Artykuł metodologiczny

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

DOI:

10.3791/54121

⸱

6 lipca 2016

 ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole demonstrujemy metodę syntezy nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) modyfikowanego 2'-alkinem poprzez automatyczną syntezę fazy stałej przy użyciu standardowej chemii fosforamidytu. Oligonukleotydy są znakowane postsyntetycznie za pomocą dwóch nowych fotostabilnych barwników cyjaninowych przy użyciu katalizowanej miedzią chemii klikającej. Opisano syntezę zarówno barwnika donorowego, jak i akceptorowego, która odbywa się w trzech kolejnych etapach. Z DNA jako otaczającą architekturą, te dwa barwniki ulegają transferowi energii, gdy są zbliżane do siebie przez hybrydyzację. Dlatego wyżarzanie dwóch jednoniciowych nici DNA jest wizualizowane przez zmianę koloru fluorescencji. Ta zmiana koloru jest charakterystyczna dla spektroskopii fluorescencyjnej, ale można ją również bezpośrednio zaobserwować za pomocą ręcznej lampy ultrafioletowej (UV). Koncepcja podwójnego fluorescencyjnego odczytu koloru sprawia, że te sondy oligonukleotydowe są doskonałymi narzędziami do obrazowania molekularnego, zwłaszcza gdy stosowane są opisane barwniki fotostabilne. W ten sposób zapobiega się fotowybielaniu sond obrazujących, a procesy biologiczne można obserwować w czasie rzeczywistym przez dłuższy czas.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie molekularne stanowi podstawową technikę do zrozumienia procesów biologicznych w żywych komórkach. 1-3 Rozwój sond fluorescencyjnych opartych na kwasach nukleinowych do takich zastosowań chemiczno-biologicznych stał się rozwijającą się dziedziną badań. Te sondy fluorescencyjne muszą spełniać kilka wymagań, aby stać się odpowiednimi narzędziami do obrazowania komórek. Po pierwsze, zastosowane barwniki powinny wykazywać fluorescencję o wysokiej wydajności kwantowej, duże przesunięcia Stokesa i, co najważniejsze, wysoką fotostabilność, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie in vivo. A po drugie, powinny pokazywać wiarygodny odczyt fluorescencji. Konwencjonalne systemy wygaszania chromoforu opierają się na odczycie pojedynczej barwy fluorescencji poprzez proste zmiany intensywności fluorescencji. 4 Takie podejście niesie ze sobą ryzyko wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych z powodu autofluorescencji składników wewnątrzkomórkowych lub niskiego stosunku sygnału do szumu z powodu niepożądanego wygaszania przez inne składniki. 4

Niedawno informowaliśmy o koncepcji "sygnalizacji świetlnej DNA", która pokazuje podwójne odczyty kolorów fluorescencji przy użyciu dwóch różnych chromoforów. 5-6 Koncepcja opiera się na transferze energii (ET) z barwnika donorowego do barwnika akceptorowego, który zmienia kolor fluorescencji (patrz rysunek 1). Pozwala to na bardziej wiarygodny odczyt, a tym samym zapewnia potężne narzędzie dla sond do obrazowania fluorescencyjnego. Znakowanie oligonukleotydów barwnikami fluorescencyjnymi można osiągnąć za pomocą dwóch różnych podejść. Barwniki mogą być włączane podczas chemicznej syntezy DNA w fazie stałej za pomocą odpowiednio zmodyfikowanych bloków budulcowych fosforoamidytu. 7 Metoda ta jest ograniczona do barwników, które są stabilne w standardowych warunkach fosforoamidytu i deprotekcji. Alternatywnie opracowano metodologie modyfikacji postsyntetycznej w chemii oligonukleotydów. Tutaj demonstrujemy syntezę jednej z naszych nowych par fotostabilnego transferu energii8,9 i postsyntetyczne znakowanie DNA za pomocą katalizowanej miedzią 1,3-cykloaddycji między azydkami a alkinami (CuAAC). 10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych stosowanych w tych syntezach jest toksycznych i rakotwórczych. Należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, które są zwykle wymagane w laboratoriach chemii organicznej, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych i rękawic.

1. Synteza barwników

Uwaga: Oba barwniki mogą być syntetyzowane przez te same typy reakcji. Rysunek 2 przedstawia przegląd tych reakcji.

  1. Synteza jodku 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-1H-indol-3-ylo)winylo)pirydyno-1-iodku (barwnik 1)
    1. Synteza jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopirydyno-1-iowego jodku (rysunek 2A, etap a)
      1. Rozpuścić 466 mg 4-pikoliny i 5,91 g 1,3-dijodopropanu w 10 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową i szczelnie zamknąć pokrywą przegrody.
      2. Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą parownika obrotowego.
      4. Dodać 20 ml octanu etylu do pozostałego oleju i poddać mieszaninę działaniu w łaźni ultradźwiękowej o mocy 120 W przez 3 minuty.
      5. Zebrać powstały osad przez filtrację i przemyć pięciokrotnie octanem etylu. Wysuszyć stały produkt w próżni O/N.
    2. Synteza 1-(3-azydopropylo)-4-metylopirydyno-1-ium (rysunek 2A, krok b)
      1. Rozpuścić 900 mg jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopirydyno-1-iowego w 12 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową, dodać 376 mg azydku sodu i szczelnie zamknąć pokrywą przegrody.
      2. Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
      4. Dodać 15 ml dichlorometanu do pozostałości.
      5. Odfiltrować i wyrzucić powstały osad.
      6. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać produkt w postaci brązowego oleju.
    3. Synteza 1-metylo-1H-indolo-3-karbaldehydu (Rysunek 2A, krok c)
      1. W atmosferze gazu obojętnego (argonu) rozpuścić 1,45 g indolo-3-karbaldehydu, 1,52 g węglanu potasu i 2,70 g węglanu dimetylu w 10 ml absolutnego dimetyloformamidu w 50 ml kolby okrągłodennej wyposażonej w chłodnicę zwrotną.
      2. Mieszać mieszaninę w temperaturze 130 °C przez 19 godzin.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury mokrej, a następnie wlać mieszaninę na lód.
      4. Usunąć warstwę wodną trzykrotnie za pomocą 150 ml octanu etylu.
      5. Połączyć warstwy organiczne, umyć je wodą, wysuszyć na siarczanie sodu i usunąć rozpuszczalnik w temperaturze 50 °C pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
    4. Sprzężenie z jodkiem 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-1H-indol-3-ylo)winylo)pirydyno-1-iodowego (barwnik 1) (Rysunek 2A, krok d)
      1. Pracuj w argonie i bez wilgoci. Rozpuścić 90 mg 1-(3-azydopropylo)-4-metylopirydyno-1-ium i 48 mg 1-metylo-1H-indolo-3-karbaldehydu w 4 ml etanolu w kolbie okrągłodennej o pojemności 20 ml wyposażonej w chłodnicę zwrotną.
      2. Dodać 0,07 ml piperydyny i podgrzewać do temperatury 80 °C przez 4 godziny.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT.
      4. Zebrać powstały osad przez filtrację i przemyć trzykrotnie eterem dietylowym.
      5. Dodać eter dietylowy do supernatantu i zebrać powstały osad przez filtrację. Umyć trzy razy eterem dietylowym.
      6. Połącz osady.
  2. Synteza jodku 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-2-fenylo-1H-indol-3-ylo)winylo)chinolino-1-iowego jodku (barwnik 2)
    1. Synteza jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopilinolin-1-iowego (Rysunek 2B, krok a)
      1. Rozpuścić 715 mg 4-metylochinoliny i 5,91 g 1,3-dijodopropanu w 10 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową i szczelnie zamknąć pokrywą z przegrodą.
      2. Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
      4. Dodać 20 ml octanu etylu do pozostałego oleju i poddać mieszaninę działaniu w łaźni ultradźwiękowej o mocy 120 W przez 3 minuty.
      5. Zebrać powstały osad przez filtrację i przemyć pięciokrotnie octanem etylu. Wysuszyć stały produkt w próżni O/N.
    2. Synteza 1-(3-azydopropylo)-4-metylopinolino-1-ium (Rysunek 2B, krok b)
      1. Rozpuścić 900 mg jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopilinolin-1-ium w 12 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową, dodać 333 mg azydku sodu i szczelnie zamknąć pokrywą przegrody.
      2. Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
      4. Dodać 15 ml dichlorometanu do pozostałości.
      5. Odfiltrować i wyrzucić powstały osad.
      6. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać produkt w postaci brązowego oleju.
    3. Synteza 1-metylo-2-fenylo-1H-indolo-3-karbaldehydu (rysunek 2B, krok c)
      1. W atmosferze gazu obojętnego (argonu) rozpuścić 1,45 g 2-fenylo-1H-indolo-3-karbaldehydu, 0,996 g węglanu potasu i 1,77 g węglanu dimetylu w 10 ml absolutnego dimetyloformamidu w 50 ml kolbie okrągłodennej wyposażonej w chłodnicę zwrotną.
      2. Mieszać mieszaninę w temperaturze 130 °C przez 19 godzin.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury mokrej, a następnie wlać mieszaninę na lód.
      4. Usunąć warstwę wodną trzykrotnie za pomocą 150 ml octanu etylu.
      5. Połączyć warstwy organiczne, umyć je wodą, wysuszyć na siarczanie sodu i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
    4. Sprzężenie z jodkiem 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-2-phe nyl-1H-indol-3-ylo)winylo)chinolino-1-iodowego (Rysunek 2B, krok d)
      1. Pracuj w argonie i bez wilgoci. Rozpuścić 90 mg 1-(3-azydopropylo)-4-metylochinolino-1-ium i 59,7 mg 1-metylo-2-fenylo-1H-indolo-3-karbaldehydu w 4 ml etanolu w kolbie okrągłodennej o pojemności 20 ml wyposażonej w chłodnicę zwrotną.
      2. Dodać 0,06 ml piperydyny i podgrzewać do temperatury 80 °C przez 4 godziny.
      3. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT.
      4. Zebrać powstały osad przez filtrację i trzykrotnie przemyć eterem dietylowym.
      5. Dodać eter dietylowy do supernatantu i zebrać powstały osad przez filtrację. Umyć trzy razy eterem dietylowym.
      6. Połącz osady.

2. Synteza nici DNA

Uwaga: Synteza nici DNA odbywa się metodą fosforamidytu na fazie stałej, jak to opisał M. Caruthers11 na syntezatorze DNA. Działanie syntezatora jest testowane przed zabiegiem syntezy, a odczynniki są w razie potrzeby odnawiane.

  1. Wstępne ustalenia
    1. Rozpuścić dostępny w handlu 2'-O-propargyl-deoksyurydynofosforamidyt (cU) w 1,2 ml rozcieńczalnika amidytowego (ekstra suchy acetonitryl). Przenieść roztwór z fiolki do fiolki syntezatora i wkręcić do syntezatora.
    2. Wykonaj "próbę szczelności" (zgodnie z instrukcjami producenta), aby upewnić się, że nie ma wycieku argonu. Jeśli "próba szczelności" nie powiedzie się, należy mocniej przykręcić fiolkę.
    3. Zalać roztwór cU, napełniając rurkę łączącą się z komorą syntezy w fazie stałej.
    4. Umyj wszystkie linie acetonitrylem.
  2. Synteza nici DNA
    1. Użyj podłączonego komputera, aby wprowadzić sekwencję DNA i metodę sprzężenia, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole producenta. Krok sprzężenia bloku konstrukcyjnego cU trwa 168 sekund przy 7 impulsach (każdy impuls ma 16 μl) w porównaniu do 40 sekund przy 7 impulsach dla konwencjonalnego fosforoamidytu jako elementów budulcowych.
    2. Zamontuj kolumnę zawierającą CPG (szkło o kontrolowanych porach) jako fazę stałą, która jest modyfikowana 1 μmolem pierwszej zasady (syntezę DNA przeprowadza się od 3' do 5') do syntezatora.
    3. Rozpocznij syntezę na syntezatorze DNA11.
  3. Badanie zsyntetyzowanych nici DNA
    1. Wysuszyć kolumny ze zsyntetyzowanymi niciami DNA w próżni O/N.
    2. Użyj szczypiec, aby otworzyć kolumnę i uwolnić CPG do fiolki reakcyjnej. Dodać 700 μl stężonego wodnego roztworu amoniaku, aby zdeprotect oligonukleotyd i uwolnić nić DNA z CPG.
    3. Zamknąć fiolkę i nałożyć pokrywkę zabezpieczającą na naczynie reakcyjne, aby zapobiec jego pęknięciu, a następnie podgrzewać do temperatury 50 °C przez 18 godzin.
    4. Usunąć amoniak przez odwirowanie pod zmniejszonym ciśnieniem (100 mbar) w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
    5. Rozpocznij filtrację od CPG: Naczynie wirówkowe o sile 11 000 x g przez 3 min. Weź supernatant i przenieś go do urządzenia odśrodkowego o wielkości porów 0,45 μm. Wirować przy 1.000 x g przez 4 min.
    6. W międzyczasie dodać 300 μl podwójnie destylowanej wody do CPG, wirować przez 20 sekund i wirować przy 11 000 x g przez 3 min. Przenieść supernatant do urządzenia odśrodkowego i wirować przy 1 000 x g przez 4 min. Powtórzyć tę procedurę mycia dwukrotnie.
    7. Usunąć wodę z połączonych roztworów wodnych przez odwirowanie w temperaturze 0,1 mbar i temperaturze O/N w temperaturze 25 °C.

3. Procedura "Klikania"

  1. Do liofilizowanej próbki DNA modyfikowanego alkinem dodać 50 μl podwójnie destylowanej wody, 25 μl roztworu askorbinianu sodu (0,4 M w wodzie), 34 μl tris-[(1-benzylo-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminy (0,1 M w DMSO/tBuOH 3:1), 114 μl azydku (0,01 M w DMSO/tBuOH 3:1) i 17 μl roztworu tetrakis(acetonitrylu) miedzi(I)heksafluorofosforanu (0,1 M w DMSO/tBuOH 3:1).
  2. Inkubować próbkę w temperaturze 60 °C przez 1,5 godziny.
  3. Chłodny do RT.
  4. Dodać 150 μl Na2EDTA (0,05 M w wodzie) i 450 μl octanu sodu (0,3 M w wodzie) do próbki DNA i przenieść do probówki o pojemności 10 ml.
  5. Dodać 10 ml etanolu (100%) i przechowywać w temperaturze -32 °C przez 16 godzin.
  6. Odwirować naczynie przez 15 minut przy 1 000 x g i usunąć supernatant.
  7. Przemyć osad DNA 2 ml zimnego etanolu (80%).
  8. Suchy pellet pod zmniejszonym ciśnieniem.

4. Oczyszczanie HPLC

Uwaga: Przed rozdzieleniem nici DNA upewnij się, że HPLC działa prawidłowo, dostępna jest wystarczająca ilość rozpuszczalnika i kolumna jest czysta. Przepłukać kolumnę początkowym stężeniem buforu/acetonitrylu.

  1. Rozpuścić surowy osad DNA w 250 μl podwójnie destylowanej wody i przenieść do fiolki HPLC.
  2. Rozpocznij 45-minutowy przebieg HPLC od gradientu od 0% acetonitrylu do 15% acetonitrylu dla barwnika 1 i gradientu od 0% acetonitrylu do 17% acetonitrylu dla barwnika 2. Monitoruj przebieg, sprawdzając 260 nm (absorpcja DNA) i 459 nm (barwnik 1) lub 542 nm (barwnik 2). Zbierz te frakcje, które wykazują absorpcję w obu kanałach długości fali.
  3. Sprawdź zebrane frakcje pod kątem właściwej masy za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą desorpcją i jonizacją (MALDI) przy użyciu matrycy składającej się z kwasu 3-hydroksypikolinowego (3HPA) i wodorocytrynianu diamonu.
    1. Przygotować matrycę, mieszając 900 μl nasyconego roztworu 3-HPA w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 ze 100 μl roztworu wodorocytrynianu dwuamonu (100 g/l) w wodzie.
    2. Odpipetować 1-2 μl sondy DNA na tarczy i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    3. Dodać 0,2 μl matrycy 3-HPA/wodorocytrynianu diamonu do próbki i mieszać aż do jej krystalizacji.
    4. Wykonaj spektrometrię mas MALDI.
    5. Połącz te frakcje HPLC, które wykazują odpowiednią masę.

5. Oznaczanie stężenia

Uwaga: Stężenie określa się poprzez pomiar absorpcji przy 260 nm za pomocą spektrofotometru UV/Vis, na podstawie współczynników ekstynkcji (ε260) zasad DNA i barwnika.

  1. Rozpuść DNA w 100 - 200 μl podwójnie destylowanej wody.
  2. Nanieść 1 μl roztworu DNA na spektrofotometr UV/Vis.
  3. Zmierzyć absorpcję przy 260 nm. Powtórz trzy razy.
  4. Weź średnią wartość, aby obliczyć stężenie roztworu. Do obliczenia współczynników ekstynkcji należy użyćε 260 nm z czterech naturalnych zasad12 i ε260 nm zakupionego bloku budulcowego cU (uznawanego za naturalną urydynę)12, aby uzyskać ε260 nm całej nici DNA. Dla barwnika 1 użyj ε260 nm = 10 200 L * mol-1 * cm-1 i dla barwnika 2 użyj ε260 nm = 13 100 L * mol-1 * cm-1. Obliczyć stężenie roztworu zgodnie z prawem Lamberta-Beersa na podstawie współczynników ekstynkcji i zmierzonych absorbancji. 13

6. Przygotowanie próbki i spektroskopia

  1. Przygotowanie próbek jednoniciowych
    1. Przygotować oddzielnie 1 ml 2,5 μM roztworów każdego ze zmodyfikowanych DNA1 i DNA2 w 200 mM NaCl, 50 mM NaPi buforze, pH = 7.
  2. Przygotowanie próbek dwuniciowych
    1. Przygotować 1 ml roztworu zawierającego 2,5 μM DNA1 i 2,5 μM DNA2 w 200 mM NaCl, 50 mM NaPi buforze, pH = 7 w naczyniu reakcyjnym.
    2. Zabezpiecz pokrywę nasadką zabezpieczającą i podgrzewaj do 90 °C przez 10 minut. Następnie wyłącz ogrzewanie i pozostaw do ostygnięcia do RT O/N.
  3. Spektroskopia absorpcyjna
    Uwaga: W celu określenia długości fali wzbudzenia dla spektroskopii fluorescencyjnej rejestrowane są widma absorpcyjne.
    1. Pomiary pojedynczej nici
      1. Zapisać ślepą próbę zawierającą tylko 200 mM NaCl, 50 mM NaPi bufor, pH = 7.
      2. Przenieś przygotowany roztwór DNA1 do kuwety ze szkła kwarcowego o średnicy 1 cm i zapisz absorpcję. Skoryguj pomiar względem pustych danych. Określ maksymalną wartość wchłaniania barwnika.
      3. Powtórz dla DNA2.
  4. Spektroskopia fluorescencyjna
    1. Pomiary pojedynczej nici
      1. Zapisać ślepą próbę zawierającą tylko 200 mM NaCl, 50 mM NaPi bufor, pH = 7; stosując długość fali wzbudzenia barwnika 1.
      2. Przenieś roztwór DNA1 do 1-centymetrowej kuwety ze szkła kwarcowego.
      3. Zapisz widmo fluorescencji.
    2. Pomiar podwójnej nici
      1. Przenieś roztwór dwupasmowy do kuwety ze szkła kwarcowego.
      2. Zapisz widmo fluorescencji przy użyciu długości fali wzbudzenia barwnika 1.
  5. Eksperymenty z wizualizacją
    Uwaga: Należy nosić odpowiednią ochronę oczu, aby uniknąć uszkodzenia oczu przez promieniowanie UV!
    1. Aby lepiej zrozumieć, co pokazują zarejestrowane widma, należy naświetlić kuwety ręcznymi lampami UV (ryc. 5). Obserwuj zmianę koloru fluorescencji z jednoniciowego na dwuniciowy DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Widma absorpcyjne i fluorescencyjne jedno- i dwuniciowego DNA są rejestrowane, jak pokazano na rysunku 4.

Zarejestrowane widma absorpcyjne (Rysunek 4 po prawej) pokazują maksima absorpcji λmax przy 465 nm dla jednoniciowego DNA1 (barwnik 1) i 546 nm dla jednoniciowego DNA2 (barwnik 2). Wyżarzony DNA1_2 (barwnik 1 i barwnik 2) wykazuje maksima zarówno przy 469 nm, jak i 567 nm. Oba mak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia pełną procedurę znakowania DNA po syntezie za pomocą CuAAC za pomocą barwników fluorescencyjnych modyfikowanych azydkiem. Obejmuje to syntezę barwników i DNA modyfikowanego alkinami, a także procedurę znakowania.

Synteza barwników przebiega w czterech etapach. Wszystkie produkty można uzyskać przez dość proste wytrącanie ze względu na ich ładunek dodatni i nie jest potrzebna czasochłonna chromatografia kolumnowa. Wprowadzenie funkcji azydku przed centralnymi etapami sp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania finansowe ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386/17-1), Research Training Group GRK 2039 (finansowanej przez DFG) oraz KIT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
synteza
4-PicolineSigma Aldrich239615
1,3-DiiodopropanSigma Aldrich238414
AcetonitrylFisher Scientific10660131klasy HPLC
Octan etyluFisher Scientific10456870techniczny
klasy azydeksoduSigma Aldrich71290p.a. grade
DichloromethaneFisher Scientific10626642techniczny klasy
indolo-3-karboksyaldehyd; 98%ABCRAB112969
Węglan potasu, 99+%Acros424081000
węglan dimetyluSigma Aldrich517127
N,N-dimetyloformamid, 99,8%, Extra Dry over Molecular ScreenAcros348435000
Siarczan soduBernd Kraft12623.46
Etanol, 99,5%Acros397690010
Piperydyna, 99%Acros147181000
DietylletherFisher Scientific10407830techniczny
2-fenyloindolo-3-karboksyaldehyd; 97%ABCRAB125050
4-metylochinolinaABCRAB117222
synteza DNA
Expedite 8909 Syntezator kwasów nukleinowychApplied Biosystems -
DMT-dA(bz) FosforoamidynSigma AldrichA111081
DMT-dT FosforoamidynSigma Aldrich
DMT-dG(dmf) FosforoamidSigma AldrichG11508
DMT-dC(bz) FosforoamidynSigma AldrichC11108
Rozcieńczalnik amidytowy do syntezy DNASigma AldrichL010010
Ultraczysty acetonitryl do syntezy DNASigma AldrichL010400
Cap ASigma AldrichL840000
Cap BSigma AldrichL850000
CPG dT Kolumna 1.0  &mikro; moleProligo OdczynnikiT461010
CPG dA(bz) Kolumna 1.0  &mikro; moleProligo OdczynnikiA461010
CPG dG(ib) Kolumna 1.0  &mikro; moleProligo OdczynnikiG461010
CPG dC(bz) Kolumna 1.0  &mikro; moleProligo OdczynnikiC461010
amoniaku (roztwór wodny) Fluka Analityczne318612
urządzenia odśrodkowe o średnicy 0,45  &mikro; mPallODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazol (Aktywator)Sigma Aldrich75666
2'-O-propargyl deoksyurydynofosforamidytGeny chemiczneANP-7754
workup
vacuum koncentratorChrist
clicking procedure
Tetrakis(acetonitryl)heksafluorofosforan miedzi(I)Sigma Aldrich346276
Octan soduSigma AldrichS2889
(+)-L-askorbinian soduSigma AldrichA7631
Sól disodowa EDTASigma AldrichE5134
TBTA-ligand - -zsyntetyzowane zgodnie z procedurą literaturową1
HPLC
HPLC-systemShimadzu
MALDI-Biflex-IV spektrometrBruker Daltonics
LC-318 C18 kolumnaSupelcosil przez Sigma Aldrich58368
oznaczanie stężenia
ND 1000 Spektrofotometrnanodrop
przygotowanie próbki i spektroskopia
Cary 100 BioVarian
Fluoromax-3 fluorymetrJobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.
T111081

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza w fazie sta ejchemia klikprzeniesienie energiispektroskopia fluorescencyjnaznakowanie oligonukleotyd whybrydyzacja DNAobrazowanie molekularnespektroskopia absorpcyjna

Powiązane artykuły