekwencjonowany przed budową TALEN w celu zidentyfikowania wszelkich polimorfizmów obecnych w populacji laboratoryjnej A. mexicanus, które mają być wykorzystane do mikroiniekcji.

2. Zestaw TALEN (zmodyfikowany z protokołu TALEN Kit)33,34

Aby uzyskać dodatkowe informacje i rozwiązywanie problemów, zobacz protokół34.

  1. Przygotuj i zsekwencjonuj niezbędne plazmidy z zestawu TALEN zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Ustaw reakcje #1 dla reakcji A i B. Uwzględnij reszty o zmiennej powtarzalnej (RVD) 1-10, a wektor docelowy pFUS_A w reakcji A. Uwzględnij RVD 11-(N-1) i wektor docelowy pFUS_B(N-1) w reakcji B, gdzie N jest całkowitą liczbą RVD w TALEN.
    1. Do każdej reakcji dodać 1 μl każdego plazmidu zawierającego każdy RVD (100 ng/μl), wektor docelowy (100 ng/μl), 1 μl enzymu restrykcyjnego BsaI, 1 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (2 mg/ml), 1 μl ligazy, 2 μl 10x buforu ligazy i x μl wody o całkowitej objętości 20 μl. Na przykład patrz tabela 1.
      Uwaga: Można również stosować reakcje połówkowe.
    2. Umieść reakcje w termocyklerze i uruchom cykl: 10x (37 °C/5 min + 16 °C/10 min) + 50 °C/5 min + 80 °C/5 min.
  3. Inkubuj reakcje z nukleazą. Do każdej reakcji dodać 1 μl 25 mM ATP i 1 μl nukleazy. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Przekształć reakcje.
    1. Przekształć 2,5 μl każdej reakcji w 25 μl chemicznie kompetentnych komórek.
      Uwaga: Można użyć domowych kompetentnych komórek. Jednak komórki o niskiej kompetencji mogą powodować brak kolonii.
      1. Wymieszać 2,5 μl reakcji z 25 μl chemicznie kompetentnych komórek. Inkubować na lodzie przez pięć minut. Inkubować komórki przez 30 sekund w temperaturze 42 °C.
      2. Umieść probówki na lodzie na 2 minuty. Dodaj 125 μl bulionu Super Optimal z represją kataboliczną (SOC). Wstrząsać probówkami w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Umieścić 100 μl przekształconych komórek na płytkach LB ze spektynomycyną (50 μg/ml), X-galem i izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Uprawiać O/N w temperaturze 37 °C.
  5. Wybierz 2-3 białe kolonie do każdej reakcji i sprawdź za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów pCR8_F1 i pCR8_R1 (Tabela 2).
    1. Przygotuj wzorcową mieszankę odczynników. Na przykład patrz tabela 3.
    2. Wybierz kolonię i rozsmaruj ją na dnie probówki do PCR, a następnie umieść resztki kolonii w 2 ml LB ze spektynomycyną (50 μg/ml). Umieścić 15 μl mieszanki wzorcowej w probówce z kolonią.
    3. Uruchom następujący program PCR (Tabela 4)
    4. Sprawdź PCR (uruchom całą objętość) na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy. Prawidłowe klony będą miały opaskę o oczekiwanym rozmiarze, a także rozmaz i drabinę pasków. Przykład odpowiedniego rozmazu znajduje się w34,33.
    5. Hodować 2 ml kultur właściwych klonów w pożywce LB O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
  6. Miniprzygotuj plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Sekwencja do sprawdzania sekwencji TALEN za pomocą pCR8_F1 i pCR8_R1. Postępuj zgodnie z wcześniej opisanymi metodami35.
  8. Używając prawidłowych klonów zweryfikowanych przez sekwencjonowanie, skonfiguruj reakcję #2 (zestaw TALEN), która umieści RVD z wektorów A i B oraz końcowy RVD w wektorze docelowym.
    1. Przygotować mieszaninę do reakcji 2 (Tabela 5).
      Uwaga: Można stosować reakcje połówkowe.
    2. Umieść reakcje w termocyklerze i uruchom następujący program: 37 °C/10 min + 16 °C/15 min + 37 °C/15 min + 80 °C/5 min.
  9. Przekształć reakcje.
    1. Przekształć 2,5 μl każdej reakcji w 25 μl chemicznie kompetentnych komórek.
      1. Wymieszać 2,5 μl reakcji z 25 μl chemicznie kompetentnych komórek. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Szok termiczny ogniw przez 30 sekund w temperaturze 42 °C.
      2. Umieść probówki na lodzie. Dodać 125 μl SOC. Umieścić probówki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
    2. Umieścić 100 μl transformowanych komórek na płytkach LB z ampicyliną (100 μg/ml), X-gal i IPTG. Uprawiać O/N w temperaturze 37°C.
  10. Wybierz 1-3 białe kolonie do każdej reakcji i sprawdź za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów TAL_F1 i TAL_R2 (Tabela 2).
    1. Sporządzić roztwór mieszaniny głównej polimerazy, wody i podkładów, jak opisano w Tabeli 3. Wybierz kolonię i rozsmaruj ją na dnie probówki do PCR, a następnie umieść resztki kolonii w 2 ml LB z ampicyliną (100 μg/ml). Umieścić 15 μl roztworu w probówce z kolonią.
    2. Uruchom program PCR (Tabela 6).
    3. Sprawdź PCR na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy. Prawidłowe klony będą miały rozmazywanie i drabinę pasków. Przykład odpowiedniego rozmazu znajduje się w34,33.
    4. Hodować 2 ml kultur właściwych klonów w pożywce LB O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
  11. Miniprzygotuj plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta.
  12. Sekwencja do sprawdzenia sekwencji TALEN za pomocą TAL_F1 i TAL_R2 zgodnie z wcześniej opisanymi metodami35.

3. Transkrypcja mRNA TALEN-ów

  1. Roztrawić 4 μg zweryfikowanej sekwencyjnie matrycy za pomocą 2 μl workaI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Uruchom 2 μl plazmidu strawionego przez worekI na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy. Plazmidy, które są prawidłowo trawione, będą wyświetlać pojedyncze pasmo.
  3. Oczyść pozostały plazmid strawiony przez worek Izgodnie z protokołem zestawu do oczyszczania PCR. Przemyć dwukrotnie roztworem myjącym przed elucją. Eluować do 30 μl wody wolnej od nukleaz.
  4. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem produkcji mRNA T3.
    1. Ustawić półreakcje za pomocą 0,5 μg zlinearyzowanej matrycy (przygotowanej powyżej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Dodać 0,5 μl DNazy (dołączonej do zestawu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  5. Oczyść mRNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować do 30 μl wody wolnej od nukleaz.
  6. Przeprowadź 1,5% żel agarozowy za pomocą elektroforezy, aby sprawdzić mRNA.
    1. Oczyść aparat żelowy produktem eliminującym zanieczyszczenie RNazą i przygotuj 1,2% żel.
    2. Wymieszaj 1 μl mRNA + 4 μl wody wolnej od nukleaz + 5 μl barwnika ładującego glioksylem. Próbki inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut. Odwiruj krótko probówki i umieść je na lodzie przed uruchomieniem żelu.
  7. Sprawdzić stężenie przy użyciu metody ilościowego oznaczania stężeń kwasów nukleinowych i przechowywać RNA w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C. Wybrać taką wielkość porcji, aby RNA nie był zamrażany/rozmrażany więcej niż raz.
    Uwaga: Zazwyczaj uzyskuje się stężenia 500-1,000 ng/nl. RNA o niższym stężeniu może być stosowane, o ile zachowana jest integralność RNA (oceniana za pomocą opaski, a nie rozmazu na żelu).

4. Wstrzyknąć zarodki Astyanax mexicanus za pomocą mRNA TALEN

  1. Przygotować narzędzia do wstrzykiwań.
    1. Wlać płytki iniekcyjne, wlewając 1,2% agarozy do wody rybnej (woda kondycjonowana wodorowęglanem sodu i solą morską do pH 7,4 i przewodności 700 μS) na szalkę Petriego. Umieść formę (plastikowy element z wypustkami do robienia dołków na ikrę rybną) wewnątrz naczynia. Wyjmij formę, gdy agaroza stwardnieje i przechowuj w temperaturze 4 °C. Szczegółowe informacje na temat formy znajdują się w36.
    2. Wyciągnąć igły do wstrzykiwań za pomocą ściągacza igieł zgodnie z instrukcjami producenta.
      Uwaga: W przypadku wstrzyknięć ważna jest odpowiednia długość igły. Igły, które są zbyt długie, będą zbyt elastyczne do wstrzykiwań. Protokół wyciągania igieł będzie się różnić w zależności od sprzętu używanego do wyciągania igieł. Przykład odpowiedniej igły pokazano na rysunku 1. Do naszego sprzętu wyciągamy igły o długości 5-6 cm, które po złamaniu mają zewnętrzną średnicę na końcówce około 0,011 mm. Należy jednak skalibrować igły (krok 4.3.4) w celu określenia szerokości otworu. Przykładowy program do wyciągania igieł znajduje się w tabeli 7.
    3. Przygotuj szklane pipety do transferu zarodków, rozbijając pipetę tak, aby otwór był wystarczająco duży, aby mogło przez nie przejść jajo. Podpal złamany koniec, aż przestanie być ostry.
      Uwaga: Ważne jest, aby podczas pracy z jajami i zarodkami A. mexicanus używać szklanych pipet i szklanych misek, ponieważ są one lepkie i przylegają do plastiku.
  2. Zbieraj jaja etapu 1-komórkowego.
    1. Rasa A. mexicanus zgodnie ze standardowymi protokołami37.
      Uwaga: Na przykład, jeśli ryby są utrzymywane w cyklu ciemnym 14 światło: 10 i używają czasu Zeitgerbera (ZT) z ZT0 jako włączonymi światłami i ZT14 jako wyłączonymi światłami, nasze ryby powierzchniowe składają ikrę między ZT15 a ZT19. Dokładny czas tarła musi być określony dla każdego laboratorium z osobna.
    2. Wywołaj tarło poprzez przekarmienie ryb przez 3-4 dni przed kryciem i umieszczeniem ryb w słodkiej wodzie. Podnieś temperaturę o 2 °F. Uwaga: Nasza początkowa temperatura wody wynosi około 74 °F.
    3. Zbieraj ikrę ryb na powierzchni w ciemności, sprawdzając co 15 minut, aby uzyskać ikrę na etapie 1 komórki. Z jednej pary ryb powierzchniowych można uzyskać setki jaj.
    4. Zbieraj jaja w szklanych miskach, aby zapobiec przywieraniu do plastikowych powierzchni i sortuj w celu wyizolowania zarodków na etapie 1 komórki przed wstrzyknięciem, obserwując jaja pod mikroskopem i zbierając jaja, które są pojedynczą komórką. Jaja należy przechowywać w wodzie ze słodkiego systemu (woda w zbiorniku, w której trzymane są dorosłe ryby, która została poddana działaniu pH i przewodności).
  3. Wstrzyknąć mRNA TALEN.
    1. Wstrzyknąć różne ilości całkowitego mRNA (równe ilości każdego TALEN-a w parze), aby określić optymalne stężenie do wstrzyknięcia, ponieważ toksyczność i skuteczność różnią się w zależności od pary TALEN. Zacznij od wstrzyknięcia stężeń całkowitego mRNA, które wynoszą 400-800 pg. Rozcieńczyć i połączyć mRNA do pożądanych stężeń w celu wstrzyknięcia 1,5 nl.
    2. Załaduj rozcieńczone mRNA do tylnej części igły i przymocuj igłę do mikrowstrzykiwacza.
    3. Przełam igłę za pomocą kleszczy.
    4. Skalibrować igłę. Na przykład wysuń 10 razy i zbierz powstałą kroplę w mikrokapilarze. W przypadku 10 x 100 jednorazowych 1,0 μl, 32 mm mikrokapilary, kropla powinna wypełnić mikrokapilę do 0,5 mm dla 1,5 nl/1 wstrzyknięcie. W razie potrzeby dostosować czas i ciśnienie wtrysku.
    5. Włóż igłę do pojedynczej komórki i wstrzyknij mRNA. Wstrzyknij mRNA bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka.
    6. Zbierz wstrzyknięte zarodki do szklanych misek. Przechowywać zarodki w temperaturze 23-25 °C. Martwe zarodki (zarodki, które stają się mętne i mają nieregularny kształt) należy regularnie usuwać przez kilka pierwszych dni po wstrzyknięciu. Rekordowa liczba martwych i zdeformowanych zarodków z płytki kontrolnej (niewstrzykniętej) i wstrzykniętej.
      Uwaga: Zwiększone stężenie mRNA może prowadzić do zwiększonej toksyczności i deformacji/śmierci zarodków. W związku z tym toksyczność w stosunku do skuteczności musi być zrównoważona, aby określić najlepsze stężenie mRNA do wstrzyknięcia.

5. Założyciel fenotypu Ryba i ocena efektywności TALEN

  1. Składanie w ofierze embrionów zgodnie z instytucjonalnym protokołem zwierzęcym.
    Uwaga: Eutanazja embrionów odbywa się poprzez szybkie schładzanie na lodzie.
  2. Pobrać zarodki do probówek z paskami PCR o pojemności 0,8 μl za pomocą pipety transferowej.
    Uwaga: Genotypowanie można przeprowadzić na pojedynczych zarodkach lub pulach zarodków.
  3. Ekstrakcja DNA.
    1. Umieścić zarodki w 100 μl 50 mM wodorotlenku sodu (NaOH) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 30 minut, a następnie schłodzić do temperatury 4 °C.
    2. Dodać 1/10objętości (10 μl) 1 M Tris-HCl pH 8.
  4. Wykonaj PCR w regionie przy użyciu starterów zaprojektowanych w kroku 1.3 (patrz tabele 8 i 9 dla przykładowych protokołów). Dla pojedynczych zarodków 1 μl DNA jest wystarczający do reakcji PCR.
  5. Otrzymany produkt PCR należy strawić odpowiednim enzymem restrykcyjnym i przeprowadzić 1,5% żel agarozowy metodą elektroforezy.
    1. Na przykład w celu genotypowania locus albinizmu oczno-skórnego 2 (oca2) w wstrzykniętych zarodkach należy strawić produkt PCR za pomocą enzymu restrykcyjnego BsrI, dodając 0,5 μl BsrI bezpośrednio do 12,5 μl zakończonej reakcji PCR, inkubując w temperaturze 65 °C przez 2 godziny. Niestrawiony i strawiony produkt należy rozprowadzić na żelu. Pasma oporne na enzymy restrykcyjne (tj. prążki, które nie trawią) wskazują, że obecne są mutacje indukowane przez TALEN (ryc. 2).
  6. (Opcjonalnie) Oblicz procentowy współczynnik mutacji, określając procent nieoszlifowanego produktu, analizując obrazy żeli w Fidżi38 za pomocą narzędzia do analizy żeli w celu obliczenia wartości intensywności każdego pasma, jak opisano wcześniej29.
  7. Określ sekwencję zmutowanych alleli przez TA, klonowanie zmutowanych pasm odpornych na żel, opornych na enzymy restrykcyjne i sekwencjonowanie klonów.
    1. Żel oczyszcza oporne na enzymy restrykcyjne zmutowane pasmo zgodnie z instrukcjami producenta. TA sklonuj opaskę zgodnie z instrukcjami producenta. Zbieraj kolonie i hoduj w 1,5 ml LB O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
    2. Miniprep kultur zgodnie z instrukcjami producenta. Wyślij DNA do sekwencjonowania.
    3. Korzystając z programu, takiego jak ApE, wyrównaj sekwencje mutantów do sekwencji typu dzikiego.
      1. Skopiuj i wklej obie sekwencje do plików ApE. Wybierz narzędzie "Wyrównaj dwie sekwencje" z menu "Narzędzia".
      2. Określ dwie sekwencje DNA za pomocą menu rozwijanych.
        Uwaga: Może być konieczne użycie odwrotnego dopełnienia sklonowanej sekwencji w zależności od kierunku, w którym PCR przeszedł do wektora klonowania. Jeśli sekwencje nie są wyrównane, powtórz kroki, zaznaczając pole "Rev-Com" w polu "Align DNA".
  8. Oceń ryby założycielskie pod kątem fenotypów na odpowiednim etapie i przy użyciu odpowiednich metod dla oczekiwanego fenotypu29 (na przykład ryc. 3). Metody fenotypowania będą oparte na oczekiwanym fenotypie genu, na który ukierunkowany jest badacz za pomocą protokołu.

6. Ekran transmisji linii zarodkowej

Uwaga: A. mexicanus osiąga dojrzałość płciową w wieku 4-8 miesięcy.

  1. Krzyżuj dojrzałe płciowo ryby założycielskie z rybami typu dzikiego.
  2. Należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków lub dorosłych ryb przy użyciu metod opisanych w krokach 5.1-5.7 (ryc. 4). W przypadku dorosłych ryb po znieczuleniu można przyciąć kawałek ogona.
    1. Znieczulenie ryb poprzez zanurzenie ryb w roztworze trykainy (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego) w celu zmniejszenia stresu podczas obcinania płetw. Po obcięciu płetw pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie. Ryby szybko się regenerują; Obserwuj, aż wyzdrowieją (będą normalnie pływać).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Iniekcje par TALEN prowadzą do wiązania RVD ze specyficznymi nukleotydami DNA, a w konsekwencji do dimeryzacji domen FokI, co skutkuje pęknięciami obu nici DNA39, które mogą zostać naprawione poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). NHEJ często wprowadza błędy, które prowadzą do insercji lub delecji (indeli). Indele można zidentyfikować poprzez amplifikację regionu otaczającego miejsce docelowe TALEN i trawienie otrzymanego amplikonu enzymem restrykcyjnym, który...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w kierunku zrozumienia genetycznych podstaw ewolucji cech. Chociaż zidentyfikowano geny kandydujące leżące u podstaw ewolucji wielu cech, testowanie tych genów in vivo nadal było wyzwaniem ze względu na brak podatności genetycznej większości interesujących ewolucyjnie gatunków. W tym artykule przedstawiamy metodę edycji genomu u A. mexicanus, gatunku używanego do badania ewolucji zwierząt jaskiniowych. Badania mapowania genetycznego1,21,23 i podej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Departament Genetyki, Rozwoju i Biologii Komórki oraz Uniwersytet Stanowy Iowa oraz przez grant NIH EY024941 (WJ).Dr Jeffrey Essner skomentował manuskrypt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Thermocycler
Stacja
Aparat
Ściągacz
Nanodrop
Nazwa FirmaNumer katalogowyKomentarze
Supplies
Uwaga: O ile nam wiadomo, można korzystać z materiałów eksploatacyjnych różnych firm, chyba że zaznaczono
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulowany)FisherBP9724-500
Fisher BioReagents Podłoża mikrobiologiczne: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15 w 50% EtOHTeknova (zamówiony przez Fisher)50-843-314
Dichlorowodorek spektynomycyny, Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Super Ampicylina (1,000x roztwór)DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, gotowy do użyciaThermo Sci Fermentas Inc (zamówiony przez Fisher)FERR0941
IPTG, Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
Szalki PetriegoFisher08-757-13
BsaINew England Biolabs (zamówione przez Fisher)50-812-203Użyj BsaI, a nie BsaI-HF (zgodnie z opisem w protokole Golden Gate TALEN i TAL Effector Kit)
BSANew England Biolabswyposażone w enzymy
10x bufor ligazy T4Promega (zamówiony przez Fishera)PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega (zamówiony przez Fishera)PRM7123Można użyć innego Taq, ale reakcję należy odpowiednio dostosować
Zestaw do szybkiego podwiązywaniaNew England Biolabs (zamówiony przez Fishera)50-811-728Używamy Quick Ligase do wszystkich reakcji montażu TALEN
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E.coliInvitrogenC4040-06Można użyć innych kompetentnych chemicznie komórek lub kompetentnych komórek domowej roboty
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc (zamówione przez Fishera)FERER0451
Bezpieczne dla plazmidu epicentrum DNazy zależne od ATP(zamówione przez Fishera)NC9046399
Zestaw QIAprep Spin MiniprepQiagen27106Zestaw Qiagen powinien być używany do wstępnego przygotowania plazmidu (zgodnie z opisem w protokole Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit)
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104
GeneMate LE Szybkie rozpuszczenie AgaraoseBioExpressE-3119-125
Sac IPromega (zamówiony przez Fisher)PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Zestaw do transkrypcjiAmbionAM1348M
Rneasy MinElute Cleanup KitQiagen74204
NorthernMax-Gly Barwnik do ładowania próbek Ambion (zamówiony przez Fisher)AM8551
EliminaseDecon (zamówiony przez Fishera)04-355-32
Fisherbrand Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła sodowo-wapniowegoFisher13-678-6B
Standardowe szklane kapilaryWorld Precision Instruments1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Końcówki do mikroładowarek Eppendorf Femtotips do mikrowtryskiwacza FemtojetEppendorf (zamówione przez Fisher)E5242956003
Wodorotlenek soduFisherS318-500
Tris baseFisherBP152-1
iniekcyjnażelowyigiełinaczejrestrykcyjne

Bibliografia

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105(2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108(2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281(2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823(2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647(2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307(2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja genomu za pomoc TALENmutacja genowamikroiniekcja zarodk wprzygotowanie mRNAanaliza PCRtrawienie restrykcyjneanaliza fenotypowagen OCA2biologia ewolucyjna
Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.